при реализации трансмембранных процессов с участием интегральных белков существенную роль играет локальная липидная регуляция, т.е. изменение состояния пограничных липидов [76]. Многочисленные эксперименты, выполненные на Na+,K+-АТФазе, Са2+-АТФазе, Н+-АТФазе, цитохромоксидазе и других интегральных мембранных ферментах как в составе нативных мембран, так и в реконструированных системах подтвердили наличие "иммобилизованных фосфолипидных молекул" вокруг этих мембранных ферментов, контролирующих их каталитическую и транспортную активности.
Молекулярно-динамическое моделирование показало, что энергия взаимодействия отдельной липидной молекулы с мембранным белком не постоянна и меняется во времени. Она представляет сумму многих слабых ван-дер-ваальсовских и электростатических взаимодействий. При этом каждая липидная молекула не "заморожена" в единственной долго живущей конформации на поверхности белка, а остается в окружающей его оболочке лишь в течение очень короткого периода времени, обычно составляющего при 30°С (1-2) х 10-7с. Такой быстрый обмен ФЛ между аннулярным кольцом и массой бислоя может существенно усреднять влияние белка на структуру ФЛ. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что слабые взаимосвязи, которые возникают при взаимодействии интегральных белков с липидами, могут вызывать как "структурирование", так и нарушение "упаковки" близлежащих к белку липидов [71]. Так, вокруг молекулы цитохромоксидазы
обнаружено существование нескольких слоев фосфолипидных молекул с декрементом "затухания" нарушенной упаковки их жирнокислотных цепей в результате ван-дер-ваальсовских взаимодействий. Считается, что кольцо аннулярного липида "сжимается" при повышении температуры, а его толщина
максимальна при Тô.ï.
Установлено, что некоторые фосфолипидные молекулы настолько плотно связаны с белком, что играют роль скорее кофакторов, чем просто "растворителя" или окружения белковой глобулы. Так, для Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума обнаружили связывание некоторых участков трансмембранного домена фермента с фосфолипидами и холестерином в глубине щелей между трансмембранными α-спиралями [77]. Для обозначения таких липидов ввели специальный термин "неаннулярные липиды" (не путать с основной массой обычных липидов бислоя).
Эти молекулы липидов, сохраняющиеся в образце после
51
обработки детергентами, можно обнаружить при высокоразрешающем структурном исследовании мембранных белков. Их плотное присоединение к белкам обеспечивается, главным образом, (1) иммобилизацией полярных "головных" групп на белковой поверхности и/или (2) гидрофобными взаимодействиями жирнокислотных цепей липидов с определенными гидрофобными участками на поверхности белка.
В отличие от аннулярных ФЛ, обмен липидов между неаннулярными молекулами и массой липидного бислоя происходит, по-видимому, гораздо медленней, а связывание белков в этих местах более специфично.
Как уже отмечалось, липид-белковые взаимодействия в целом являются существенными для проявления и регуляции активностей мембранных белков, несмотря на то, что в каждом конкретном случае потребность этих белков в мембранных ФЛ может варьировать как в количественном, так и в качественном отношениях [78].
Многочисленные исследования, связанные с выделением липидзависимых белков, их делипидированием, последующей реконструкцией на искусственных фосфолипидных мембранах с полным или частичным восстановлением активностей и т.д., позволили сделать ряд важных заключений о роли мембранных липидов в функционировании белков:
-липиды являются эффективными аллостерическими активаторами некоторых мембранных ферментов;
-часть мембранных липидов, находящихся в непосредственной
близости к молекулам белка, образуют вокруг их гидрофобного домена "липидное кольцо" или "аннулюс";
-мембранные липиды образуют вокруг мембраносвязанных белков обширную гидрофобную область, подобную мицелле, которая создает наиболее благоприятные условия, например, для фермент-субстратного взаимодействия;
-мембранные липиды образуют бислойные ассоциаты, имеющие необходимую кривизну и ориентацию; некоторые мембранные белки асимметрично распределяются в них и принимают такую ориентацию, которая необходима для проявления их специфической активности.
Благодаря названным модуляторным эффектам липидов на мембранные белки, обеспечивается стабилизация их функционально-активной конформации, необходимый уровень структурной организации (например, образование олигомерных субъединичных комплексов), эффективное взаимодействие с неполярными соединениями и др. Имеется множество примеров
52
влияния ФЛ на активность конкретных белков. Например, связывание с ФЛ стабилизирует конформацию митохондриальной АТФазы [79], влияет на активность легочного сурфактантного белка и его доменов [80], меняет вторичную структуру пептида пенетритина, действующего как переносчик гидрофильных молекул [81] и т. д.
Одним из проявлений регуляторного воздействия мембранных липидов на активность мембранных белков является "вязкотропный эффект": зависимость функциональной активности этих белков от степени "разжижжености" ацильных цепей ФЛ. Такая "вязкотропная" регуляция довольно четко показана в случае с транспортными АТФазами, для которых конформационная подвижность молекул является важным моментом, необходимым для функционирования [82]. Жидкостность мембран влияет на многие мембранные процессы, в том числе и эндоцитоз. Это было показано, в частности, на клетках дрожжей, в которых изменения эндоцитоза наблюдали при модификации структуры, включая изменение концентрации стерина в плазматической мембране. Полагают, что в основе локальной "вязкотропной" регуляции активности мембранных белков лежит фазовое состояние "аннулярных" липидов. Считается, что термодинамическое равновесие в системе "аннулярные липиды/общий бислой" контролирует работу олигомерных мембранных белков, определяя их диспергированное состояние в мембране [83].
Некоторые белки для обеспечения нужного им фолдинга, степени погружения в мембрану или функциональной активности
требуют взаимодействия со специфичными ФЛ [84]. Так, для фолдинга пермеазы лактозы во внутренней мембране Å. coli существенным является взаимодействие с ФЭ. В отсутствии этого ФЛ в мембрану погружается нужным образом только С- терминальная часть белка, а N-терминальная - не погружается, что значительно снижает транспорт лактозы. Отсюда было высказано предположение, что ФЭ выполняет функцию "липошаперона", т.е. липидной матрицы, обеспечивающей нужную конформацию белка. Молекулярная основа специфического действия индивидуальных ФЛ на конформацию мембранных белков еще полностью не ясна.
Показана специфическая потребность в ФС активируемой Са2+ протеинкиназы [85], волчаночного антикоагулянта IgG [86], активатора-ингибитора плазминогена [87] и факторов свертывания крови - VIII, X [88]. В ряде случаев подобный эффект наблюдается в отношении ФЭ и/или ФИ. Так, из всех ФЛ сои ФИ вызывал максимальное повышение активности β-субъединицы
53
инсулинового рецептора плаценты при аутофосфорилировании [89], а анионные ФЛ или смесь КЛ с ФЭ способны активировать делипидированную малатдегидрогеназу микобактерий [90].
2.5. Латеральная гетерогенность биомембран.
Долгое время считалось, что мембранные липиды являются двумерной растворяющей фазой для мембранных белков. Однако в последнее десятилетие получены данные физико-химических исследований мембранных липидов, которые противоречат этому утверждению [91]. Например, первоначально предполагалось, что ХС в мембране, состоящей из нескольких видов ФЛ, действует как гомогенизирующий агент мембранной матрицы. Учитывая, что каждый из этих ФЛ имеет свою, отличную от других Тô.ï., считали, что именно холестерин благоприятствует смешиванию мембранных липидов при физиологической температуре, снижая до минимума различия между жидким и гелевым состояниями глицерофосфолипидов. Но экспериментальные данные свидетельствуют о неравномерном распределении ХС внутри мембран, что приводит к образованию доменов, обогащенных и обедненных холестерином [92].
В настоящее время большое внимание уделяется многими исследователями латеральной (т.е. относящейся к плоскости мембраны) гетерогенности белков и липидов. Гетерогенность липидов в плоскости мембраны является следствием образования различных ассоциаций липидных молекул, группирующихся согласно их физико-химическому соответствию. При этом в
отдельных слоях мембраны (главным образом, в наружном) возникают латеральные липидные домены, называемые "рафтами" (от английского слова "raft" - плот). Это участки плотно упакованных молекул с относительно высокой молекулярноупорядоченной фазой, "плавающие" в жидко-неупорядоченной фазе основного липидного матрикса.
Организацию липидов в мембране можно объяснить, основываясь на свойствах молекулярной структуры входящих в ее состав индивидуальных липидов, в частности, их способности образовывать более плотную, конденсированную, или, наоборот, жидкую, относительно разрыхленную структуру [91 - 95].
Известно, что сфинголипиды имеют гораздо более высокую температуру плавления (Тï), чем глицерофосфолипиды. Например, Тï для галактозилцерамида из мозга крупного рогатого скота составляет 83°С [96]. Благодаря плотной упаковке и высокой упорядоченности в бислое, сфинголипиды имеют также и высокую Тô.ï. В противоположность этому, Тï для природных ФХ < 0°С.
54
Структура полиненасыщенной ацильной цепи в таких глицерофосфолипидах, имеющая перегибы в местах расположения двойной связи, препятствует плотной упаковке молекул, и при физиологической температуре они находятся в беспорядочном состоянии "свободной упаковки", называемой жидкокристаллической фазой (Lc). Переход глицерофосфолипидов в квази-твердую высокоупорядоченную гелевую фазу (Lβ) возможен только при температуре ниже Тï, которая, в свою очередь, много ниже физиологической. Поэтому при физиологических температурах глицерофосфолипиды и фосфолипидные бислои характеризуются менее плотной упаковкой и относительно низкой упорядоченностью по сравнению со сфинголипидными бислоями. Исследователи полагают, что именно эти различия между сфинголипидами и глицерофосфолипидами, заключающиеся в образовании при физиологических температурах бислоев с упаковкой ЖК цепей разной плотности, приводят к латеральному разделению фаз в мембране и образованию гетерогенных доменов [91].
Латеральному разделению фаз в мембране и образованию гетерогенных доменов способствует также присутствие холестерина.
Добавление ХС к чистым глицерофосфолипидам "размывает" нормальный температурный переход между Lβ è Lc фазами, придавая мембранам свойства, промежуточные между гелем и жидкокристаллическим состояниями [92]. Но высокое сродство ХС к сфинголипидам усиливает разделение фаз и способствует
образованию специфических микродоменов в модельных мембранах [92, 97]. В результате сфинголипиды принимают промежуточную фазу, обозначенную как жидко-упорядоченная (Lo) [92]. В этой фазе жирнокислотные цепи липида упакованы так же плотно, как в гелевой, но имеют большую мобильность, благодаря внедрению молекул ХС между сфинголипидами. Предполагается также, что холестерин может локализоваться вдоль границы между сфинголипидными доменами и глицерофосфолипидами, создавая энергетически благоприятную преходную зону между Lo è Lc фазами [95]. В плазматической мембране глицерофосфолипиды образуют Lc фазу со сравнительно низким содержанием ХС, а сфинголипиды образуют жидкоупорядоченную фазу, сильно обогащенную холестерином, которая и представляет собой рафты. Вероятно, они существуют в Lo фазе или состоянии, близком к ней.
Эти микродомены можно рассматривать как небольшие полужесткие рафты, плавающие в более жидкой, обогащенной
55
глицерофосфолипидами, массе плазматической мембраны. Другими словами, основой образования рафтов являются различная смешиваемость липидов, различная упаковка их ЖК цепей, а также трансбислойная и латеральная асимметрия их молекул. В образовании рафтов играет также роль трансбислойная и латеральная асимметрия молекул отдельных липидов, которая учитывает форму каждого мембранного липида и возможность совместного существования внутри мембраны различных липидных фаз Lc è Lo [95]. Необходимо отметить, что эта современная интерпретация структуры мембраны опровергает традиционное представление об однородном распределении липидов и белков в гомогенном бислое.
Современные технологии, такие как атомно-силовая и флуоресцентно-резонансная микроскопия, позволили убедиться в существовании рафтов in vivo, которые представляют собой маленькие частицы размером приблизительно 50-70 нм в диаметре [98 - 101]. Аналитические исследования показали, что с одним рафтом может быть связано, по меньшей мере, 15 молекул "гликофосфоинозитид (GPI)-заякоренных" белков [102, 103].
Установлено, что размер рафтов может меняться в зависимости от концентрации липидов в клетке и внешних условий. Изменение этих условий может привести к коалесценции рафтов и дисперсии окружающей их неупорядоченной липидной фазы, что, в свою очередь, приводит к драматическим модификациям биофизических свойств мембраны. Такие модификации происходят непрерывно в ходе жизни клетки. Исследования с
помощью флуоресцентных фосфолипидных молекул позволили определить не только размеры рафтов, но и возможное время их существования (в среднем не более 1 мин.).
Предполагают, что рафты находятся на обеих сторонах мембраны и стабилизируются в присутствии мембранных белков, которые и определяют структуру рафтов. Так, присутствие специфических белков кавеолинов определяет особый тип рафтов - кавеолярные рафты, называемые также "кавеолами" [104 - 106].
Кавеолы ("пещеры") как структурные единицы клеточной поверхности известны морфологам с 1955 г. [107]. Но в последние годы изучение мембранных кавеол, как мест протекания и функционально активных соучастников многих клеточных процессов, приобрело особое значение и стало быстро растущей областью исследований. Изначально были установлены способности кавеол транспортировать молекулы через эндотелиальные клетки. Современные методические подходы позволили расширить представления о кавеолах и узнать много
56
нового об их функциональной активности и участии в клеточных процессах. Так, было установлено, что кавеолы образуют уникальные эндо- и экзоцитозные компартменты на поверхности мембран большинства клеток и способны как импортировать молекулы, доставляя их внутрь клетки, так и экспортировать молекулы во внеклеточное пространство. Кавеолы способны компартментализовать ряд сигнальных процессов, т.е. локализовать их протекание и координировать их отдельные этапы [108].
Морфологически кавеолы представляют собой отдельные "малые карманы", углубления или колбообразные (называемые иногда "омега-образными") инвагинации на поверхности клеточной мембраны. Диаметр кавеол составляет 50-100 нм. Их обнаруживают на плазматических мембранах многих видов животных клеток. Наиболее часто они встречаются в адипоцитах, фибробластах, мышечных клетках (скелетных, гладкомышечных и кардиальных), эндотелии капилляров, пневмоцитах 1 типа. Определяют кавеолы либо морфологически (по их флаконообразным инвагинациям), либо по биохимическим критериям (в частности, по обогащенности белком кавеолином).
Количественный состав ряда липидов кавеол отличается от их содержания в мембране. Так, занимая всего 1% поверхности мембраны, они содержат 10% мембранного ХС, что согласуется с моделью образования микродоменов или рафтов в мембране. Кавеолы обогащены также сфингомиелином (от 55 до 96% от общего его содержания в мембране) и другими, участвующими в
передаче клеточных сигналов ("сигнальными") липидами. Количество ФИ, церамидов и диглицеридов составляет до 50% от суммарного содержания этих липидов в плазматической мембране. О латеральной или трансбислойной организации липидов в кавеолярной мембране, так же как и о локальной жидкостности кавеол (в отличие от данных по цельной мембране) почти ничего не известно.
Мембранные фракции, устойчивые к детергентам и обогащенные гликосфинголипидами, сфингомиелином, холестерином и GPI-заякоренными белками, также были выделены из клеток, в которых отсутствовала экспрессия кавеолина и морфологически не определялись кавеолы [109, 110]. Для этих микродоменов еще нет определенной стандартизованной номенклатуры. В литературе встречается много названий таких микродоменов, например: нерастворимые в детергенте обогащенные гликолипидами мембраны; устойчивые к детергенту мембраны; нерастворимые в детергенте домены низкой плотности
57
или кавеоло-подобные домены и др. Однако, чаще всего в научной литературе используется название "липидный рафт" или "кавеолярный рафт", под которым подразумевается плотный липид-организованный микродомен мембраны, причем этот микродомен может состоять как из кавеолярных участков мембраны, так и из любых других. В качестве наиболее известных маркеров липидных рафтов используют специфические "рафтовые" белки, такие как кавеолины-1-3 [111 - 113], флотиллины-1-2 [114], ганглиозиды GM1, GM3 [115, 116], GPI-заякоренные белки [117].
Анализ накопленных экспериментальных данных, позволяет утверждать, что кавеолы на плазматической мембране служат для компартментализации и интеграции широкого ряда процессов трансдукции сигнала [118]. Они выполняют также транспортные функции, включая везикулярную интернализацию малых молекул и трансцитозное (межклеточное) движение макромолекул. Все это открывает определенные возможности для фундаментальных и прикладных исследований в фармацевтической области, например, для поиска путей использования кавеолярных мембранных взаимодействий для развития новой стратегии клеточной и трансклеточной доставки лекарств [118, 120].
С мембранными рафтами связан ряд физиологических функций клетки. Имеются данные в пользу участия рафтов во внутриклеточной передаче сигнала, в клеточной адгезии; с рафтами селективно связываются рецепторы антигена В-клеток.
В настоящее время становится все более очевидным, что липидные рафты играют определенную роль во многих клеточных
процессах, таких как трансцитоз, фотоцитоз [119], альтернативных эндоцитозу путях [120], в процессах интернализации токсинов, бактерий и вирусов [121 - 123], транспорте холестерина [124 - 126], гомеостазе кальция [127], сортировке мембранных белков [128 - 130], трансдукции множественных клеточных сигналов [131, 132]. Предполагают также, что рафты вовлечены в генерацию патогенных форм прионовых белков и белков, связанных с болезнью Альцгеймера [100, 133, 134].
Биохимический анализ белкового состава выделенных и очищенных липидных рафтов из множества клеток различных видов показал выраженную концентрацию сигнальных молекул внутри этих микродоменов [105, 135 - 137]. Поэтому предполагается, что липидные рафты играют определенную специфическую роль в трансдукции клеточных сигналов [138 - 140].
Можно выделить несколько основных причин и условий, объясняющих целесообразность участия липидных рафтов в
58
процессах сигнализации:
1)Липидные рафты могут способствовать эффективной и специфической передаче сигнала, обеспечивая одновременное функционирование множества различных компонентов специфических сигнальных путей.
2)Расположение участвующих в передаче сигнала молекул внутри и/или на липидных рафтах может способствовать контролю за процессом сигналинга и влиять на способность клетки отвечать на раздражение.
3)Дифференцированная концентрация и локализация сигнальных молекул в липидных рафтах, по отношению ко всему объему мембраны, дает возможность контролировать доступ других соединений к каждой сигнальной молекуле. Например, внутри липидного рафта происходит фосфорилирование ряда белков, приводящее к их активации, а плотная (специфическая) структура рафта защищает эти белки от инактивирующего действия мембранных фосфатаз [141].
4)Уникальное рафтовое микроокружение способно специфически влиять на конформацию и активность сигнальных белков [142].
5)Между различными сигнальными путями могут возникать необходимые для трансдукции специфические перекрестные связи только в том случае, если вовлеченные в этот процесс молекулы локализованы в том же липидном рафте.
6)Кластеризация или перемещение липидных рафтов может быть эффективным средством транспортировки предварительно
собранных сигнальных комплексов к специфическим к данному раздражению областям мембраны, например, у поляризующихся или мигрирующих клеток.
7)Кластеризация одного или нескольких типов липидных рафтов с образованием высокоорганизованного сигнального комплекса может привести к модуляции сигналов путем пространственной регуляции.
8)Липидные рафты могут, в случае необходимости, прерывать или останавливать передачу определенных сигналов, изолируя сигнальные молекулы в неактивной форме и препятствуя их активации (так называемая, "негативная" регуляция передачи сигналов)
В последние годы накоплено много экспериментальных данных, указывающих на то, что, липидные рафты, по всей видимости, обеспечивают в клетке эффективность передачи сигнала и его специфичность. Вполне вероятно, что определенные виды рафтов, образовавшихся на поверхности мембраны одной и
59
той же клетки, могут быть специализированы для выполнения определенных, очень тонких процессов.
Липидные рафты, обладая уникальным белковым и липидным составом, соответствующим их специфическим функциям, могут быть вовлечены в компартментализацию сразу нескольких процессов или путей передачи сигнала. В ответ на воздействие определенного стимула они способны быстро "собрать" высокоупорядоченный сигнальный комплекс, или обеспечить "перекрещивание" нескольких одновременно протекающих сигнальных путей ("ко-стимулирующиеся" сигналы). Кластеризация липидных рафтов в процессе сигналинга может регулироваться: задержкой передачи сигнала, их связью с цитоскелетом и их взаимодействием с определенными индивидуальными белками. Предполагают, что в процесс кластеризации вовлечены липидные рафты различных типов. Образование высокоорганизованных сигнальных комплексов кластеризацией одного или нескольких типов липидных рафтов может привести к модуляции сигналов путем пространственной регуляции.
На сегодняшний день получены доказательства, подтверждающие существование разнообразных путей передачи сигнала с помощью липидных рафтов, сопряженных с соответствующими биологическими эффектами. Сюда входит участие в передаче сигнала рецепторами, связывающими G-белок [143, 144], рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR) [145 - 147], различными GPI-"заякоренными" белками [148 - 150]. Кроме
того, были получены изолированные сигналы в ответ на инсулин [151] и фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) [152]. Важно отметить, что, несмотря на недостаточность данных о механизмах регуляции путей передачи сигналов, сегодня можно утверждать, что липидные рафты играют важнейшую роль в этих процессах, модулируя процессы сигналинга различными, в том числе и еще неизвестными путями.
Так как рафты способны латерально диффундировать в плазматической мембране подобно плавающим "челнокам" ("шаттлам"), они способны переносить и создавать условия для связывания между активированными рецепторами и молекулами трансдьюсерами [153].
Исследователями была предложена "объединенная" модель трансдукции сигнала иммунной клеткой [154, 155]. Например, в покоящихся жировых клетках рецептор иммуноглобулина Е - FcεR и белок Lyn локализованы на внешней стороне мембранного рафта. В процессе образования антигенового комплекса Ag-IgE, Lyn и
60