Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_212_библиотеки_им_акад_М_И_Перельмана
.pdf
51
Рисунок 5 – Эндоскопическое УЗИ желудка. Опухоль желудка
Проводилась мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ) органов
брюшной полости [16], органов грудной клетки, малого таза с пероральным и
внутривенным контрастированием, которые позволяют оценить распространение
опухоли на соседние органы и ткани, поражение регионарных лимфатических
узлов, исключить наличие отдаленных метастазов [33].
Допплерография проводилась при подозрении на инвазию опухоли желудка
в крупные сосуды.
Выполнялась электрокардиография для оценки работы сердечно-сосудистой
системы.
Всем пациентам, включенным в исследование, проведено хирургическое
лечение и при подготовке к нему с целью оценки функционального статуса по
показаниям проводились дополнительные обследования: холтеровское
мониторирование, эхокардиография (Эхо-КГ), ультразвуковая допплерография
сосудов (вен) нижних конечностей (УЗДГ), исследование функции внешнего
дыхания (ФВД), консультации врачей-специалистов (эндокринолога, терапевта и т.
п.) или другие диагностические исследования, необходимые для оценки состояния
пациента в каждом конкретном клиническом случае.
При подозрении на метастатическое поражение костей проводилась
остеосцинтиграфия. Пациентам выполнялась позитронно-эмиссионная
томография (ПЭТ/КТ) для определения наличия отдаленных метастазов, что
позволило правильно оценить стадию заболевание.
https://t.me/med1917
52
Все фрагменты ткани опухоли желудка, полученные при биопсии,
отправлялись на гистологическое исследование.
2.6. Характеристика методов лечения больных
2.6.1. Предоперационная подготовка пациентов
Большая часть пациентов, вошедших в клиническое исследование, поступала
на лечение в возрасте старше 50 лет (96%), когда уже имеются сопутствующие
заболевания, чаще всего сердечно-сосудистые (52,5%).
При необходимости пациенты перед началом оперативного лечения
проходили лечение и подготовку в специализированном, чаще всего
терапевтическом отделении. Проводилась коррекция по основным заболеваниям, а
также восстановление кислотно-основного, водно-электролитных и белковых
отклонений и анемического синдрома [55, 116]. Пациенты, у которых были
противопоказания к оперативному лечению по причине соматической
отягощенности состояния, были исключены из исследования. [5, 133, 138].
За три дня до операции пациенты должны были соблюдать бесшлаковую
диету, пищу нельзя было принимать за 12 часов до операции, прием жидкости
ограничивали за 8 часов. Вечером перед операцией с целью очищения и
промывания толстой кишки, а также чтобы не было акта дефекации при
расслаблении мускулатуры во время анестезии, выполнялась очистительная
клизма.
Чтобы минимизировать риск гнойных осложнений после операции,
проводилась подготовка операционного поля. Она заключалась в бритье волос в
лобковой области, подмышечных впадинах, живота, а также в принятии
гигиенического душа.
https://t.me/med1917
53
Операция оказывает влияние на свертывающую систему крови, способствуя
гиперкоагуляции, длительное вынужденное неподвижное положение во время
операции замедляет движение крови в венах, что может приводить к
тромбообразованию. Использование компрессионного трикотажа, а именно чулок,
в несколько раз снижает вероятность тромбоза. Применение эластичных чулок
обеспечивает сужение просвета вен, нормализацию работы клапанов нижней
конечности, ускорению венозного кровотока по направлению к сердечной мышце
за счет компрессии 18–21 мм рт. ст. на мягкие ткани и стенки вен нижних
конечностей [121].
Также проводилась премедикация, необходимая для улучшения условий
анестезии. Она включает в себя введение седативных и снотворных препаратов
вечером накануне операции и введение анальгетиков за 30–40 минут до начала
операции.
Профилактика инфекционных осложнений начиналась за 30–40 минут до
операции внутривенным введением антибактериальных препаратов [133].
2.6.2. Оперативное лечение
Всем пациентам основной группы исследования было выполнено
хирургическое лечение.
Объем операции зависел от распространенности и стадии заболевания,
локализации и размеров опухоли желудка, поражения регионарных лимфоузлов,
общего состояния больных по шкале ECOG, а также наличия сопутствующих
заболеваний.
Пациентам основной группы исследования были выполнены следующие
типы операций: субтотальная дистальная резекция желудка, гастрэктомия,
субтотальная проксимальная резекция желудка. Лимфаденэктомия была
выполнена в объеме «D2+». Объем «D2+» обозначает расширенный объем
https://t.me/med1917
54
удаления лимфатических узлов, включающий в себя не только стандартные
лимфатические области (D2), но также дополнительные узлы (обозначаемые как
«+»), которые могут быть вовлечены в онкологический процесс. Для определения
объема лимфаденэктомии «D2+» при раке желудка учитывалось местонахождение
опухоли.
2.7. Характеристика исследуемых образцов
Для исследования использовались фрагменты опухолевой ткани желудка,
полученные сразу после операции, проведенной пациентам в группе исследования,
также для исследования брали фрагмент слизистой оболочки с отступом не менее
2 см от опухоли. Фрагменты пограничной неопухолевой ткани выбирались на
основании критериев исключения и локализацией зон забора материала,
рекомендованных системой OLGA [154] (Рисунок 6).
Рисунок 6 – Локализация зон забора материала из желудка
Все полученные фрагменты сразу подвергали заморозке и хранили при
температуре -80° С (Рисунки 7, 8, 9).
https://t.me/med1917
55
Рисунок 7 – Желудок после гастрэктомии:
а – серозная поверхность, б – слизистая, вскрытый по большой кривизне желудок,
в красном круге – опухоль, в зеленом круге – нормальная ткань, синяя линия –
отступ от опухоли
Рисунок 8 – Желудок после проксимальной резекции:
а – серозная поверхность, б – слизистая, вскрытый по большой кривизне желудок,
в красном круге – опухоль, в зеленом круге – нормальная ткань, синяя линия –
отступ от опухоли
https://t.me/med1917
56
Рисунок 9 – Желудок после дистальной резекции:
а – серозная поверхность, б – слизистая, вскрытый по большой кривизне желудок,
в красном круге – опухоль, в зеленом круге – нормальная ткань,
синяя линия – отступ от опухоли
Гистологическое исследование проводилось до операции для постановки
диагноза, а также послеоперационного материала (Рисунок 10).
Рисунок 10 – Гистологический микропрепарат, увеличение х100.
Умеренно-дифференцированная тубулярная аденокарцинома.
Окраска гематоксилином и эозином
Для группы контроля были взяты 30 фрагментов нормальной ткани
секционных желудков, которые также были подвержены заморозке при -80
о
С
(Рисунки 11, 12).
https://t.me/med1917
57
Рисунок 11 – Секционный органокомплекс:
а – серозная поверхность невскрытого желудка,
б – слизистая желудка, вскрытый желудок по большой кривизне
Рисунок 12 – Кассеты с фрагментами желудков от разных секционных трупов
Также проводилось гистологическое исследование данных образцов для
исключения злокачественных новообразований и болезней желудка (Рисунок 13).
https://t.me/med1917
58
Рисунок 13 – Гистологический микропрепарат при увеличении х100.
Окраска гематоксилин и эозин.
Слизистая без опухолевого роста и атрофии
В научную работу не включались пациенты, не удовлетворяющие критериям
отбора: основная группа — пациенты с установленным диагнозом «Рак желудка»,
по гистологическому исследованию, отличный от аденокарциномы,
перстневидноклеточный рак, с лимфоидной стромой; также не включались случаи,
когда было тотальное поражение желудка и не было возможности взять слизистую
без опухолевого роста; исключались опухоли небольших размеров, когда не
хватало материала для исследования; если был нарушен протокол забора материала
и преаналитическая подготовка; ранее была проведена химиотерапия, лучевая
терапии на область ЖКТ.
Исключались из группы сравнения образцы с малым объемом материала и
неправильной преаналитической подготовкой, если были морфологические
признаки опухоли, эрозивно-язвенного дефекта; наличие интраэпителиальной
неоплазии/дисплазии; неполная клиническая информация; проведенная ранее
химиотерапия, лучевая терапия.
Для получения достоверных результатов молекулярного исследования,
необходимо учитывать ряд преаналитических факторов, влияющих на качество
биоматериала [32]. Наиболее значимый преаналитический фактор — это
транспортировка биологических образцов, которая требует мониторинга таких
https://t.me/med1917
59
параметров, как температура транспортировки, тип образца, вид упаковки, сезон
года и день транспортировки [96].
Транспортировка осуществлялась в специальном контейнере с сухим льдом.
Все образцы для молекулярных исследований доставлялись в лабораторию в
течение недели после забора.
2.8. Характеристика молекулярных методов исследования
2.8.1. Анализ метилирования генов CDH1, MLH1
2.8.1.1. Выделение геномной ДНК из опухолевого материала
Для получения ДНК ткани опухоли использовали следующий метод
выделения ДНК [102]. Ткань опухоли отмывали в 1 мл PBS, измельчали, а затем
гомогенизировали. Гомогенат переносили в пробирку, затем добавляли
экстракционный буфер (10 мл Tris-HCl, 2 мл ЭДТА, 4 мл NaCl, pH=8,0) и
протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0,5%. Инкубировали 2 часа при
37° С до получения прозрачного раствора. Далее проводили экстракцию ДНК
равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом с
последующим центрифугированием и отбором верхней фазы. Полученный в
результате раствор ДНК перемешивали с 1/10 объема 5 М ацетата натрия, рН 5,3
и ДНК осаждали с помощью 2,5 объемов холодного 96% этанола, образец
выдерживали 30 мин при температуре – 70° С [45].
Пробу центрифугировали при 0° С 15 мин с ускорением 12000 g.
Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8,0.
https://t.me/med1917
60
Выход ДНК составлял 25–50 мкг на 1 г ткани. После полного растворения
ДНК ее концентрацию измеряли (согласно инструкции производителя) на
спектрофлюориметре фирмы «Hoefer» (Германия) и снимали спектр поглощения
в диапазоне от 220 до 320 нм, с целью определения чистоты ДНК. При этом
проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах
волн 230нм/260нм < 0,5, 260нм/280нм >1,8. Максимум поглощения наблюдался в
районе 260 нм [45].
2.8.1.2. Рестрикционный анализ
Для определения аномального метилирования проводилась обработка
опухолевой ДНК соответствующей метилчувствительной рестриктазой Нраll по
следующей схеме: к 1000 нг геномной ДНК добавляли 10 е.а. фермента и 2 мкл
соответствующего 10хбуфера, доводили до 20 мкл дистиллированной водой и
оставляли на 10 часов в термостате при температуре, оптимальной для
используемой рестриктазы [45].
2.8.1.3. Определение аномального метилирования промоторных областей
генов-супрессоров опухолевого роста MLH1, CDH1
Метилирование CpG-ocтровков промоторных областей генов определяли
при помощи метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на
способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не
содержащую модифицированных оснований, и оставлять не гидролизованными
участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для ПЦР использовали
ДНК гидролизированную метилчувствительными рестриктазами Hpall (CCGG).
https://t.me/med1917
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана