Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Наследственные болезни. Полный справочник
.pdf
предварительно синтезировать пару так называемых праймеров, которые представляют собой короткие последовательности нуклеотидов, комплементарных последовательностям размножаемого фрагмента ДНК.
После разделения на две нити изучаемого фрагмента ДНК
в реакционную смесь добавляют вещества, которые комплементарно связываются с соответствующими участками этих
нитей. Затем следует разделение вновь образованных ДНК цепей с помощью температурной обработки. К вновь образованным нитям фрагмента ДНК снова достраивают комплементарные цепи с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Так может повторяться до бесконечности или до исчерпания свободных нуклеотидов в реакционной смеси, но обычно
20—30 циклов хватает, чтобы получить достаточное количество
ДНК изучаемого фрагмента для любых последующих манипуляций с этим фрагментом.
МЕТОДЫ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ ДНК
Одна из таких манипуляций, может быть, самая важная
в программе «Геном человека», заключается в определении
последовательности нуклеотидов (секвенировании). Именно данная процедура позволяет, в частности, расшифровать
структуру гена, установить природу мутаций в нем, определить
аминокислотную последовательность в молекуле белка, кодируемого этим геном.
Наиболее распространенным методом, который используют для секвенирования ДНК, является метод, разработанный Сэнгером. Этот метод называется еще дидезокси-методом,
поскольку в нем применяют дидезоксинуклеотиды для терминации (обрыва) синтеза цепи ДНК. В результате дидезоксинуклеотид, присоединившись к растущей цепи ДНК, этот синтез
прекращает. Чтобы осуществить изучение фрагмента ДНК, его
сначала разделяют на две нити.
Поскольку присоединение дидезоксинуклеотида происходит случайно, так как в реакционной смеси есть его нормальный аналог, то в каждой пробирке образуется набор цепей разной длины.
44
Реализация программы «Геном человека» потребовала разработки более быстрых методов изучения ДНК. Были разработаны
на основе только что изложенного принципа методы автоматического определения, в которых используют мечение флюоресцентной или хемилюминесцентной меткой, выявляемой специальной
лазерной системой обнаружения метки во время электрофореза.
Сигналы из лазерной системы детекции поступают в компьютер,
где на основе специальной программы они интерпретируются
в терминах нуклеотидов, обозначаемых пиками разного цвета на
мониторе компьютера. Автоматические секвенаторы (устройства, благодаря которым распознается молекула ДНК) позволяют ускорить получение результатов изучения ДНК в десятки или
даже сотни раз по сравнению с ручным сиквенсом.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ПРОГРАММЫ
«ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА»
Когда создавалась программа «Геном человека», были определены три основные цели этой программы: создание точной
генетической карты, создание физической карты генома человека и сиквенс (определение) всего генома человека.
Создание генетической карты генома
Точную генетическую карту можно было создать при выполнении двух условий: обнаружении в геноме большого количества полиморфных (многообразных) генетических маркеров
и наличии достаточного количества семей для анализа сцепления между этими маркерами и установления их взаимного
расположения. Проблема генетических маркеров была разрешена после обнаружения различных типов ДНК-полиморфизмов. В порядке их введения в генетический анализ первым был
обнаружен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
(сокращенно ПДРФ), затем полиморфизм, обусловленный
варьирующим числом тандемных повторов (VNTR- полиморфизм). Каждый из этих видов имеет свои преимущества и недостатки, но все вместе они позволяют маркировать геном человека с очень высокой плотностью.
Даже первые 4 типа полиморфизмов позволили создать
генетическую картину генома человека. Установить взаимное
45
расположение маркеров позволила коллекция, или банк, линий клеток, полученных от всех членов нескольких сотен семей, которые включали не менее трех поколений. Этот банк
клеточных линий был создан во Франции для изучения полиморфизма в системе HLA и очень пригодился для генетического картирования генома человека. После того как в каждой
хромосоме было картировано и установлено взаимное расположение 10—15 полиморфных маркеров, работа с последующими маркерами проводилась на материале, полученном от
членов этих семей.
Создание физической карты генома
Для того чтобы создать физическую карту генома, клонированные фрагменты генома человека также необходимо было
маркировать. Это было сделано с помощью коротких сиквенсов (участков ДНК с уже определенной последовательностью),
так называемых STS, хромосомная локализация которых точно известна. STS легко идентифицируются с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Получено более 50 000 STS,
разбросанных по геному, и во время физического картирования, когда устанавливается взаимное расположение ДНК
фрагментов из геномных библиотек, эти STS используют как
маркеры перекрывающихся сегментов ДНК.
Определение генома человека
Ниже будут кратко изложены основные результаты «чернового варианта» генома человека, которые, как уже отмечалось
выше, были опубликованы в февральском номере журнала
«Nature» за 2001 г.
Понятие «черновой вариант» прежде всего относится к тому
факту, что определение генома продолжается. В связи с этим
на настоящий момент изучения невозможно расположить по
порядку и сориентировать многие мелкие секвенированные
последовательности. Неполнота сиквенса, естественно, пока
создает проблемы для идентификации генов наследственных
болезней, уникальных генов и других генетических структур.
Следует отметить, что за последнюю четверть XX в. были
секвенированы геномы 599 вирусов и других как микроорганизмов, так и макроорганизмов (животных). Опыт, накопленный в результате этой работы, был в полной мере использован
при секвенировании генома человека.
Стратегия изучения генома человека в общественном проекте включала в себя получение генетической и физической кар-
46
ты генома человека, последующее введение в эти карты результатов сиквенса отдельных клонов геномной ДНК (стратегия
сиквенса «клона за клоном»). Физическая карта человеческого
генома имеет клональную основу, которая была разработана
ученым Olson в 1981 г. Подход заключается в следующем. Геном
разрезался на сегменты с помощью частичного переваривания
ферментами — специфическими эндонуклеазами. Эти большие сегменты ДНК помещали в искусственные бактериальные
хромосомы (ВАС) и вводили в бактерии, где они копировались
при каждом делении бактерии. В результате образовались клоны идентичных молекул ДНК. Таких клонов, перекрывающих
геном человека, должно быть примерно 20 000.
Кроме того, для установления порядка клонов использовали ранее разработанные карты STS. В результате получилась
физическая карта генома. Отдельные ВАС-клоны разрезались
на фрагменты и клонировались. Полученные в результате клонирования фрагментов субклоны изучали. Каждый раз определялось большое число одинаковых субклонов, для уверенности
в том, что каждый фрагмент оригинального ВАС-клона проанализирован несколько раз и при этом не допущено ошибок.
Сиквенсы отдельных фрагментов объединяли с тем, чтобы получить последовательность нуклеотидов в каждом исходном
ВАС-клоне. Наконец, сиквенс всего генома собирали путем
соединения сиквенсов набора ВАС, перекрывающих весь геном. Созданная таким образом карта сиквенса генома человека имеет более 1000 разрывов. Это может быть связано с рядом
причин, в частности с тем, что исходные ВАС-клоны не перекрывали весь геном, а также перекрывание между клонами
было пропущено из-за присутствия крупных повторов в геноме. Созданная в результате реализации проекта карта сиквенса
включает последовательности, содержащие в среднем несколько миллионов пар нуклеотидов в длину. Сегменты такой длины
достаточны, чтобы карту, основанную на клонах, наложить на
другие карты с меньшим разрешением. Положение на генетической карте секвенированных последовательностей определяли также относительно картированных STS.
В общем секвенировано и собрано с помощью компьютерных программ в протяженные участки около 90% эухроматиновых районов генома.
Несмотря на неполноту сиквенса, целый ряд полученных
с его помощью результатов уже сейчас представляет несомнен-
47
ный интерес. Это относится в первую очередь к углублению
представлений об организации генома человека.
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ
ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА
Только 1,1—1,4% всего секвенированного генома состав-
ляют последовательности, кодирующие белки.
Одним из наиболее важных разделов программы «Геном
человека» является обнаружение генов в секвенированных
по следовательностях генома. Положение многих генов определено путем соотнесения сиквенсов мРНК с геномным сиквенсом, для остальных генов локализацию устанавливают с помощью специальных компьютерных программ.
Поиск генов в сиквенсе ведут также с помощью специального, так называемого ортологического подхода, выявления
последовательностей нуклеотидов, похожих на последовательности генов у других видов. Это делают, используя компьютерную программу BLAST, по геномным или мРНК-сиквенсам. Еще один путь поиска генов — это выявление паралогов
(членов семейства, возникших в результате дупликации генов).
Использованы также и другие методы поиска генов в секвенированной ДНК человека.
Общественный проект «Геном человека» дает оценку белоккодирующих генов в 31 000, в настоящее время выявлено по результатам сиквенса менее 20 000 генов. Среди них идентифицировано
740 генов для РНК, которая не кодирует белки, но, вероятно, таких генов будет обнаружено значительно больше. У дрожжей кодирующих генов 6000, у дрозофилы — 13 000, у растений — 26 000.
Поэтому вопрос, за счет чего обеспечивается сложность организации человека по сравнению с другими, более просто организованными организмами, остается открытым.
Плотность генов в человеческом геноме существенно ниже,
чем у других видов. К сожалению, методы компьютерного предсказания генов по результатам сиквенса еще очень неточны.
Только 94 из 1278 семейств белков в геноме человека свойственны лишь позвоночным. Основные различия между человеком и дрожжами или мухой заключаются в сложности
48
организации белков человека, которая проявляется большим
числом доменов на белок, а также новыми комбинациями доменов. Некоторое количество генов получено человеком, повидимому, прямо от бактерий в результате так называемого
горизонтального переноса генов. Очевидно, бактериальный
геном мог служить прямым донором генов для позвоночных.
У позвоночных наблюдаются усовершенствование и появление двух типов генов, специфичных для позвоночных, таких как нейрональные гены, гены свертывания крови и гены
приобретенного иммунного ответа, с одной стороны, и генов,
обеспечивающих увеличение точности контроля внутриклеточных процессов (гены для внутри- и межклеточных сигналов, программированной клеточной гибели и контроля транскрипции генов), — с другой.
Результаты сиквенса генома человека стимулировали выявление однонуклеотидного полиморфизма (ОНП), который
предполагают использовать для картирования генов предрасположенности к частым мультифакториальным заболеваниям.
Обнаружение генов наследственных заболеваний значительно облегчилось с использованием чернового сиквенса, так
как он доступен всем исследователям благодаря Интернету.
Возможна идентификация генов-кандидатов по их положению в геноме с помощью компьютерных программ прямо по
базе данных сиквенса с последующим скринингом на мутации,
дополненным информацией о структуре гена. Таким образом
найдено уже более 30 генов наследственных болезней.
Предполагают, что сиквенс будет завершен в течение относительно короткого периода времени. Особое внимание будет
обращено не только на создание более совершенных компьютерных программ идентификации генов, но и их регуляторных
областей. По-видимому, успех двух последних направлений
исследований будет зависеть от успешности сиквенса геномов
других высших животных. На основе сиквенса генома человека
будет создан каталог генетических вариаций у человека.
ГЛАВА 2. ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА
И ИХ СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
СТРУКТУРА ХРОМОСОМ
В ядре каждой соматической клетки организма человека
содержится 46 хромосом. Набор хромосом каждого индивидуума, как нормальный, так и патологический, называется кариотипом. Из 46 хромосом, составляющих хромосомный набор
человека, 44 или 22 пары представляют аутосомные хромосомы, последняя пара — половые хромосомы. У женщин конституция половых хромосом в норме представлена двумя хромосомами Х, а у мужчин — хромосомами Х и У. Во всех парах
хромосом, как аутосомных, так и половых, одна из хромосом
получена от отца, а вторая — от матери. Хромосомы одной
пары называются гомологами, или гомологичными хромосомами. В половых клетках (сперматозоидах и яйцеклетках)
содержится гаплоидный набор хромосом, т. е. 23 хромосомы.
Сперматозоиды делятся на два типа, в зависимости от того, содержат они хромосому X или Y. Все яйцеклетки в норме содержат только хромосому X.
Хромосомы хорошо видны после специальной окраски во
время деления клеток, когда хромосомы максимально спирализованы. При этом в каждой хромосоме выявляется перетяжка, которая называется центромерой. Центромера делит хромосому на короткое плечо (обозначается буквой «р») и длинное
плечо (обозначается буквой «q»). Центромера определяет движение хромосомы во время клеточного деления. По положению центромеры хромосомы классифицируют на несколько
групп. Если центромера располагается посредине хромосомы,
то такая хромосома называется метацентрической, если центромера располагается ближе к одному из концов хромосомы,
50
то ее называют акроцентрической. Некоторые акроцентрические хромосомы имеют так называемые спутники, которые
в неделящейся клетке формируют ядрышки. Ядрышки содержат многочисленные копии рРНК. Кроме того, различают субметацентрические хромосомы, когда центромера расположена
не посредине хромосомы, а несколько сдвинута к одному из
концов, но не столь значительно, как в акроцентрических хромосомах.
Концы каждого плеча хромосомы называют теломерами.
Установлено, что теломеры играют важную роль в сохранении стабильности хромосом. В теломерах содержится большое
число повторов последовательности нуклеотидов, так называемых тандемных повторов. В норме во время клеточного деления происходит уменьшение числа этих повторов в теломерах.
Однако каждый раз они достраиваются с помощью специального фермента, который называют теломеразой. Уменьшение
активности этого фермента приводит к укорочению теломер,
что, как полагают, является причиной гибели клеток, а в норме
сопровождает старение.
До появления методов дифференциальной окраски хромосом их различали по длине, положению центромеры и наличию
спутников. Выделяли 5 групп — от А до G, которые достаточно
хорошо разделялись друг от друга. Однако внутри групп дифференциация хромосом представляла определенные трудности. Это изменилось, когда были разработаны методы дифференциальной окраски хромосом. Заметный вклад в разработку
этих методов внес отечественный ученый А. Ф. Захаров.
Препараты хромосом можно приготовить из любых ядерных
делящихся соматических клеток. Чаще их получают для лимфоцитов периферической крови. Лимфоциты выделяют из венозной крови и переносят в небольшое количество питательной
среды с добавлением фитогемагглютинина. Фитогемагглютинин
стимулирует деление лимфоцитов. Затем клетки культивируются
при 37 °С в течение трех дней, после чего к культуре лимфоцитов
добавляют колхицин, который останавливает деление клеток на
стадии метафазы, когда хромосомы наиболее конденсированы.
Клетки переносят на предметное стекло, к ним добавляют гипотонический раствор NaCl. Клетки лопаются, и хромосомы вытекают из них. Далее следует фиксация и окраска хромосом.
В последние годы появились новые методы визуализации хромосом или их участков. Методы представляют собой
51
комбинацию из цитогенетических и молекулярно-генетических методов. Все они основаны на способности однонитевой
ДНК соединяться с комплементарной последовательностью
геномной ДНК, локализованной в хромосомах. Однонитевая
ДНК, которая в этом случае является ДНК-зондом, нагружена специальным красителем, и после соединения с геномной
ДНК зонд легко выявляется на хромосомном препарате (так
называемая метафазная пластинка) при его микроскопировании в ультрафиолетовом свете. Этот метод получил название
«флюо ресцентной гибридизации in situ».
Все методы окраски хромосом позволяют выявлять их
структурную организацию, которая выражается в появлении
поперечной исчерченности, разной в разных хромосомах,
а также некоторых других деталей.
Несколько различных методов окраски используют для идентификации отдельных хромосом. Наиболее часто используемым
является метод с окраской хромосом красителем Гимза. Препараты хромосом при этом способе окраски сначала обрабатывают
трипсином, который удаляет белки, содержащиеся в хромосоме.
Затем на препарат наносят краситель Гимза, который выявляет
в хромосомах характерный для каждой из них рисунок из светлых и темных сегментов. Обычно на гаплоидный набор можно
насчитать до 400 сегментов. Если хромосомы перед окраской
Гимза сначала нагревают, то рисунок полос сохраняется, но их
цвет меняется на противоположный, т. е. темные полосы становятся светлыми, и наоборот. Этот метод окраски называется обратным бэндингом, или R-методом. Если до применения красителя Гимза препарат хромосом сначала обрабатывают кислотой,
а затем щелочью, то окрашиваются преимущественно центромеры и другие районы, богатые гетерохроматином, содержащие
высокоповторяющиеся последовательности ДНК. Разработаны
также высокоразрешающие методы дифференциальной окра ски
хромосом. Они позволяют выявлять до 800 поперечных полос на
гаплоидный набор хромосом.
Поперечные полоски, выявляемые при дифференциальной
окраске, называют сегментами. Характер расположения сегментов по длине хромосом различен, что позволяет проводить
достаточно точную идентификацию каждой хромосомы в кариотипе. Разработана форма представления идеального кариотипа с типичным рисунком полос на каждой хромосоме. Такая
форма называется идеограммой.
52
Для удобства описания кариотипа предложена специальная
система, в которой прежде всего различают плечи хромосомы:
р — короткое и q — длинное, — и центромеру — cen. Каждое
плечо делится на области, причем счет идет от центромеры.
Каждую область подразделяют на сегменты, счет которых также
начинается с сегмента, расположенного ближе к центромере.
Материал, из которого построены хромосомы, называется
хроматином. Он состоит из ДНК и окружающих ее гистонов
и других белков. Та часть хроматина, которая слабо окрашивается специальными красителями для хромосом, называется
эухроматином, а та, которая окрашивается интенсивно, — гетерохроматином. Считают, что эухроматиновые районы хромосом содержат активно экспрессирующиеся гены, гетерохроматиновые районы, напротив, включают неактивные гены
и неэкспрессирующиеся последовательности ДНК.
Молекулярная структура хромосом достаточно сложна.
Функция этой структуры заключается в такой упаковке ДНК,
чтобы она поместилась в хромосоме. Если бы геномная ДНК
была представлена в виде обычной двунитевой спирали, то она
протянулась бы на 2 м. При упаковке ДНК используется все тот
же принцип спирали, но он представлен несколькими уровнями. В результате сложной упаковки исходная длина молекулы
ДНК уменьшается в 10 000 раз.
КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ
Соматическая клетка может находиться в двух состояниях — интерфазе и делении. Смену этих состояний называют клеточным циклом. Во время интерфазы клетка удваивает
свое содержимое, включая хромосомы. Прекратившие деление
клетки находятся в особом состоянии этой фазы — G0. Интерфазу принято делить на три стадии: G1, S и G2. На стадии G1
в клетке синтезируется РНК, белки, и осуществляется весь
сложный комплекс метаболизма. На стадии S реплицируется
ДНК. В G2-стадии исправляются ошибки, допущенные при
репликации ДНК, и происходят другие процессы, подготавливающие клетку к митозу. В это время каждая хромосома уже
представлена двумя копиями, которые называют сестрински-
53
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]