Раздел 7. Энергетический обмен

Тема 15

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ

Окислительное фосфорилирование – синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата, сопряженный с переносом протонов и электронов по дыхательной цепи от субстратов к кислороду. Осуществляется комплексом АТФ-синтазой во внутренней мембране митохондрий.

Лабораторная работа №41

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АТФ

И КРЕАТИНФОСФАТА В МЫШЦЕ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения – АТФ и креатинфосфат, которые обеспечивают по мере надобности мышцу энергией. Метод основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, как и фосфорный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде – так называемый лабильно связанный фосфор. Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на макроэргические соединения мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) мышечная ткань животного; 2) ТХУ, 2,5 %; 3) HCl, 1 М; 4) NaOH, 1 М; 5) молибдат аммония, 1 %; 6) аскорбиновая кислота, 1 %; 7) пробирки, пипетки; 8) ФЭК.

ХОД РАБОТЫ:

Мышцу (0,5 г) гомогенизируют во льду в 5 мл охлажденной 2,5 % ТХУ. Фильтруют в мерную пробирку. Осадок на фильтре промывают 5 мл холодной дистиллированной воды. Объем доводят до 10 мл.

Таблица 32

Схема определения

Реагенты	Количество реагента, мл
	Опыт	Контроль
Безбелковый фильтрат	0,5	0,5
HCl	1,0	1,0
	Кипятить 10 мин (гидролиз фосфорных связей), охладить	Не кипятить
NaOH	1,0	1,0
H2O	7,5	7,5
Перенести по 5 мл жидкости в другие пробирки
Молибдат аммония	0,5	0,5
Аскорбиновая кислота	0,5	0,5
Н2О	2,0	2,0
Смесь в пробирках перемешать, экспозиция 10 мин при комнатной температуре
Колориметрировать на ФЭКе против воды при 670 нм

В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфор представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и фосфатных солей, присутствующих в тканях, в контрольной пробе – только фосфатные соли.

Вычитают из оптической плотности, найденной для опытной пробы, оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Концентрацию лабильно связанного неорганического фосфора в пробе находят по калибровочному графику.

Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора, учитывая разведение:

Х=А х 3,3 х 400 х 1000,

где Х - содержание макроэргических соединений в пересчете на 1 мг АТФ в 1 кг сырой ткани; А – содержание АТФ в пробе, мг; 3,3 х 400 – коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОДЫ:

Лабораторная работа №42 обнаружение над в дрожжах

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

НАД встречается во многих органах и тканях человека и животных, богаты им и дрожжи. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуорисцирующего комплекса с ацетоном. Эта реакция характерна для производных амида никотиновой кислоты.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) дрожжи; 2) ацетон; 3) раствор NaOH, 300 г/л; 4) HCl, конц.; 5) спиртовой раствор фенолфталеина, 5 г/л; 6) пробирки; 7) спиртовки; 8) держатели; 9) водяная баня; 10) флуориметр.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4-5 мм, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20-30 сек, не допуская выбрасывания жидкости. Отфильтровывают в пустую пробирку 5-10 капель полученного экстракта, добавляют 3-5 капель ацетона и 1-2 капли раствора едкого натра. Оставляют пробирку на 2 минуты; затем добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и по каплям соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина. Пробирку в процессе добавления кислоты встряхивают. Поместить пробирку на 2 минуты в кипящую баню, затем охладить и поднести к включенному флуориметру. Ацетоновый комплекс НАД флуоресцирует синим светом.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД: