Лабораторные работы для выполнения

НА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЯХ

Раздел I. Химия белков. Ферменты.

Тема 1.3. Структура и свойства ферментов. Кинетика ферментативных реакций.

Доказательство белковой природы ферментов

Принцип метода. Раствор фермента слюны амилазы, химическая природа которого изучается, обрабатывается раствором протеолитического фермента пепсина. В дальнейшем активность изучаемого фермента испытывается по способности расщеплять субстрат (крахмал). Оптимум pH пепсина – 1,5-2,5, амилазы – 6,8-7,2.

Ход определения. В первую пробирку наливают 1 мл раствора пепсина в HCl, во вторую – 1 мл 0,2н раствора соляной кислоты ( контрольная проба). В обе пробирки добавляют по 1 мл раствора слюны, тщательно смешивают и помещают на 40 минут в термостат при температуре 37°С. По истечении указанного времени в каждую пробирку добавляют по 1 мл 0,1% раствора крахмала, предварительно нейтрализовав содержимое обеих пробирок добавлением нескольких капель раствора едкого натра (нейтрализация контролируется индикаторной бумагой). Затем обе пробирки помещают в термостат на 20 минут. После извлечения проб из термостата в каждую пробирку добавляют по 1-2 капли раствора йода и наблюдают за появившейся окраской.

Оформление работы. На основании результатов опыта необходимо сделать соответствующие выводы о химической (белковой) природе фермента амилазы.

Специфичность действия амилазы (α-1,4-глюкан-4-глюкангидролаза) и сахаразы (β-d-фруктофуранозид-фруктогидролаза)

Принцип метода. Метод основан на сравнительном изучении гидролиза α-амилазой и сахаразой разных субстратов, содержащих глюкозидные связи: крахмала и сахарозы. Гидролиз крахмала и сахарозы оценивают пробой Фелинга на восстанавливающие сахара (мальтоза, глюкоза).

Ферменты катализируют реакции по схеме:

α-амилаза

Крахмал + nH₂O → Декстрины + Мальтоза

сахараза

Сахароза + H₂O → Глюкоза + Фруктоза

Ход определения. В одну пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в другую – такой же объем раствора сахарозы. Для выявления специфичности α-амилазы в обе пробы добавляют по 5 капель разбавленной слюны, перемешивают встряхиванием и ставят в водяную баню при 38˚С на 10 мин. Затем с жидкостью в обеих пробирках проделывают пробу с реактивом Фелинга и сравнивают окраску.

Для выявления специфичности сахаразы в одну пробирку наливают 10 капель раствора крахмала, а в другую – сахарозы и прибавляют к ним по 5 капель экстракта сахаразы дрожжей. Пробы перемешивают встряхиванием и помещают в водяную баню при 38˚С на 10 мин, после чего с жидкостью обеих пробирок проделывают пробу с реактивом Фелинга. Сравнивают окраску.

Оформление работы. Данные занести в таблицу, сделать вывод о специфичности изученных ферментов.

Фермент	Субстрат	Проба с реактивом Фелинга	Специфичность действия

Практическое значение работы. Ферменты с абсолютной и относительной групповой субстратной специфичностью, обладающие меньшей избирательностью действия на субстраты, участвуют, как правило, в гидролизе питательных веществ или превращении чужеродных соединений. В частности, α-амилаза и сахараза проявляют специфичность не к структуре субстрата в целом, а к типу гликозидных связей, находящихся в соответствующих углеводах.