Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Наследственные болезни. Полный справочник
.pdf
вающегося организма не позволяет дифференцироваться мужскому полу.
Относительно недавно было показано, что в дифференциации мужского пола особая роль принадлежит гену SRY (сокращение расшифровывается как «пол-определяющая область
хромосо мы Y»). Мутации в гене SRY приводят к тому, что у лиц
с кариотипом XY развивается женский фенотип. При введении
гена SRY в клетки эмбриона мыши женского пола происходит
трансформация пола и у новорожденного мышонка пол оказывается мужским.
Эмбриональные гонады могут дифференцироваться в яички
и яичники. Если эмбриональные гонады находятся у плода мужского пола, то ген SRY, локализованный в Y-хромосоме, продуцирует фактор, детерминирующий дифференцировку эмбриональных яичек. Эмбриональные яички секретируют гормоны,
определяющие развитие мужских половых органов. В отсутствие
гена SRY эмбриональные гонады дифференцируются в яичник.
Установлено, что, кроме гена SRY, несколько аутосомных
генов играют определенную роль в мужской дифференциации
пола. Один из них — ген супрессор опухоли Вильмса, коди рует
фактор транскрипции, связывающийся со специфическими
ДНК-последовательностями.
Точковые мутации в этом гене иногда приводят к формированию гонадно противоположного пола. Второй ген такого же
типа — SOX9.
Мутации в гене SOX9 вызывают дисплазию, при которой у индивидуумов 46,XY фенотипически развивается женский пол.
Нет сомнений в том, что современные представления о генетическом контроле становления пола далеко не совершенны.
Это относится не только к тому, какие гены вовлекаются в данный процесс, но и к тому, на каких стадиях развития и в каких
тканях эти гены проявляются.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ МОНОГЕННЫХ
НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
До недавнего времени диагностика моногенных наследственных болезней основывалась исключительно на особен-
34
ностях фенотипического проявления заболевания. Только при
некоторых наследственных болезнях обмена веществ диагностику проводили, определяя уровень измененных метаболитов
или даже измененного фермента. Фенотипический уровень
диагностики иногда был достаточным для решения некоторых
проблем клинической генетики, например для выбора тактики
лечения клинически сходных, но генетически весьма гетерогенных заболеваний, таких как нервно-мышечные заболевания или пигментная дистрофия сетчатки.
Также следует выделить, что и лечение в этих случаях было
чисто симптоматическим. Достижения в области молекулярной генетики позволяют для многих моногенных заболеваний
перевести диагностику на уровень определения изменений
в генотипе. Из предшествующего текста главы ясно следует, что
такая ДНК-диагностика в некоторых случаях принци пиально
меняет представления о классификации наследственных болезней и открывает новые возможности для патогенетического
лечения наследственных болезней. Кроме того, ДНК-диагностика является мощным инструментом для пренатальной диагностики наследственных болезней.
Все методы ДНК-диагностики наследственных болезней
можно разделить на прямые и непрямые. Как прямые, так
и непрямые методы ДНК-диагностики весьма разнообразны.
Прямые методы анализа имеют ряд преимуществ. Для них нет
необходимости изучать других членов семьи или учитывать
возможные рекомбинации в гене. Нет также проблемы недостаточной информативности генетических маркеров.
Основным непрямым методом ДНК-диагностики наследственных болезней является анализ сцепления с использованием в качестве генетических маркеров для поиска сцепления
с геном заболевания разнообразных ДНК-полиморфизмов.
Анализ сцепления можно применить для любого картированного гена наследственного заболевания. Он не требует изучения
тонкой структуры мутантного гена. ДНК-маркеры позволяют
установить, унаследовал ли индивид хромосому, несущую мутантный ген, или нет. Метод сцепления имеет ряд недостатков,
среди которых — необходимость исследования большого числа
родственников больного для того, чтобы установить, с какими
аллелями и каким маркером сцеплен ген заболевания; необходимость учитывать возможность кроссинговера (перекреста)
между ДНК-маркерами и геном заболевания, что не позволяет
35
быть уверенным на 100% в диагностике заболевания. Последнее достигается при использовании прямых методов.
Фенотипические признаки, с которыми имеет дело медицинская генетика, это наследственные болезни и их симптомы.
Между симптомами наследственного заболевания и изменением одного белка в результате мутации в каком-то конкретном
гене дистанция огромного размера. Мутантный белок, продукт
мутантного гена, должен каким-то образом взаимодействовать
с сотнями, если не с тысячами других белков, кодируемых другими генами, чтобы изменился какой-то нормальный признак
или появился патологический признак. Кроме того, продукты
генов, участвующие в становлении любого фенотипического
признака, могут взаимодействовать с факторами окружающей
среды и модифицироваться ими.
Моногенные наследственные болезни наследуются согласно правилам, установленным Г. Менделем. Различают
аутосомно-доминантные и аутосомно-рецессивные наследственные болезни. Родословные семей, в которых наследуются
таким образом заболевания, имеют ряд отличительных характеристик. Существуют также строгие методы доказательства доминантного или рецессивного наследования заболеваний.
НЕМЕНДЕЛЕВСКИЕ ТИПЫ НАСЛЕДОВАНИЯ
Известно достаточно большое число наследственных болезней, обусловленных изменением ДНК, которые однако не
имеют менделевского характера наследования. Ниже будет
рассмотрено митохондриальное наследование и митохондриальные болезни, а также импринтинг.
Митохондриальное наследование и митохондриальные болезни
Митохондрии являются клеточными органеллами. Митохондрии имеют две высокоспециализированные мембраны — наружную и внутреннюю, кольцевую молекулу ДНК,
а также собственные системы транскрипции и трансляции.
Каждая клетка содержит несколько сотен митохондрий. В них
осуществляется ряд важных биохимических цепей реакций, из
которых особенное значение имеют реакции энергетического
обмена клетки.
36
Как уже отмечено, митохондрии имеют собственную ДНК,
в каждой митохондрии содержится 10 и более молекул ДНК.
Геном митохондриальной ДНК (мтДНК) полностью расшифрован.
Нарушение взаимодействия между митохондриальным
и ядерным геномами служит причиной разнообразной митохондриальной патологии.
Поскольку мтДНК содержится в цитоплазме клеток, она
наследуется только по материнской линии. В цитоплазме
яйце клетки есть тысячи митохондрий и, следовательно, десятки тысяч молекул мтДНК. В то же время в сперматозоиде
имеется только несколько молекул мтДНК, которые не попадают в оплодотворяемое яйцо. Поэтому мужчины наследуют
мтДНК от своих матерей, но не передают ее своим потомкам.
Такой тип наследования называется материнским наследованием или наследованием по материнской линии.
Обычно все копии мтДНК идентичны, и такое состояние
называют гомоплазмией. Иногда в мтДНК возникают мутации.
Вследствие не очень совершенной работы митохондриальной
ДНК-полимеразы и репаративных систем мутации в мтДНК
возникают в 10 раз чаще, чем в ядерной ДНК. Появление мутации в одной из молекул мтДНК может привести к возникновению двух популяций мтДНК в клетке, что называют гетероплазией. В результате деления клеток мутантная мтДНК попадает
в другие клетки, где она продолжает размножаться.
Энергетические потребности разных тканей организма различны. Наиболее энергопотребляющей является нервная система. Именно поэтому эта система в первую очередь поражается
при митохондриальных болезнях.
Классификация митохондриальных болезней базируется на
двух принципах:
1) участие мутантного белка в энергетических реакциях окис-
лительного фосфорилирования;
2) кодируется ли мутантный белок мтДНК или ядерной ДНК.
К классу I митохондриальных болезней относится атрофия
дисков зрительных нервов Лебера. Заболевание проявляется
острой или подострой потерей центрального зрения, обусловленной атрофией зрительных нервов. Заболевание может начаться как в детском, так и в пожилом возрасте. У некоторых
больных атрофия зрительных нервов сочетается с симптомами
энцефаломиопатии. Атрофия зрительных нервов Лебера обус-
37
ловлена мутациями в генах мтДНК, кодирующих субъединицы
комплекса I.
К этому же классу относится синдром Лея (подострая некротизирующая энцефаломиелопатия). Синдром Лея возникает
только тогда, когда мутантная мтДНК составляет не менее 90%
всей мтДНК. Если же процент мутантной ДНК оказывается
ниже, то проявляется синдром нейропатии, атаксии и пигментного ретинита.
Синдром нейропатии, атаксии и пигментной дистрофии
сетчатки (NARP) может проявляться как в младенчестве, так
и позже, вплоть до 2-го десятилетия жизни. Кроме патологии,
вошедшей в название синдрома, у больных могут быть деменция, судороги, мотосенсорная нейропатия, тугоухость.
Синдром миоклонус-эпилепсии и рваных красных мышечных волокон (MERRF), который проявляется эпилепсией, деменцией, атаксией и миопатией, возникает в случае мутации
в гене тРНК. Синдром может проявляться в детском и взрослом возрастах. Кроме указанных симптомов, при синдроме
MERRF у больных иногда наблюдают нейросенсорную тугоухость, деменцию, атрофию зрительных нервов, спастическую
диплегию. Обычно при этом синдроме выявляется выраженная гетероплазмия, поэтому экспрессивность синдрома резко
варьирует.
Еще один синдром, обусловленный точковой заменой в гене тРНК, — это синдром митохондриальной энцефаломиопатии и инсультоподобных эпизодов (MELAS). При нем также
наблюдается гетероплазмия, и, как следствие, экспрессивность
синдрома довольно сильно варьирует. Основные клинические
проявления включают энцефаломиопатию, инсультоподобные
состояния, обычно преходящие, с восстановлением функции,
судороги, атаксию, миоклонус-эпилепсию, мигренеподобные
головные боли.
К митохондриальным заболеваниям, обусловленным делециями или дупликациями, относятся синдром Кернса—Сайра
(миопатия, мозжечковые нарушения и сердечная недостаточность), синдром Пирсона (панцитопения, молочно-кислый
ацидоз и недостаточность поджелудочной железы), а также
хроническая прогрессирующая наружная офтальмоплегия, которая проявляется опущением века.
Нарушением взаимодействия между ядерным и митохондриальным геномами объясняют синдром истощения мтДНК,
38
а также синдром множественных делеций мтДНК. Оба эти состояния наследуются как аутосомно-доминантные признаки,
поэтому причиной, вероятно, являются мутации ядерных генов.
Болезни дыхательной цепи митохондрий, обусловленные
мутациями ядерных генов, можно объединить в две группы —
митохондриальные миопатии и митохондриальные энцефаломиопатии. Эти заболевания наследуются как менделевские
признаки, но обусловлены недостаточностью ферментов, входящих в один из комплексов дыхательной цепи митохондрий.
Геномный импринтинг
К настоящему времени известны три класса исключений из
менделевского правила идентичности гибридов в 1-м поколении.
Первое исключение известно давно, и оно связано с Х-сцепленным наследованием.
Второе, только что рассмотренное, касается признаков,
определяемых генами мтДНК, которые обладают так называемым материнским наследованием. В основе этих двух классов отклонений от менделевского наследования лежат различия в генетическом вкладе родителей в генотип потомства.
При Х-сцеп ленном наследовании потомство может получить
от матери только хромосому X, в то время как от отца хромосому либо X, либо Y. При митохондриальном наследовании
зигота, образующаяся в результате слияния половых клеток,
получает митохондрии и содержащуюся в них мтДНК только
через яйцеклетку.
Недавно генетики и эмбриологи описали третье исключение — геномный импринтинг, когда оба родителя передают
потомкам совершенно идентичные гены, но эти гены несут
специфический отпечаток пола родителей, отцовские и материнские гены активированы или супрессированы (подавлены,
блокированы) во время гаметогенеза по-разному. Таким образом, в некоторых случаях важно, от кого из родителей унаследован ген.
Термин «импринтинг» (imprint — «отпечаток») впервые
предложил в 1960 г. Кроуз из Колумбийского университета
США.
Геномный импринтинг занимает особое место среди специфических механизмов регуляции активности генов на ранних
стадиях развития, приводя к различиям в экспрессии гомологичных материнских и отцовских аллелей. Последующие гене-
39
тические модификации могут привести к тому, что изменения
в экспрессии генов будут стабильно передаваться в процессе
развития клеточных поколений. Геномный импринтинг, например, может изменять дозу генов, контролирующих рост
эмбриона, клеточную пролиферацию и дифференцировку.
Примером импринтинга целого генома у человека является истинный пузырный занос, который возникает при оплодотворении яйцеклетки, лишенной материнских хромосом,
двумя сперматозоидами. Несмотря на наличие полноценного
диплоидного набора, ранний эмбриогенез таких зигот протекает аномально: ткани собственно эмбриона вообще не формируются. В случае двойного набора материнских хромосом
развивается тератома — эмбриональная опухоль. Только материнский или только отцовский геномы не в состоянии обеспечить нормальное развитие эмбриона.
На организменном уровне эффект импринтинга обнаружен в связи с наличием в хромосомном наборе фрагментов
или целых хромосом одного (материнского или отцовского)
происхождения — так называемая однородительская дисомия
(ОРД), а именно наблюдается качественный, а не количественный хромосомный дисбаланс.
В последние годы интенсивно исследуется эффект геномного импринтинга в связи с различной патологией у человека.
Примеров заболеваний, в основе которых лежит расстройство
функции импринтированных участков генома, довольно много, поэтому можно говорить об особом классе заболеваний
человека — «болезнях импринтинга», которых насчитывается
уже более 30.
Наиболее убедительные данные получены при синдроме
Прадера—Вилли (СПВ) и синдроме Энжельмена (СЭ), которые, имея существенно разные клинические проявления,
в своей основе имеют сходные молекулярно-цитогенетические
изменения.
Достаточно хорошо изучен в плане импринтинга также синдром Беквита—Видемана (СБВ), имеющий следующие основные признаки: макросомию, макроглоссию, пупочную грыжу,
повышенную предрасположенность к опухолям.
Связь геномного импринтинга с другой наследственной
патологией человека на уровне хромосом или отдельных генов
также отчетливо прослеживается и в настоящее время широко
изучается. Так, например, при хорее Гентингтона и спинномоз-
40
жечковой атаксии заболевание возникает раньше и протекает
тяжелее, если унаследованные гены имеют отцовское происхождение. При нейрофиброматозе, миотонической дистрофии, наоборот, заболевание имеет более раннее начало и тяжелое течение при унаследовании мутантных генов от матери.
Не вызывает сомнения причастность геномного импринтинга
к этиологии опухолевого роста.
В последние годы с помощью молекулярно-генетических
методов феномен геномного импринтинга наблюдают и при
мультифакториальных заболеваниях. Например, четко выраженный отцовский импринтинг обнаружен при атопическом
дерматите, материнский — при бронхиальной астме и атопии
у детей. При инсулинзависимом сахарном диабете выявлена
более высокая вероятность отцовского импринтинга.
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
Выше были описаны методы молекулярной генетики, которые применяют для идентификации генов менделирующих
наследственных болезней человека, такие методики входят
в состав международной программы «Геном человека». Ниже
будут рассмотрены основные положения генетической инженерии и сущность проекта «Геном человека».
В феврале 2001 г. одновременно в двух журналах, «Nature»
и «Science», были представлены результаты чернового проекта
всего генома человека, полученные независимо друг от друга
международным консорциумом проект «Геном человека» и частной компанией «Celera», для которой проект генома человека
является коммерческим предприятием. Эти публикации, несмотря на незавершенность проекта, являются значительным
достижением всей биологической науки и медицины.
Технология рекомбинантных ДНК
Действительно, к моменту объявления о начале программы «Геном человека» сформировалось целое направление
в молекулярной генетике, которое получило название «генетическая инженерия», или «технология рекомбинантных
ДНК». Последняя может быть разделена на две большие области: методы клонирования ДНК и методы анализа ДНК,
41
прежде всего определения последовательности нуклеотидов
в молекуле ДНК.
Клонирование ДНК
Клонирование ДНК in vivo (в живом организме) включает
6 этапов:
1) получение фрагментов ДНК, в том числе генов или их
частей с помощью ферментов рестрикции;
2) рекомбинация фрагментов;
3) вставка фрагмента ДНК в вектор;
4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;
5) скрининг на рекомбинантный вектор;
6) отбор интересующих исследователя клонов.
Понятие рестрикционных ферментов
В каждой хромосоме человека имеется только одна непре-
рывная нить ДНК. Она сложно упакована для того, чтобы поместиться в хромосоме. Манипулировать с молекулой ДНК
такой длины практически невозможно. Поэтому открытие
в 70-х гг. XX в. особых бактериальных ферментов, разрезающих ДНК на отдельные фрагменты, было очень актуальным.
Ферменты были названы рестриктазами или эндонуклеазами.
У бактерий эти ферменты служат для защиты от проникновения в клетку чужеродной ДНК.
Рекомбинация фрагментов ДНК
Рестриктазы разрезают обе нити ДНК, которые в резуль-
тате образуют либо тупые, либо липкие концы. ДНК одного
организма разрезается определенной рестриктазой в строго
определенных местах, поэтому такая ДНК после рестрикции
(которую также называют перевариванием) всегда будет давать
один и тот же набор фрагментов. Если использовать один вид
рестриктазы для разрезания ДНК из разных организмов, то набор фрагментов окажется различным, но последовательность
нуклеотидов в местах разрезания будет у всех фрагментов одной и той же и, следовательно, комплементарной друг другу
при образовании у фрагментов липких концов. Последние называют липкими, поскольку из-за комплементарности они могут соединяться с другими фрагментами, образованными той
же самой рестриктазой или другой рестриктазой, образующей
такие же концы. Объединение фрагментов, обладающих липкими комплементарными концами, ускоряется и стабилизируется специальным ферментом, который называют лигазой.
Таким образом, если одной рестриктазой разрезать ДНК двух
42
разных видов и смешать фрагменты, то может образоваться совершенно новая, не существующая в природных условиях молекула рекомбинантной ДНК.
Для того чтобы интересующий исследователя фрагмент
ДНК можно было исследовать, его необходимо размножить.
Это можно сделать двумя разными методами, переместив его
в клетку хозяина или размножив его in vitro (в пробирке).
Внедрение фрагментов ДНК в клетку хозяина с помощью векторов
Для перемещения фрагмента ДНК в клетку хозяина обычно
используют специальные конструкции, которые называют векторами. Наиболее часто в качестве векторов применяют бактериальные вещества, бактериофаги, бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы. Недавно было предложено
использовать в качестве векторов искусственные хромосомы
человека.
Создание геномных библиотек
Рестрикция геномной ДНК на фрагменты и клонирование
фрагментов с помощью различных векторов создали основу
формирования геномных библиотек. Для этого геномная ДНК
разрезается или, как говорят, переваривается определенной
рестриктазой, а образующиеся фрагменты клонируются с помощью различных векторов, для чего используют методы рекомбинантной ДНК. Геномная библиотека должна содержать
не только гены, но и всю некодирующую ДНК, расположенную между генами. Поскольку переваривание рестриктазой
производят неполное, так, что образуются фрагменты ДНК
с частично перекрывающимися последовательностями нуклеотидов. Это облегчает последующее восстановление картины расположения фрагментов в нативной ДНК ( ДНК в живом
организме). Кроме геномных библиотек, существуют библиотеки кДНК.
Клонирование последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Кроме описанного способа клонирования последовательностей ДНК in vivo, существует также способ клонирования
in vitro, который получил название полимеразной цепной
реакции (ПЦР).
Обязательным условием для проведения ПЦР является знание последовательности нуклеотидов, определяющих клонируемую последовательность. Для проведения ПЦР необходимо
43
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]