Контрольные вопросы:

Что такое гидролиз белка и как его производят?

Как установить конец гидролиза белка?

Какое значение имеет определение карбоксильных групп методом формолового титрования?

Каков принцип и химизм формолового титрования?

Как различаются белки по форме их молекул?

Что понимают под первичной структурой белка? Какие связи формируют эту структуру?

Что представляет собой вторичная структура белка? Какие связи ее формируют?

Что такое водородная связь?

Что понимают под третичной структурой белка? Какие связи формируют эту структуру?

Чем различаются структуры молекул глобулярных и фибриллярных белков?

Что понимают под четвертичной структурой белка?

Какими методами изучают структуру белковой молекулы?

Тема 5 хроматографическое разделение аминокислот

Хроматографические методы применяются для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков (а также углеводов, липидов и их метаболитов).

Различают несколько видов хроматографии:

1) адсорбционная – основана на различной способности отдельных компонентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента (М.С. Цвет, 1903 г.);

2) распределительная – основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях;

3) ионообменная – основана на различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы сорбента;

4) осадочная – основана на образовании труднорастворимых осадков в определенной последовательности;

5) диффузионная – основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул.

Различают хроматографические методы и по технике выполнения: колоночная и плоскостная. В зависимости от агрегатного состояния фаз: газовая, жидкостная и газожидкостная хроматография. По направлению движения растворителя: восходящая, нисходящая, одномерная, двумерная и радиальная.

Лабораторная работа №11 хроматографическое разделение аминокислот на бумаге

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

С помощью хроматографии можно выделить отдельные вещества из небольшого количества сложной смеси.

Отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, а другой – водонасыщенный органический растворитель, например фенол. Из них один растворитель должен быть полярный (неподвижная фаза), а другой – неполярный (подвижная фаза). Более гидрофобные аминокислоты, лучше растворяющиеся в неполярном растворителе, движутся с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильные аминокислоты. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматографического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) растворы аминокислот; 2) смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) или водонасыщенный раствор фенола; 3) нингидрин, 0,2 % спиртовой раствор; 4) вертикальные хроматографические камеры; 5) полоски хроматографической бумаги (длина 20-30 см, ширина 10-12 см); 6) капилляры для нанесения аминокислот; 7) пинцеты; 8) сушильный шкаф, нагретый до 70-90 ºС; 9) линейка с делениями.

ХОД РАБОТЫ:

На полоске хроматографической бумаги простым карандашом проводят стартовую линию на расстоянии 2-3 см от нижнего края. В точки 1,2,3 (обозначенные ка­рандашом на расстоянии 2 см друг от друга) наносят специальной пипеткой (или стеклянным капилляром) аминокислоты: в точку 1 - триптофан (аланин или аргинин), в точку 2 - глицин (аргинин или лизин), в точку 3 - их смесь. Нанесе­ние проводят в несколько приемов, следя за тем, чтобы пятно рас­твора при каждом прикосновении капилляра к бумаге не растекалось более чем на 3 мм. Каждую последующую порцию раствора наносят после полного высыхания предыдущей. Диаметр пятна не должен превышать 5 мм. Расстояние точек от бокового края хроматографиче­ской бумаги должно быть не менее 2 см. Полоску бумаги следует держать за края (!)

Полоску хроматографической бумаги с нанесенными на нее рас­творами (после высушивания) помещают в хроматографическую ка­меру, в которую предварительно (за сутки) налита разделительная система бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) или водонасыщенный фенол. Нижний край хроматограммы погружают в жидкость примерно на 3-5 мм и подвешивают в камере, которую затем закрывают.

После достижения фронтом растворителя (водной смеси, бутанола и уксусной кислоты или фенола) верхнего конца бумаги (1-1,5 часа), полоску просушивают в сушильном шкафу, предварительно отметив гра­ницу фронта растворителя. После этого опускают её в 0,2 % спиртовой раствор нингидрина на 3 секунды. Затем просушивают в сушильном шкафу при температуре 70-90 ºС (15 минут). Позиции аминокислот на хроматограмме выявляются в виде сине-фиолетовых пятен.

Вклейте хроматограмму в тетрадь. Идентифицируйте пятна, рассчитав для каждого пятна коэффициент распределения R_f или скорость перемещения по формуле:

R_f = а/ b,

где а – расстояние в мм, пройденное аминокислотой от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна; b – расстояние в мм от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД: