Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_212_библиотеки_им_акад_М_И_Перельмана
.pdf
61
Геномую ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед. активной рестриктазы в 10 мкл
инкубационной смеси в течение ночи. Для амплификации использовали 150 нг
гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов
узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, который
содержал не менее трех-четырех Hpall сайтов. В случае модификации цитозинов в
метилцитозин ДНК не расщепляется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле.
В отсутствие метилирования ДНК полностью гидролизуется, и продукт ПЦР не
образуется [3].
С целью исключения ложноотрицательных результатов проводили
мультилокусные ПЦР с двумя парами праймеров: один фрагмент принадлежал
изучаемому гену (MLH1, CDH1), другой служил внутренним контролем (фрагмент
гена МеСР2, не содержащий сайтов узнавания, указанных рестриктаз). ПЦР
проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ
каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1–2 ед.
Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава:
50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl
2
, 10% диметилсульфоксида.
Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95° С в течение
10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95° С —
30 с, отжиг и элонгация при 58–62°С — 2 мин 30 сек. Нуклеотидная
последовательность праймеров и режимы отжига представлены ниже в таблице 9.
Продукты ПЦР разделяли в 8%-ном полиакриламидном геле и окрашивали
нитратом серебра. Наличие ПЦР-фрагмента определенного молекулярного веса,
характерного для исследуемого гена, указывало на наличие аномального
метилирования гена. Случаи, при которых в дорожке выявляли только фрагмент,
соответствующий внутреннему контролю амплификации, определяли, как
отсутствие аномального метилирования изучаемого гена [3].
https://t.me/med1917
62
Таблица 9 – Праймеры для исследуемых генов и режимы отжигов
Исследуемый ген
Нуклеотидная
последовательность праймеров
Условия ПЦР
Размер продукта,
п.н.
Т°отж.
MgCl
2
(mM)
CDH1
F: gccccatctccaaaacgaaca
R: tcctccgtatcactt ccc cca
67°C
3,0
361
MLH1
F: cgc tcg tag lat tcg tgc
R:acc tca gtg cct cgt gct cac gtt
55°C
3,0
501
2.8.2. Анализ экспрессии гена ММР7
2.8.2.1. Выделение РНК
Образец ткани (массой до 100 мг) после оттаивания на льду измельчали в
стеклянном гомогенизаторе в присутствии 660 мкл раствора Д, содержащего 4 М
гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия (рН 7,0), 0,5% саркозил и 0,1 М β-
меркаптоэтанол. К полученному гомогенату добавляли 60 мкл 2 М ацетата натрия
(рН 4,0), быстро перемешивали на вихревом смесителе, вносили 720 мкл смеси
фенол-хлороформ с изоамиловым спиртом (5:1) и вновь перемешивали на
вихревом смесителе в течение 10 с. Пробирки помещали на лед и инкубировали в
течение 15 мин. По окончании инкубации образцы центрифугировали при 10000 g
в течение 15 мин при +4°С. Водную фазу аккуратно отбирали, не затрагивая
органическую фазу и интерфазу, переносили в чистую пробирку и проводили
повторную экстракцию равным объемом смеси фенол-хлороформ с изоамиловым
спиртом (5:1). К отобранной водной фазе добавляли равный объем смеси
хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), быстро перемешивали на вихревом
смесителе и центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин при +4°С. Экстракцию
смесью хлороформ-изоамиловый спирт проводили дважды. Далее к водной фазе
добавляли 2,5 объема холодного 96% этанола, перемешивали на вихревом
https://t.me/med1917
63
смесителе и оставляли на ночь при -20°С для осаждения. Далее образцы
центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин при +4°С, надосадочную
жидкость сливали, а осадок промывали дважды холодным 70% этанолом. После
каждого промывания образцы центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин при
+4°С. Далее осадки высушивали и растворяли в стерильной деионизованной воде,
обработанной ДЭПК (0,1% раствор) и содержащей 0,1 мМ ЭДТА. Растворы РНК
хранили при -70° С [6].
Концентрацию полученных растворов РНК измеряли на спектрофотометре
по поглощению при длине волны 260 нм на основе зависимости: 1 оптическая
единица соответствует 40 мкг в 1 мл РНК. Чистоту РНК определяли по
отношениям поглощений при длинах волн 260, 280, 230 нм. Качество РНК, считали
удовлетворительным, если оно соответствовало отношению А
260
/А
280
<1,8 и
отношению А
260
/А
230
>2.
Для оценки нативности (целостности) выделенной РНК проводили анализ 1
мкг каждого образца электрофорезом в 1,5% агарозном геле, содержащем
бромистый этидий (0,5 мкг на 1 мл геля), в 1xTBE (pH 8,3). Целостность РНК
оценивали визуально при облучении геля на УФ-трансиллюминаторе (λ 300 им) по
наличию двух субъединиц (28S и 18S) рибосомальной РНК [6].
2.8.2.2. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
Анализ экспрессии исследуемых генов проводили с помощью полимеразной
цепной реакции с обратной транскрипцией.
Обратную транскрипцию (синтез кДНК) проводили в реакционной смеси
конечным объемом 20 мкл, приготовленной на обработанной ДНK
деионизованной стерильной воде и содержащей 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8); 16,6 мМ
(NH,)
2
S0
4
; 0,01% (в/о) Tween 20; 4 мМ MgCl
2
; 1 мМ каждого dNTP; 3,2 мкг
гексамерных праймеров со случайной последовательностью; 10 мМ
https://t.me/med1917
64
дитиотрейтола; 10 ед. ингибитора рибонуклеаз; 30 ед. рекомбинантной обратной
транскриптазы M-MLV; 1 мкг тотальной РНК. Смесь инкубировали при 42°С в
течение 1 часа. Реакцию останавливали путем тепловой инактивации обратной
транскриптазы, выдерживая смесь при 94°С в течение 10 мин.
Полученную кДНК амплифицировали методом ПЦР с использованием
олигонуклеотидных праймеров, специфичных первичной структуре кДНК
исследуемых генов [6].
Нуклеотидные последовательности генов были взяты из базы данных
GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Проверку геноспецифичности праймеров
осуществляли при помощи программ OligoVer.6.67 и VectorNTI. Места посадки
праймеров для амплификации кДНК должны находиться в разных экзонах, тогда
они будут специфически гибридизироваться с кДНК даже в присутствии в
препарате примеси геномной ДНК, а длина продукта ПЦР, амплифицированного с
примесной геномной ДНК, будет значительно больше длины ожидаемого продукта
ПЦР, амплифицированного с кДНК.
ПЦР проводили в реакционной смеси конечным объемом 50 мкл,
содержащей 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8); 16,6 мМ (NH
4
)
2
S0
4
; 0,01% (в/о) Tween 20;
1,5 мМ MgCl; 0,2 мМ каждого dNTP; 15 мкмоль каждого из пары праймеров; 2,5
сд. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы; 5 мкл реакционной ОТ-смеси,
содержащей кДНК [6].
Продукты полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
разделяли электрофорезом в 1,5% агарозных гелях, содержащих 0,5 мкг/мл
бромистого этидия. В качестве электрофорезного буфера использовали lxTBE. При
анализе экспрессии гена электрофорез проводили в 1,8% агарозном геле с
последующей окраской геля раствором красителя SYBRGreen I (разведенного
деионизованной водой 1:10000) в течение 40 мин при комнатной температуре и в
темноте. Образцы вносили в лунки геля в объеме 10 мкл.
Гели снимали на цифровую фотокамеру и проводили анализ изображения на
компьютере с помощью программ ImageJ 1.351 и QuantyOnev.4.4.0. Уровни
экспрессии исследуемого гена нормализовали по отношению к уровню экспрессии
https://t.me/med1917
65
конститутивного гена (β3-актина), который принимали за единицу. Уровень
экспрессии исследуемого гена ниже 0,15 отн. ед. расценивали как очень низкий, от
0,15 до 0,29 отн. ед. - низкий, от 0,3 до 0,54 отн. ед. - средний, от 0,55 до 0,99 отн.
ед. - высокий, выше 1 отн. ед. - очень высокий (гиперэкспрессия) [6].
2.8.3. Приборы, реактивы и компьютерные программы
Для определения молекулярно-генетических показателей использовали
различные приборы, такие как центрифуга 5415, центрифуга с охлаждением 5417R
(«Eppendorf», Германия), вихревой смеситель VF1 Electronic, шейкер IKA-
VIBRAX-VXR («JankeandKunkellKA-Labortechnik», Германия), весы
аналитические и лабораторные («Sartorius», Германия), спектрофотометр
GeneQuantpro, прибор для горизонтального электрофореза GNA-100
(«PharmaciaBiotech», Швеция), амплификатор 2720 («AppliedBiosystems», США),
магнитная мешалка MS-3000 («Biosan», Латвия), УФ-бокс («Biokom», Россия),
прибор для вертикального электрофореза Mini-PROTEIN 3 cell («Bio-Rad», США),
УФ- трансиллюминатор 2011 Macrovue («LKB», Швеция), рН-метр pH 211
(«HANNAInstruments», Германия), спектрофотометр TitertekMultiskanPLUS
(«Labsystem», Финляндия), спектрофлуориметре («Hoefer», Германия), цифровая
камера DC 120 ZOOM (США) [6].
2.8.3.1. Реактивы для исследований
В работе были использованы следующие реактивы: акриламид, N, N'-
метиленбисакриламид, борная кислота, краситель OrangeG, детергент 3-[(3-
холамидопропил)-диэтиламмоний]-1-пропансульфонат (CHAPS), динатриевая
https://t.me/med1917
66
соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1 М раствор магния хлорида,
ß-меркаптоэтанол, персульфат аммония (ПСА), N, N, N’, N'-тетраметилендиамин
(ТЕМЕД), Трис, Трис-HС1, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), фосфатно-
солевой буфер (PBS) (pH 7,4), (этилендиокси)-диэтилендинитрилотетрауксусная
кислота (EGTA), бычий сывороточный альбумин (БСА), смесь фенола, хлороформа
и изоамилового спирта (125:24:1), хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), саркозил,
натрия ацетат, диэтилпирокарбонат (ДЭПК), агароза (для электрофореза),
дитиотрейтол, («Sigma», США), ингибитор РНКаз RiboLock, обратная транскрипт
аза RevertAidHMinusM-MuLV, маркер молекулярной массы O'RangeRuler 100
bpDNALadder («Fermentas», Литва), 10хбуфер для ПЦР, 50 мМ раствор магния
хлорида, дезоксирибопуклеозидтрифосфаты (dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
Taq ДНК-полимсраза («Диалат», Россия), краситель CoomassieBrilliantBlue G-250,
глицерин, натрия цитрат («Fluka», Швейцария), 85% ортофосфорная кислота
(«Merck», Германия), раствор бромистого этидия («Amresco», США), краситель
SYBRGreení, краситель SYBRGreenll, краситель SYBRGold («MolecularProbes»,
США), гуанидинтиоцианат («ICNBiomedicals», США), олигонуклеотидные ДНК-
праймеры («Синтол», Россия) [6].
2.8.3.2. Компьютерные программы
IrnageJ 1.351 («National Institute of Health», США) [6], QuantyOnev.4.4.0 («Bio-
Rad», США), OligoVer.6.67 («Molecular Biology Insights», CILIA) [6], Vector NTI
v.7.1 («InforMax, Inc.», США), MicrosoftOffice-2020.
https://t.me/med1917
67
2.9. Статистическая обработка результатов исследования
Полученные результаты подвергались статистическому анализу при помощи
программы MS EXCEL, STATISTICA 7.0 и языка программирования Python и его
прикладных библиотек, в частности numpy, pandas, scikit-learn, CatBoost, scipy,
seaborn, matplotlib и другие.
Показатели количественные представлены в виде X ± m, где Х – среднее
значение; m – стандартная ошибка среднего. Для качественных показателей,
отражающих признаки, указывалось абсолютное число и относительная величина
в процентах (%).
Так как в работе присутствовали выборки малого объема, достоверность
отличий изучаемых данных проверяли с помощью непараметрических критериев:
− U-критерия Манна–Уитни (попарные сравнения независимых
совокупностей показателей);
− W-критерия Уилкоксона (попарное сравнение зависимых совокупностей
показателей);
− точного теста Фишера (для качественных признаков);
− коэффициент корреляции Спирмана (для определения существования
корреляций между параметрами);
− различия считали достоверными при p<0,05.
https://t.me/med1917
68
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Всем 80 пациентам, вошедшим в клиническое исследование, было
выполнено радикальное оперативное вмешательство: гастрэктомия, субтотальная
дистальная или проксимальная резекция желудка с гистологически
подтвержденными чистыми краями резекции (R0) и во всех случаях была
выполнена лимфодиссекция « «D2+» ».
Из 80 проанализированных больных гастрэктомия была выполнена 55% (44
человека), резекция желудка была выполнена 45% (36 человек). У всех пациентов
гистологическим исследованием был подтвержден рак желудка диффузного типа.
Для группы сравнения были взяты образцы 30 секционных желудков, у которых
при гистологическом исследовании не было обнаружено опухолевых клеток.
Гистологический тип опухоли распределился следующим образом: 14
пациентов с аденокарциномой желудка с перстневидными клетками, у 31 пациента
низкодифференцированная аденокарцинома, у 35 умеренно-дифференцированная
аденокарцинома.
I стадия (рТ1-2N0М0) была диагностирована у 11 пациентов (13,75%), IIА
стадия (рТ1-2N1-3М0) – у 15 больных (18,75%), IIB стадия (рТ3-4аN0М0) – у 27
пациентов (33,75%), III стадия (рТ3-4аN1-3М0) – у 27 больных (33,75%).
Пациенты с IVА стадией распространения опухолевого процесса
(рТ4bNлюбоеМ0) и с IVB (рТлюбоеNлюбоеМ1) были исключены из клинического
исследования.
Согласно результатам гистологических исследований всех удаленных
желудков пациентов, установлено: размеры опухоли до 2,0 см отмечены у 12
пациентов (15%), в диапазоне от 2,0 до 3,0 см – у 29 пациентов (36,2%), от 3 до 7
см – у 38 пациентов (47,5%) и более 7 см у 1 пациента (1,25%).
В группе исследования и контроля изучены результаты изменений
молекулярных факторов каждого по отдельности CDH, MLH1, MMP7, а также в
комбинациях, взаимосвязь с клиническими показателями.
https://t.me/med1917
69
3.1. Аномальное метилирование гена CDH1 у больных раком желудка
В образцах опухолевой ткани, полученных у больных раком желудка,
аномальное метилирование гена CDH1 было выявлено в 39/80 (48,75%) случаев, в
образцах неопухолевой ткани желудка — в 6/80 (7,5%) случаев. Частота случаев
аномального метилирования в опухоли была достоверно выше, чем в образцах
прилежащей к опухоли морфологически неизмененной ткани (p<0,001), а также
достоверно выше, чем в образцах группы сравнения (секционные образцы
желудков без опухолевых клеток) (p<0,05).
3.1.1. Аномальное метилирование гена CDH1 и половая принадлежность
В нашем исследовании мы рассмотрели, как распределено аномальное
метилирование гена CDH1 в опухолевой и неопухолевой ткани у мужчин и женщин
(Таблица 10). Из полученных результатов можно сделать вывод, что аномальное
метилирование гена CDH1 имеет практически идентичное распределение для
мужчин и для женщин, как в случае пациентов из группы исследования опухолевой
ткани, так и неопухолевой ткани у пациентов с раком желудка.
Таблица 10 – Распределение метилирования гена CDH1 в опухолевой и
неопухолевой ткани у больных раком желудка (n=80) в зависимости от пола
Образцы ткани и
пол пациентов
Характер метилирования гена CDH1
Количе
ство
случаев
Наличие
аномального
метилирования в
исследованных
образцах ткани
Отсутствие
аномального
метилирования в
исследованных
образцах ткани
Уровень
значимости
отличий по
критерию
Фишера
Опухолевая ткань
мужчины
женщины
50
30
25 (50,0%)
14 (46,7%)
25 (50,0%)
16 (53,3%)
0.04557
https://t.me/med1917
70
Продолжение таблицы 10
Неопухолевая ткань
мужчины
женщины
50
30
3 (3,0%)
3 (10,0%)
47 (94,0%)
27 (90,0%)
p<0,05
3.1.2. Аномальное метилирование гена CDH1 и возраст
Мы проанализировали, как распределен возраст в зависимости от
метилирования гена CDH1 для опухолевой и неопухолевой ткани желудка у
пациентов с раком желудка (Рисунки 14, 15, Таблицы 11, 12).
Изучив фрагменты из опухолевой ткани желудка, мы сделали вывод о том,
что в группе без аномального метилирования гена CDH1 пациенты являются более
возрастными (средний возраст 66 лет, медиана по возрасту составила 68 лет) по
сравнению с группой с диагностированным аномальным метилированием гена
CDH1 (средний возраст 53 года, медиана по возрасту составила 53 года).
Рисунок 14 – Распределение возраста пациентов
в зависимости от метилирования гена CDH1 (опухолевая ткань)
https://t.me/med1917
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана