Лабораторная работа №25 выделение дезоксирибонуклеопротеидов (днп) из тканей

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Дезоксирибонуклеопротеиды растворяются в растворах солей средней концентрации (например, в 1 М хлориде натрия) с образованием вязких растворов и снова осаждаются при разведении их (0,15 М) в виде нитей нуклеопротеидов.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) NaCl, 2 М и 1 М растворы, содержащие 0,04 % трехзамещенного цитрата натрия (раствор хранят в холодильнике); 2) NaOH, 0,4 и 10 %; 3) дифениламиновый реактив, 1 % (1 г дифениламина, дважды перекристаллизованного из 70 % спирта или петролейного эфира, растворяют в смеси 2,75 мл концентрированной серной кислоты и 100 мл ледяной уксусной кислоты); 4) CuSO₄, 1 %; 5) селезенка, печень.

ХОД РАБОТЫ:

1. Экстракция и выделение днп из тканей.

1) В ступке, охлаждаемой льдом, растирают 2 г ткани органа, затем постепенно добавляют 5 мл охлажденного 2 М раствора хлорида натрия, содержащего 0,04 % трехзамешенного цитрата натрия, и растирают в ступке еще в течение 15 мин.

2) Затем, перемешивая содержимое, постепенно, малыми порциями добавляют 50 мл охлажденного 1 М раствора хлорида натрия. Образовавшуюся гомогенную массу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин.

3) Надосадочную жидкость после центрифугирования сливают в маленький стакан, измеряют в цилиндре объем полученного центрифугата и медленно вливают его в шестикратный объем дистиллированной воды тонкой струйкой, размешивая жидкость деревянной палочкой. Выделившиеся нити ДНП наматывают на деревянную палочку. Затем часть нитей ДНП осторожно собирают и вместе с палочкой переносят в другую пробирку.

4) Нити выделенного ДНП растворяют в 1 мл 0,4 % раствора NaOH. Полученный раствор делят на две части и ставят: 1) биуретовую реакцию (на белок); 2) реакцию с дифениламином (на ДНК).

2. Качественная реакция на белковый компонент ДНП. К 5-10 каплям раствора ДНП добавляют 10 капель 10 % раствора NaOH и по 1 капле 1 % раствора CuSO₄. Раствор окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

3. Качественная реакция на нуклеиновую кислоту в ДНП. При нагревании ДНП гидролизуются, а освободившаяся дезоксирибоза дает синее окрашивание. К раствору (15-20 капель) добавляют равный объем дифениламина, находящегося в смеси с уксусной и серной кислотами. Смесь нагревают на кипящей водяной бане 15 мин. Жидкость постепенно приобретает синюю окраску, обусловленную реакцией дифениламина с дезоксирибозой.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

Лабораторная работа №26 гидролиз нуклеопротеидов

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Для изучения состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При непродолжительном, т.е. частичном, гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и нуклеиновые кислоты. Про продолжительном гидролизе наступает полный распад нуклеопротеидов.

При гидролизе мононуклеотидов выделяются пуриновые или пиримидиновые основания, углевод (рибоза или дезоксирибоза) и фосфорная кислота.

Составные части нуклеопротеидов в гидролизате можно открыть с помощью цветных (качественных) реакций.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) Н₂SO₄, 10 %; конц.; 2) NaOH, 10 %; 3) CuSO₄, 1 %; 4) аммиак концентрированный; 5) AgNO₃, 2 % аммиачный раствор; 6) молибденовый реактив – раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте; 7) тимол, 1 % алкогольный раствор; 8) круглодонная колба с воздушным холодильником; 9) воронка с фильтром; 10) мерный цилиндр на 50 или 100 мл; 11) дрожжи (пекарские).

ХОД РАБОТЫ:

1. Кислотный гидролиз нуклеопротеидов. Помещают 1 г пекарских дрожжей в круглодонную колбу на 100 мл, добавляют 20 мл 10 % раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят под тягой в течение 1 часа на асбестовой сетке при слабом нагревании. Через час после начала кипения нагревание жидкости прекращают, дают ей остыть, переносят в цилиндр, доводят водой до первоначального объема и фильтруют.

С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов. При гидролизе нуклеиновых кислот обнаруживаются фосфорная кислота, рибоза или дезоксирибоза и азотистые основания – пуриновые и пиримидиновые.