Лабораторные работы для выполнения

НА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЯХ

Раздел V. Биохимия витаминов и гормонов.

Тема 5.4. Механизм действия гормонов. Гормональная регуляция

обмена углеводов и липидов.

٭Количественное определение малонового диальдегида

Свободными радикалами (R*) называют атомы, молекулы или структурные фрагменты молекул, имеющие на внешних орбиталях неспаренные электроны. В силу исключительно высокой реакционной способности радикалы могут взаимодействовать с различными молекулами, вызывая их повреждение. Малоновый диальдегид (МДА)― конечный продукт свободно-радикального окисленияполиненасыщенных высших жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов биологических мембран. МДА - химически очень активное вещество: его альдегидные группы взаимодействуют с NH₂-группами белков, вызывая необратимую денатурацию последних.

Активация в клетке пероксидных и свободно-радикальных процессов ― это один из факторов патогенеза атеросклероза, ишемической болезни сердца, инфаркта, инсульта, язвенной и ожоговой болезни, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваний, синдрома адаптационного перенапряжения и хронической усталости, диабета. Синдром пероксидации проявляется так же при низком уровне антиоксидантов, стрессе любого происхождения, действии синтетических лекарств и ксенобиотиков, гиподинамии, старении организма, избыточном потреблении в пищу жиров и углеводов, гипоксических состояниях, воздействия вибрации, электромагнитных полей, радиоактивного и ультрафиолетового излучений.

Цель работы. Определить содержание МДА в сыворотке крови.

Принцип метода. МДА реагирует с тиобарбитуратовой кислотой, при этом образуется окрашенное соединение – триметиловый комплекс. Оптическую плотность окрашенного раствора определяют на ФЭК при 532 нм и рассчитывают концентрацию МДА, исходя из молярного коэффициента экстинции триметилового комплекса.

Ход определения. Студентам выдается готовый лизат, приготовленный следующим образом: к 2 мл крови добавляют 0,2 мл 0,1%-ного раствора Тритон Х-100 и оставляют на 30 мин при 0°С. МДА определяют в образовавшемся лизате по нижеприведенной схеме:

№	Реактивы и этапы	Пробы
		Опыт	Контроль
1	Лизат, мл	0,5	―
2	Физиологический раствор, мл	1,5	2
3	Трихлоруксусная кислота (30%-ный раствор), мл	2	2
4	Инкубируют 15 мин при 0°С
5	Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин
6	Надосадочную жидкость аккуратно сливают в помеченные стеклянные пробирки, отбирают из них точно по 2 мл надосадочной жидкости и добавляют:
7	Тиобарбитуратовая кислота (0,5%-ный раствор), мл	4	4
8	Кипятят 15 мин (осторожно!)
9	Охлаждают до 15-25°С
10	Фотометрируют против воды (λ=532 нм, толщина кюветы 1 см). D532
11	Dоп―Dк

Расчеты

Концентрацию МДА (С_х) вычисляют по формуле:

C_x=76,92•(D_оп―D_к) (мкмоль/л)

Примечание. Величина 76,92 рассчитывается исходя из молярного коэффициента экстинкции триметилового комплекса (1,56·10⁵ М^-1см^-1) и разведения.

К методическим рекомендациям