Лабораторная работа №8 количественное определение белка

ПРИНЦИП МЕТОДА:

Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) NaCl, 0,9 %; 2) биуретовый реактив: 0,15 г CuSO₄ · 5H₂O и 0,6 г NaKC₄H₄O₆ · 4H₂O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ого раствора NaOH (свободного от Na₂CO₃), добавляют 0,1 г KI и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке; 3) стандартный раствор альбумина (БСА – бычий сывороточный альбумин), 10 мг белка в 1 мл; 4) раствор сыворотки с разведением в 10 раз: взять 1 мл сыворотки крови довести дистиллированной водой или 0,9 % раствором NaCl до объема 10 мл. Полученная концентрация белка будет соответствовать 6,5-8,5 г/л; 5) пробирки, пипетки; 6) ФЭК.

ХОД РАБОТЫ:

1. Опытная проба: к 4 мл биуретового реактива добавляют, избегая образования пены, 1 мл приготовленного раствора сыворотки крови с 10-ти кратным разведением.

2. Контрольная проба: к 1 мл раствора хлорида натрия приливают 4 мл биуретового реактива.

Пробы делают в 2-х повторениях!

Через 45-50 мин опытную пробу колориметрируют на ФЭКе при длине волны 540 нм против контрольной пробы (либо против дистиллированной воды).

3. Расчет ведут по калибровочной кривой. Данные для построения калибровочного графика приведены в таблице 4.

Таблица 4

Данные для построения калибровочного графика

№ пробы	Рабочий р-р биуретового реактива (мл)	Стандартный р-р белка (мл)	0,9 % р-р NaClили дист Н2О (мл)	Содержание белка в пробе (г)	Концентрация белка (г/л)
1.	4	0,2	0,8	0,002	2,0
2.	4	0,4	0,6	0,004	4,0
3.	4	0,6	0,4	0,006	6,0
4.	4	0,8	0,2	0,008	8,0
5.	4	1,0	0	0,010	10,0

При построении калибровочной кривой серию стандартных растворов обрабатывают так же, как и опытные пробы. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭКе при 540 нм против дистиллированной воды.

Измерения оптической плотности стандартных растворов начинают с растворов наименьшей концентрации.

Пробы делают в 2-х повторениях!

По результатам измерений строится калибровочная кривая. Средние значения оптической плотности (А) 2-х повторений (соответствующие различным концентрациям) наносят на миллиметровую бумагу на оси ординат, на оси абсцисс откладывают значения концентрации стандартных растворов белка (С).

Полученную по графику концентрацию белка в исследуемой опытной пробе умножают на величину разведения (х10).

Значения концентрации общего белка в сыворотке крови практически здоровых людей составляет 65-85 г/л.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

Контрольные вопросы:

Опишите физико-химическую характеристику пептидной связи. Почему пептидные связи являются основой строения белка?

Как определить количество вещества с использованием калибровочной кривой?

Какова концентрация общего белка в сыворотке крови здорового человека?