Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_212_библиотеки_им_акад_М_И_Перельмана
.pdf
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
"НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР
РАДИОЛОГИИ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
Киселева Алевтина Эдуардовна
Клиническое значение метилирования CDH1, MLH1 и экспрессии гена MMP7
для лечения диффузного рака желудка
3.1.6. Онкология, лучевая терапия
3.1.9. Хирургия
Диссертация
на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор,
академик РАН
Решетов Игорь Владимирович
доктор медицинских наук
Быков Игорь Игоревич
Москва – 2023
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................ 19
1.1. Эпидемиология .................................................................................................... 19
1.2. Этиология и патогенез рака желудка ................................................................ . 20
1.2.1. Значение Helicobacter pylori в развитии рака желудка .................................. 20
1.2.2. Значение вируса Эпштейна-Барра в развитии рака желудка ......................... 23
1.2.3. Генетические факторы ..................................................................................... 23
1.3. Классификация рака желудка ............................................................................. 24
1.3.1. Международная классификация по ТNM и стадиям (8 редакция, 2017 г.) ... 25
1.3.2. Молекулярная классификация рака желудка .................................................. 26
1.3.3. Международная гистологическая классификация эпителиальных
опухолей (ВОЗ, 2019) ................................................................................................. 27
1.3.4. Гистологическая классификация рака желудка по Lauren ............................. 28
1.4. Молекулярно-генетические характеристики рака желудка .............................. 28
1.4.1. Генные мутации ................................................................................................ 29
1.4.2. CNV и другие хромосомные изменения ......................................................... 31
1.4.3. Метилирование ДНК и модификация гистонов ............................................. 33
1.4.4. Экспрессия гена MMP7 .................................................................................... 36
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................... 38
2.1. Общая характеристика клинического материала .............................................. 38
2.1.1. Дизайн исследования ....................................................................................... 39
2.2. Критерии отбора пациентов в исследование ..................................................... 41
2.3. Характеристика групп клинического исследования ......................................... 42
2.4. Классификации и шкалы, используемые в научной работе.............................. 48
2.5. Характеристика методов обследования ............................................................. 49
2.6. Характеристика методов лечения больных ....................................................... 52
2.6.1. Предоперационная подготовка пациентов ...................................................... 52
2.6.2. Оперативное лечение ....................................................................................... 53
3
2.7. Характеристика исследуемых образцов ............................................................. 54
2.8. Характеристика молекулярных методов исследования .................................... 59
2.8.1. Анализ метилирования генов CDH1, MLH1 ................................................... 59
2.8.1.1. Выделение геномной ДНК из опухолевого материала ............................... 59
2.8.1.2. Рестрикционный анализ ................................................................................ 60
2.8.1.3. Определение аномального метилирования промоторных областей генов-
супрессоров опухолевого роста MLH1, CDH1 ......................................................... 60
2.8.2. Анализ экспрессии гена ММР7 ....................................................................... 62
2.8.2.1. Выделение РНК ............................................................................................. 62
2.8.2.2. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ......................... 63
2.8.3. Приборы, реактивы и компьютерные программы .......................................... 65
2.8.3.1. Реактивы для исследований .......................................................................... 65
2.8.3.2. Компьютерные программы ........................................................................... 66
2.9. Статистическая обработка результатов исследования ................................ ...... 67
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ........................ 68
3.1. Аномальное метилирование гена CDH1 у больных раком желудка ................ 69
3.1.1. Аномальное метилирование гена CDH1 и половая принадлежность ........... 69
3.1.2. Аномальное метилирование гена CDH1 и возраст ......................................... 70
3.1.3. Аномальное метилирование гена CDH1 и глубина инвазии опухоли........... 72
3.1.4. Аномальное метилирование гена CDH1 и вовлечённость в опухолевый
процесс региональных лимфоузлов .......................................................................... 73
3.1.4.1. Аномальное метилирование гена CDH1 и объем опухоли желудка .......... 74
3.1.5. Хирургия ........................................................................................................... 76
3.1.5.1. Аномальное метилирование гена CDH1 и общая продолжительность
жизни после операции ............................................................................................... 76
3.1.5.2. Аномальное метилирование гена CDH1 и стадия онкологического
заболевания................................................................................................................. 78
3.1.5.3. Объем операции и общая выживаемость пациентов в зависимости от
метилирования гена CDH1 ........................................................................................ 80
3.2. Аномальное метилирование гена MLH1 у больных раком желудка ................ 85
4
3.2.1. Аномальное метилирование гена MLH1 и половая принадлежность ........... 85
3.2.2. Аномальное метилирование гена MLH1 и возраст пациентов ...................... 85
3.2.3. Аномальное метилирование гена MLH1 и глубина инвазии опухоли .......... 87
3.2.4. Аномальное метилирование гена MLH1 и вовлечённость региональных
лимфоузлов желудка в опухолевый процесс. Опухолевая ткань ............................ 89
3.2.5. Аномальное метилирование гена MLH1 и объем опухоли желудка ............. 90
3.2.6. Аномальное метилирование гена MLH1 и общая продолжительность
жизни после операции ............................................................................................... 92
3.2.7. Аномальное метилирование гена MLH1 и стадия онкологического
заболевания................................................................................................................. 95
3.2.8. Объем операции и общая выживаемость в зависимости от метилирования
гена MLH1 ................................................................................................................... 96
3.3. Экспрессия гена MMP7 у больных раком желудка ......................................... 100
3.3.1. Экспрессия гена MMP7 и половая принадлежность .................................... 100
3.3.2. Экспрессия гена MMP7 и возраст .................................................................. 101
3.3.3. Экспрессия гена MMP7 и глубина инвазии опухоли желудка..................... 102
3.3.4. Экспрессия гена MMP7 и объем опухоли желудка ...................................... 102
3.3.5. Экспрессия гена MMP7 и вовлечённость в опухолевый процесс
региональных лимфоузлов ...................................................................................... 104
3.3.6. Экспрессия гена MMP7 и стадия онкологического заболевания ................ 104
3.3.7. Объем операции и общая выживаемость в зависимости от экспрессии гена
MMP7 ........................................................................................................................ 105
3.3.8. Экспрессия гена MMP7 и общая продолжительность жизни после
операции ................................................................................................................... 107
3.4. Сопоставление аномального метилирования генов CDH1, MLH1 с
клиническими данными ........................................................................................... 108
3.4.1. Глубина инвазии опухоли желудка и метилирование генов MLH1 и
CDH1 ......................................................................................................................... 108
3.4.2. Объем опухоли желудка и метилирование генов MLH1 и CDH1 ................ 108
5
3.4.3. Вовлечённость в опухолевый процесс региональных лимфоузлов и
метилирование генов MLH1 и CDH1 ...................................................................... 109
3.4.4. Стадия онкологического заболевания и метилирование генов MLH1 и
CDH1 ......................................................................................................................... 110
3.4.5. Объем операции и общая выживаемость в зависимости от метилирования
генов MLH1 и CDH1 ................................................................................................ 111
3.4.6. Общая выживаемость пациентов и метилированиегенов MLH1 и CDH1 ... 113
3.5. Сопоставление аномального метилирования гена CDH1 и экспрессии
гена MMP7 с клиническими данными .................................................................... 114
3.5.1. Глубина инвазии опухоли и метилирование гена CDH1 и экспрессии
гена MMP7 ................................................................................................................ 114
3.5.2. Объём опухоли и метилирование гена CDH1 и экспрессии гена MMP7 .... 116
3.5.3. Вовлечённость в опухолевый процесс региональных лимфоузлов и
метилирование гена CDH1 и экспрессии гена MMP7 ............................................ 118
3.5.4. Стадия онкологического заболевания и метилирование гена CDH1 и
экспрессии гена MMP7 ............................................................................................ 119
3.5.5. Объем операции и общая выживаемость в зависимости от метилирования
генов CDH1 и экспрессия MMP7 ............................................................................ 120
3.6. Сопоставление аномального метилирования гена MLH1 и экспрессии
гена MMP7 с клиническими данными .................................................................... 123
3.6.1. Глубина инвазии опухоли и метилирование гена MLH1 и экспрессии
гена MMP7 ................................................................................................................ 123
3.6.2. Объём опухоли желудка и метилирование гена MLH1 и экспрессии
гена MMP7 ................................................................................................................ 125
3.6.3. Вовлечённость в опухолевый процесс региональных лимфоузлов и
метилирование гена MLH1 и экспрессии гена MMP7 ............................................ 127
3.6.4. Стадия онкологического заболевания и метилирование гена MLH1 и
экспрессии гена MMP7 ............................................................................................ 128
3.6.5. Объем операции и общая выживаемость в зависимости от метилирования
генов MLH1 и экспрессия MMP7 ............................................................................ 130
https://t.me/med1917
6
3.7. Сопоставление аномального метилирования генов CDH1, MLH1 и
экспрессии гена MMP7 с клиническими данными ................................................. 133
3.7.1. Глубина инвазии опухоли желудка и метилирование генов MLH1,
CDH1 и экспрессии гена MMP7 .............................................................................. 133
3.7.2. Объём опухоли желудка и метилирование генов MLH1, CDH1 и
экспрессии гена MMP7 ............................................................................................ 135
3.7.3. Вовлечённость в опухолевый процесс региональных лимфоузлов и
метилирование генов MLH1, CDH1 и экспрессии гена MMP7 .............................. 138
3.7.4. Стадия онкологического заболевания и метилирование генов MLH1,
CDH1 и экспрессии гена MMP7 .............................................................................. 140
3.7.5. Объем операции и общая выживаемость в зависимости от метилирования
генов CDH1, MLH1 и экспрессия MMP7 ................................................................ 142
3.8. Чувствительность и специфичность................................................................. 144
3.9. Кривые выживаемости Каплана-Майера ......................................................... 146
3.10. Прогнозирование выживаемости пациентов в послеоперационный период
с помощью искусственного интеллекта .................................................................. 148
3.11. ROC-анализ ...................................................................................................... 150
3.11.1. Сопоставление результатов основной группы и группы сравнения ......... 152
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .......................................................... 156
4.1. Клинический пример ......................................................................................... 169
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................ 173
ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 183
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ................................................................... 184
СПИСОК СОКРАЩЕНИ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИ ............................. 185
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 186
https://t.me/med1917
7
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Опухоли желудочно-кишечного тракта занимают одно из ведущих мест в
структуре общей заболеваемости и смертности населения РФ от злокачественных
новообразований [39]. Среди заболевших раком желудка (РЖ) в 2021 году с
впервые в жизни установленным диагнозом на IV стадию пришлось 40,1% случаев
рака желудка, 21,8% – на III стадию, 36,7% − на I−II стадии [39].
Таким образом, более половины пациентов с диагнозом рак желудка в России
поступают на лечение с третьей и четвертой стадиями заболевания, когда только
хирургическое лечение будет недостаточным. Эффективность лечения больных
раком желудка во многом зависит от своевременной диагностики предраковых
состояний и самого онкологического процесса на ранних стадиях [163].
Отдаленные результаты хирургического лечения больных раком желудка зависят
от стадии заболевания, гистологической структуры опухоли, своевременности
начатого лечения и радикальности первично выполненного оперативного
вмешательства. Несмотря на значительные достижения в хирургическом лечении
рака желудка [7], из-за выявления заболевания на поздних стадиях, часто после
операций отмечается прогрессирование заболевания [157].
Сегодня перспективным подходом по улучшению результатов
хирургического и комбинированного лечения больных раком желудка может стать
поиск [6] новых прогностических критериев, позволяющих персонализировать
ведение пациентов. К таким критериям можно отнести молекулярно-генетические
особенности опухолевого процесса у отдельно взятого индивида. Оценка
молекулярно-генетических изменений в опухоли [6] станет одним из факторов,
который необходимо учитывать для лечения больных раком желудка [31, 37]. С
развитием генетических технологий появилась возможность изучать
молекулярные [45] маркеры, определять структурные и функциональные
повреждения, выявляемые в геноме опухолевой клетки. Такие повреждения в
https://t.me/med1917
8
геноме приводят к изменению функций генов-регуляторов клеточного цикла,
увеличению метастатической активности, аномальному метилированию
регуляторных областей генов-супрессоров, изменению активности и экспрессии
генов в клетках опухолей и т. д [6, 42]. Герминальные мутации являются причинами
наследственного рака желудка. Соматические мутации CDH1 наиболее часто
встречаются при диффузном раке желудка, почти в 50% случаях [70]. Мутации в
гене CDH1 приводят к потере функции Е-кадгерина. Этот белок является важным
трансмембранным гликопротеином, участвующим в поддержании нормальной
тканевой архитектуры [18]. Изменения гена Е-кадгерина (мутации, делеции,
метилирование) вызывают потерю экспрессии белка или изменение его
локализации в клетке, что имеет два важных для онкогенеза последствия. Во-
первых, нарушаются межклеточные контакты и морфогенетические реакции
клетки, во-вторых, происходит накопление β-катенина в ядре и повышение его
транскрипционной активности. В результате активируется пролиферация клеток и
увеличивается их способность к инвазии [18]. Утрата нормальной структуры Е-
кадгерина приводит к активации онкогенных сигнальных путей:
RTK/EGFR/MAPK, P-120/Rho/RAC и β-catenin/Wnt. Эти взаимодействия
способствуют неконтролируемому росту опухолевых клеток и эпителиально-
мезенхимальному переходу, что приводит к развитию и прогрессированию
диффузного РЖ [18].
MLH1 — ген, кодирующий одноименный белок. Белок MLH1 играет
ключевую роль в восстановлении поврежденной ДНК. Мутации гена MLH1
приводят к уменьшению или полному подавлению синтеза белка MLH1. В
результате накапливаются ошибки при репликации ДНК, нарушается работа
других генов, участвующих в важных клеточных процессах, таких как контроль
роста и деление клеток. Последствием таких нарушений может стать развитие
различных форм рака. Несколько сотен герминальных мутаций гена MLH1
обнаружено у людей с синдромом Линча. При этом заболевании повышен риск
развития колоректального рака, рака эндометрия (слизистой оболочки матки),
https://t.me/med1917
9
яичников, тонкой кишки, желчного пузыря, верхних мочевыводящих путей и
головного мозга, а также рака желудка [6].
Гиперметилирование CpG-островка гена MLH1, приводящая к потере его
экспрессии, является основным механизмом микросателлитной нестабильности
при спорадическом раке желудка [6, 120]. Матриксная металлопротеиназы-7
(MMP7) представляет собой фермент, который кодируется MMP7 геном.
Обнаружено, что MMP7 потенциально участвует в метастазировании опухолей и
воспалительных процессах. Высокий уровень экспрессии MMP7 способствует
инвазии рака и ангиогенезу за счет разрушения макромолекул внеклеточного
матрикса и соединительной ткани. Проведено не так много исследований,
касающихся значения MMP7 при развитии рака желудка, но во всех
подтверждается тот факт, что MMP7 является предиктором метастазирования в
лимфатические узлы [79].
Изучение и определение молекулярно-генетических маркеров в тканях
опухоли и плазме крови пациентов, изучение генетических факторов,
оказывающих влияние на развитие рака желудка, является важной научной и
клинической задачей, решение которой, возможно, позволит выработать
индивидуальный подход к тактике ведения пациента [6].
Таким образом, поиск дополнительных индивидуальных прогностических
факторов, которыми могут стать молекулярно-генетические особенности
организма и опухоли, явился основанием для проведения данного исследования [6].
Степень разработанности темы исследования
Проблемам повышения эффективности лечения рака желудка занимаются
ученые во всем мире. Особый интерес вызывает поиск молекулярных
характеристик, которые бы позволили персонализировать хирургическое и
лекарственное лечение. Это стало возможным благодаря разработке
секвенирования следующего поколения, что позволяет осуществить
систематический метод идентификации всех генетических изменений. Проводятся
https://t.me/med1917
10
попытки по созданию молекулярной классификации, основанной на данных
секвенирования, которая является ценной для будущей противоопухолевой
лекарственной терапии. Рассматриваются разные комбинации изменений в генах,
которые можно было бы использовать в диагностике и планировании
хирургического лечения рака желудка. В данной работе проведен поиск сочетания
молекулярных маркеров, которые позволят решить вопрос персонализированного
лечения пациентов с раком желудка.
Цели и задачи
Повысить эффективность лечения пациентов с диффузным раком желудка
путем разработки персонализированного подхода к определению объема
хирургического вмешательства на основе данных метилирования генов CDH1,
MLH1 и экспрессии гена MMP7.
В ходе написания данной работы были поставлены следующие задачи:
1. Изучить частоту метилирования генов CDH1, MLH1 в операционных
образцах больных диффузным раком желудка и сравнить с показателями в
неопухолевой ткани желудка.
2. Изучить экспрессию гена MMP7 в опухолевых образцах пациентов с раком
желудка и сравнить с показателями в неопухолевой ткани желудка.
3. Проанализировать связь метилирования генов CDH1, MLH1 и экспрессии
MMP7 в опухоли пациентов с РЖ с основными характеристиками опухолевого
процесса и регионарным метастазированием.
4. Выяснить связь между совокупным уровнем маркеров и объемом операций
на желудке.
5. Оценить возможность использования молекулярных показателей
метилирования генов CDH1, MLH1 и экспрессии MMP7 при выборе тактики
хирургического лечения больных диффузным раком желудка.
https://t.me/med1917
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана