Лабораторная работа №3 осаждение белков высаливанием

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Высаливание – это обратимый процесс. Нейтральные соли аммония, щелочных и щелочноземельных металлов – Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, NaCl, MgSO₄ и другие нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к выпадению в осадок. Осадки можно снова растворить в воде, при этом наблюдается значительная степень восстановления свойств белков (например, ферментативной активности, антигенных свойств и т.д.). Высаливанием пользуются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка с хлористым натрием; 2) NaCl, кристаллический, тонко растертый порошок (в виде пудры); 3) (NH₄)₂SO₄, кристаллический, тонко растертый порошок; 4) (NH₄)₂SO₄, насыщенный раствор; 5) MgSO₄, кристаллический, тонко растертый порошок; 6) СН₃СООН, 1 %; 7) NaOH, 10 %; 8) CuSO₄, 1 %; 9) пробирки, бумажные фильтры.

ХОД РАБОТЫ:

1. Осаждение сернокислым аммонием. В пробирку наливают 2-3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.

К фильтрату добавляют тонко растертый порошок сернокислого аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция соли уже не растворяется). Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают.

С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. При полном осаждении белков она должна быть отрицательной.

2. Осаждение сернокислым магнием или хлористым натрием. В 2 пробирки наливают по 2-3 мл раствора яичного белка и добавляют (до получения насыщенного раствора) в одну пробирку порошок хлористого натрия, в другую – сернокислого магния. Через 5-6 мин. в пробирках замечается выпадение осадков (глобулины). Альбумины в нейтральных растворах солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются.

Содержимое пробирок отфильтровывают через бумажные фильтры. В фильтратах – альбумины. Фильтраты подкисляют 1 % раствором уксусной кислоты – появляются осадки альбуминов. Их отфильтровывают, а в фильтратах с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

Лабораторная работа №4 осаждение белков при кипячении

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой происходят необратимые изменения физико-химических и биологических свойств макромолекул.

На скорость и интенсивность процесса будут влиять рН и добавление электролитов. Быстро и наиболее полно белки денатурируют в изоэлектрической точке. Сдвиги рН в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков. В сильно кислых и сильно щелочных растворах осаждения белков при кипячении практически не происходит. При добавлении кислот молекулы белка заряжаются положительно, в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды. Прибавление электролитов (например, хлористого натрия) ускоряет процесс осаждения даже в кислой среде.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); 2) CH₃COOH, 1 %; 10 %; 3) NaOH, 10 %; 4) NaCl, насыщенный раствор; 5) пробирки; спиртовки; держатели.

ХОД РАБОТЫ:

В пять пробирок наливают по 5 капель раствора яичного белка.

1. В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают до кипе­ния. Жидкость мутнеет, поскольку разрушаются водные оболочки во­круг молекулы белка, и происходит укрупнение его частиц.

2. Во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1 % раствора CH₃COOH и нагревают. Хлопьевидный осадок белка выпадает скорее и полнее, т.к. при подкислении рН раствора приблизится к изоэлектрической точке белка.

3. В третью пробирку добавляют 0,5 мл 10 % раствора CH₃COOH и нагревают. Даже при кипячении осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость.

4. В четвертую пробирку приливают 5 капель 10 % CH₃COOH и 2 капли насыщенного раствора NaCl и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок, т.к. частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористо­го натрия, а так же теряют гидратную оболочку.

5. В пятую пробирку добавляют 2 капли 10 % раствора NaOH, создавая щелочную среду. При кипячении жидкости осадка не образуется, по­скольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Результаты занести в таблицу 3. Отметить положительную реакцию осаждения плюсом, а отрицательную - минусом. Указать в каждом случае причины появления или отсутствия осадка белка.

Таблица 3

Нейтраль­ная среда	Слабокис­лая среда	Сильно­кислая среда	Сильнокис­лая среда + электролит	Щелоч­ная среда

ВЫВОД: