Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Бактериофаги. Учебно-методическое пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

06.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 89 / 249 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 > Следующая >>>

ацетилнейраминатполисахарид, 1 лиазной, которая может атаковать N- ацетилгепарозин капсулы К5; оба белка расширяют спектр хозяев, доступных для фага, хотя бы в рамках этого маленького семейства.

Бактериофаг Ми является миовирусом с изометрическим капсидом и обладает типичными хвостовыми фибриллами, которые помогают надлежащим образом размещать базальную пластинку относительно поверхности клетки и включают процесс сокращения хвоста. Он обладает очень широким хозяйским спектром по сравнению с другими известными фагами, благодаря в том числе и способности к переключению между двумя возможными вариантами гена хвостовых фибрилл путем инверсии фрагмента в 3000 нуклеотидов, получившим название G (SandulacheandPrehm, 1985;

1984). Как описано у Херши (1988) и у Kochс коллегами (1987), G(+) phageмогут инфицировать Е. coliК12 и Salmonellaarizonae, в то время как G(-) Muфаг, напротив, поражает штаммы Citrobacterfreundii, Shigellasonei, Erwinia, Enterobacterи E. coliС штаммы. Специфичный фаговый протеин Gin(от англ Ginversion) отвечает за переключение, которое происходит на стадии профага.

Фаг Р1 также обладает фрагментом-перевертышем, и Р1 фермент может замещать Ginдля инверсии Gучастка фага Muinvivo.

В целом ясно, что фаги разных семейств обладают чрезвычайной способностью изменять адгезины путем внутри- и межвидовой рекомбинации и мутаций. Такие изменения обычно позволяют фагу распознавать новые рецепторы. Этот феномен играет важную роль в экологии взаимодействий фага и хозяина, может быть использован для отбора терапевтических фагов, обладающих точно определенным спектром хозяев, и для манипулирования фаговыми геномами с использованием молекулярных методов. В данном контексте работники Института бактериофага, микробиологии и вирусологии (ИБМВ) им. Г. Элиава в Тбилиси в течение десятилетий разрабатывали методы отбора естественных вариантов фагов, используя методы выделения, которые дают преимущество вирусом с расширенным спектром хозяев, а также применяя прием ко-инфекции бактерий несколькими фагами с

различными (но перерывающимися) спектрами хозяев, что позволяет иногда отобрать естественных рекомбинантов с расширенной специфичностью. В итоге они составляли смеси фагов, обладающих заданным широким спектром адсорбционной специфичности для целей практической фаговой терапии.

ПРОНИКНОВЕНИЕ ФАГОВОЙ ДНК В КЛЕТКУ ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Соответствующее расположение хвоста фага на поверхности клетки включает необратимые события, ведущие к введению ДНК в клетку хозяина. Всего для нескольких фагов хорошо известна энергетика данного процесса. Подробный обзор (Letellieretal., 2004) посвящен в основном трем наилучшим образом изученным колифагам: миовирус Т4, сифовирус Т5 и подовирус Т7. Для каждого фага длинный полианионный геном, длина которого до 50 раз больше длины клетки хозяина, должен проникнуть внутрь клетки неповрежденным через два гидрофобных барьера - внешнюю и внутреннюю мембраны, пептидогликановую оболочку, а также содержащее нуьслеазы периплазматическое пространство. Скорость переноса может доходить до 3000-4000 пар оснований в секунду по сравнению со 100 парами оснований в секунду, которые наблюдали для коньюгации и естественной трансформации. Далее: очень высокая эффективность инфекции у фагов, подобных Т4, показывает, что процесс практически всегда происходит без значительных повреждений ДНК фага.

Механизмы данного явления сильно варьируют; часто в него включается АТФ, мембранный потенциал или требуется участие транспортирующего белка, но некоторые фаги, такие как Т5, могут войти в клетку в отсутствие метаболических ресурсов. Известно, что объем ригидного фагового капсида не изменяете* после введения ДНК фага в клетку и простое высвобождение энергии из метастабильного состояния упаковки в частице не дает достаточной энергии для транспортировки молекулы ДНК длиной в несколько микрометров через очень узкий канал внутри хвостовой трубки. Для фага В. subtilisSP82GMcAllister(1970) показал, что скорость ввода ДНК в клетку является постоянной по мере входа всего генома и очень сильно зависит от

температуры, в то время как вторая ступень переноса генома фага Т5, описанная ниже, проходит нормально даже в экспериментах, где ДНК уже высвобождена из своего капсида (Letellieretal., 2004).

Миовирусы, хотя и обладают сократимыми хвостами, в действительности не пронзают ими внутреннюю мембрану клеток, и для входа ДНК по-прежнему остается важным трансмембранный потенциал. В целом, как отмечает Molineux(2001), ясно, что широко применяемая метафора «иглы для подкожной инъекции» является неточной и механизмы, дающие энергию для переноса, отличаются у разных фагов.

ПОДОВИРУС Т7

Molineux(2001; 2005) предложил наиболее детальный к настоящему времени анализ переноса фаговой ДНК из хвостатого фага в клетку хозяина анализ, который является важным как базовый механизм, даже хотя механизмы других фагов, возможно, сильно отличаются. Инфекционный процесс Т7-фага включает крупные перестройки белков, связанных с хвостом, но упакованных внутри головки вплоть до начала инфекции - разновидность защищенного «выдвижного» хвоста (сравните с сократимым хвостом миовирусов). Три внутренних белка образуют выступающую 26x21 нм цилиндрическую структуру внутри 60 нм головки Т7. Эта сердцевина, вокруг которой обернута ДНК, содержит три копии gpl6 (144 kDaкаждый), 12 копий gpl5 (84 kDa) и 18 копий -gpl4 (21 kDa); два других белка, gpl3 и gp7.3, также расположены где-то внутри капсида. Снизу к этой центральной части присоединен коннектор (портальный белок), gp8, который, в свою очередь, связан с коротким, 23 нм хвостом, состоящим из gpllи gpl2. Центральный канал продолжается через сердцевину, коннектор и хвост.

С того момента, как взаимодействия между несколькими хвостовыми фибриллами Т7 и ЛПС приводят к расположению хвоста напротив внешней мембраны, на фаговую головку передается сигнал для начала необратимых стадий инфекции; похоже, что и хвост и хвостовые фибриллы участвуют в передаче этого сигнала, вдобавок к gpl3. Доказательством этого было то, что

gpl3-yraHTb* выглядели нормальными, но не могли необратимо связаться с

клеткой; однако супрессорные мутации для мутантов по гену 13 были обнаружены в хвостовой фибрилле, хвосте и гене коннектора. Необратимый процесс начинается с деградации gpl3 и gp7.3 и транспортировки трех сердцевинных белков, gpl4-16, через центральный канал в клетку. Повидимому, белкам необходимо некоторое развертывание для того, чтобы пройти через этот очень узкий канал, особенно для gpl6, состоящего из 1318 аминокислот. Gpl4 остается во внешней мембране, в то время как gpl5 и gpl6 обнаруживаются и в растворимой форме, и связанными с мембраной; Molineux(2001) предположил, что эти три белка вместе формируют канал сквозь все оболочки клетки. N-концевой элемент белка gpl6 имеет гомологию с С-концевым участком хозяйской растворимой литической трансгликозилазы, sltY, которая играет главную роль в обороте пептидогликанов у Е. coli. Глутамат в активном сайте sltYсохраняется в последовательности gpl6 фага Т7; если его заместить на другие аминокислоты, фаг не может эффективно инфицировать клетки, где пептидогликан предположительно более плотно перешит пептидными мостиками (при росте на 20°С или в поздней экспоненциальной фазе при 30°С), за исключением ситуации повышенной экспрессии sltY.

Механизм, по которому Т7 ДНК в норме попадает в клетку, работает медленнее, чем у других фагов, что позволяет легче изучить его детали. Комплекс хозяин - фаг с меченой ДНК был обработан ультразвуком через разные промежутки времени после инфекции для отделения («срезания») ДНК, не попавшей в клетку. Освобожденные таким образом фаговые геномы укорачивались с левого конца Пропорционально времени инфекции. Обработка антибиотиком рифампицином показала, что потеря левых кусков зависит от транскрипции с помощью РНК- иолимеразы Е. coli:только первые 850 н.п., содержащих главные три промотора для полимеразы Е. coliи один промотор Т7-полимеразы, нормально входят в клетку без активной транскрипции.

Доказательством этого было то, что gp13-уанты выглядели нормальными, но не могли необратимо связываться с клеткой; однако супрессорные мутации для мутантов по гену 13 были обнаружены в хвостовой фибрилле, хвосте и гене коннектора.

Необратимый процесс начинается с деградации gpl3 и gp7.3 и транспортировки трех сердцевинных белков, gpl4-16, через центральный канал в клетку. По-видимому, белкам необходимо некоторое развертывание для того, чтобы пройти через этот очень узкий канал, особенно для gpl6, состоящего из 1318 аминокислот. Gpl4 остается во внешней мембране, в то время как gpl5 и gpl6 обнаруживаются и в растворимой форме, и связанными с мембраной; Molineux(2001) предположил, что эти три белка вместе формируют канал сквозь все оболочки клетки. N-концевой элемент белка gpl6 имеет гомологию с С-концевым участком хозяйской растворимой литической трансглико- зилазы, sltY, которая играет главную роль в обороте пептидогликанов у Е. coli.Глутамат в активном сайте sltYсохраняется в последовательности gpl6 фага Т7; если его заместить на другие аминокислоты, фаг не может эффективно инфицировать клетки, где пептидогликан предположительно более плотно перешит пептидными мостиками (при росте на 20°С или в поздней экспоненциальной фазе при 30°С), за исключением ситуации повышенной экспрессии sltY.

транскрипции. Медленный перенос остальной части гено ма позволяет синтезировать мощный ингибитор рестриктаз, кодируемый геном 0.3 до того, как в клетку попадут чувствительные к рестрикционным ферментам сайты. Мутации, воздействующие на 130 аминокислотный центральный участок gpl6, определили регион, который «защелкивает» ДНК и делает дальнейшее заползание молекулы в клетку зависимым от транскрипционной активности уже вошедшего куска; транскрибирующая РНК-полимераза является сильнейшим из известных молекулярных моторов (Wangetal., 1998), и она, по-видимому, преодолевает сопротивление «зажима» и втягивает ДНК в клетку. В случае транскрипционно-независимого введения ДНК (например, при использовании gp16-мутанта), геном Т7 влетает в клетку с постоянной скоростью около 75 н.п./сек, однако стремительно попадающая в клетку ДНК эффективно уничтожается нуклеазами, кроме случаев, когда они инактивированы соответствующими мутациями. В итоге результаты, полученные Molineuxс коллегами, позволяют предположить, что gpl5 и gpl6 вместе могут формировать разновидность молекулярного двигателя, который способен быстро ввести ДНК в клетку, но участок gpl6 останавливает этот процесс после первых 850 нуклеотидов до тех пор, пока не начинается активная транскрипция.

МИОВИРУС Т4

Геномы многих фагов входят в клетку стремительно; особенно это важно для геномов с кольцевыми перестановками, поскольку весь геном должен попасть в клетку до того, как начинается программа развития инфекции. Перенос ДНК Т4 осуществляется со скоростью 3-10 тысячнуклеотидоввсекунду(GriniusandDaugelavicius, 1988; Letellieretal., 1999).

Для всех Т4-подобных фагов обратимое связывание хвостовых фибрилл со специфическими рецепторами - это только первый шаг, хотя именно он отвечает за хозяйскую специфичность. Начальную энергию для инфекции дает базальная пластинка, совершенное «взведенное» механическое приспособление. Когда три или более хвостовых фибрилл помещают

базальную пластинку параллельно поверхности хозяина, она меняет гексагональную форму на звездчатую. Затем шесть коротких хвостовых фибрилл, кодируемых геном 12, разворачиваются (CrawfordandGoldberg,

1980) и необратимо связываются со «вторичным фаговым рецептором» гептозным остатком на внутренней части ЛПС (Riedeetal., 1985; Montagetal.,

1987). Это конформационное изменение базальной пластинки мгновенно включает сокращение внешней части хвоста и проталкивание внутренней трубки через внешнюю мембрану. Сокращение хвостового чехла распространяется снизу вверх, как волна сжатия, передающаяся через спиральную укладку колец субъединиц сократимого чехла.

Для пересечения слоя пептидогликана хвостовая трубка использует лизоцим базальной пластинки gp5, расположенный на кончике трубки в комплексе с белком gp27, по три субъединицы каждого. Определенная недавно трехмерная структура этого комплекса выявила ферментативный домен лизоцима и иглоподобный С-концевой домен (Kanamaruetal., 2002). Когда чехол хвоста сокращается и внутренняя трубка выступает из дна базальной пластинки, С-концевой домен, уложенный в структуру трехтяжевой бета-спирали, похоже, действует, как игла, и способствует проникновению лизоцимного домена к муреиновому слою. Этот ферментативный домен gp5 является гомологом маленького гена е фага Т4, что, очевидно, отражает древнюю дупликацию. Активность лизоцима появляется только тогда, когда «иглоподобный» домен отщепляется от остального gp5u. Хвостовая трубка на самом деле не пронзает внутреннюю мембрану во время инфекции. Похоже, что сигналом для высвобождения генома Т4 из хвостовой трубки является контакт с фосфатидилглицеролом на внутренней мембране, и это высвобождение в норме сопряжено с транспортом ДНК через мембрану благодаря неизвестному до сих пор механизму, который требует электрохимического потенциала (рассмотрено в Goldbergetal., 1994).

Без этого потенциала ДНК остается в периплазме и со временем деградирует. Как это отражено в обзоре Abedon(1994), начальная стадия

инфекции Т4-подобными фагами ведет к плохо понимаемой перестройке мембраны, в которой участвуют продукты генов Т4 imm(иммунности) и sp. Эти гены ответственны также за явление, названное запретом суперинфекции, и появляющееся в течение 4 минут после инфекции клетки фагом (LuandHenning, 1989; Luetal., 1993). Этот эффект приводит к деградации ДНК других частиц Т4 или родственных ему фагов, которые пытаются ввести в клетку свой геном. Механизм, благодаря которому продукты данных генов блокируют перенос ДНК сквозь цитоплазматическую мембрану, до сих пор не определен. Хотя некоторые гены, по-видимому, участвуют в развитии постинфекционной устойчивости к лизису извне - феномену, обычному для многих систем фаг-хозяин, в которых одновременная адсорбция большого числа фаговых частиц вызывает немедленное уменьшение мутности культуры и высвобождение внутренних белков (Delbriick, 1940). Клетки, инфицированные sp+imm+Т4-подобным фагом, быстро развивают устойчивость, которая позволяет им безопасно адсорбировать сотни фагов. Инактивированные рентгеновским излучением фаги вызывают лизис извне даже активней, чем жизнеспособные частицы, что предполагает экспрессия генов фага, инфицирующего клетку первым, быстро дает продукт, который может немедленно снизить чувствительность к лизису извне.

Обработка фага Т4 мочевиной приводит к сокращению хвоста и формированию активного состояния, но ДНК остается внутри фага; успешное инфицирование оказывается возможным при контакте со сферопластами Е. coliили любых родственных бактерий, но эффективность будет очень низкой (WaisandGoldberg, 1969). Высвобождение ДНК может быть спровоцировано контактом с липосомами фосфатидилглицерола (но не фосфатидилэтаноамина); в этом случае ДНК выходит во внешнюю среду.

ТРИ СИФОВИРУСА, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ БЕЛОК FHUAКАК РЕЦЕПТОР,

НО ОБЛАДАЮЩИЕ ОЧЕНЬ РАЗНЫМИ МЕХАНИЗМАМИ

ПРОНИКНОВЕНИЯ

В ряде обзоров Letellieretal. (2004), Christensen (1994) и German (2005)

рассмотрели инфекцию многочисленными сифовирусами, которые используют один и тот же рецептор, но довольно различные механизмы инфекции. Белок внешней мембраны FhuA,бета-структурный порин с центральной пробкой, отвечает за транспорт комплекса феррихром - железо внутрь клетки. Одна из гидрофильных петель, соединяющих трансмембранные бета-тяжевые сегменты на бочкообразной структуре белка, направленная во внешнюю среду, служит рецептором фагам Т1, и80 и Т5. И транспорт железа через внешнюю мембрану, и необратимое связывание Т1 и 08О являются энергозависимыми процессами, несмотря на отсуствие очевидных источников энергии во внешней мембране или в периплазме (HancockandBraun, 1976). Энергия электрохимического градиента протонов, создаваемого цепью переноса электронов на цитоплазматической мембране, передается на внешнюю мембрану по белковому комплексу TonB-ExbB-ExbD, заякоренному в цитоплазматической мембране. Белок ТопВ, который закреплен во внутренней мембране с помощью своей N-концевой сигнальной последовательности, предположительно взаимодействует с рецептором FhuAна внешней мембране своим С-концевым доменом. Механизм переноса энергии и того, как связывание фага зависит от ТопВ, еще не определен. (Механизм фактического переноса пока не выяснен, но известно, что возникающее в результате адсорбции фага падение протонного потенциала мембраны и уровня АТФ ведет к резкому снижению внутриклеточной концентрации ГТФ и ингибирует инициацию трансляции хозяйских белков; другие ионные изменения также могут в этом участвовать. В течение нескольких минут функции мембраны каким-то образом восстанавливается, прекращается падение потенциала и репродукция фага успешно продолжается.)

Инфекция фагом Т5 не является энергозависимой; необратимое связывание фага с FhuAосуществляется через белок рЬ5, расположенный на дистальном конце фагового хвоста. Взаимодействие фага Т5 с очищенным белком FhuAведет к мгновенному высвобождению фаговой ДНК в

окружающую среду, при отсутствии других факторов. В то же время такое взаимодействие не ведет к высвобождению ДНК фагов Т1 и 08О (Letellieretal.,

2004). Plan^onс коллегами (1997) показал, что фаг Т5 может связываться с липосомами, в которые встроен очищенный белок FhuA, и эта связь приводит к высвобождению фаговой ДНК внутрь везикул. Это доказывает, что одного белка FhuAдостаточно для высвобождения генома Т5 фага и переноса его через мембрану, хотя до сих пор не получил объяснения механизм его переноса через слой пептидогликана и внутреннюю мембрану. Для Т5 ситуация даже более сложная, чем она выглядит в этом простом эксперименте. Уникальной особенностью этого фага является то, что процесс введения ДНК у него разделен на две части: после того как 8% ДНК оказывается в цитоплазме, наступает четырехминутная пауза, во время которой синтезируются белки, кодируемые введенной частью ДНК. Они разлагают хозяйскую ДНК и выключают клеточный процесс транскрипции прежде, чем остальная часть генома окажется внутри клетки. Некая разновидность канала предохраняет ДНК от периплазматических ферментов во время этой паузы, в его состав включен белок прямой фибриллы, рЬ2, который содержит гидрофобный домен, похожий на вирусные белки, способные вызывать слияние мембран (возможно, происходит локальное слияние внешней и внутренней мембран, обеспечивающее перенос ДНК фазу через все клеточные оболочки).

ФАГИ PRD1 и РМ2

Этот материал в основном посвящен хвостатым фагам, поэтому процессы проникновения ДНК бесхвостых фагов практически не рассматриваются. Нужно отметить, тем не менее, что они могут сильно отличаться от описанных для хвостатых фагов. Один из интересных примеров

- это хорошо изученный процесс доставки ДНК тективируса PRD1, очень необычного 15-kbpфага с двухцепочечной ДНК и внутренней мембраной, которая изнутри выстилает его белковый икосаэдрический капсид (Grahnetal.,

2002). PRD1 инфицирует E. coli, P. aeruginosa, и S. enterica,несущие

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 89 / 249 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]