Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
171
окружающей среде альтернативы. Основанные на бактериофагах
антибактериальные средства могут быть одной из таких альтернатив.
Фаги вездесущи, и их использование для домашнего скота, вероятно,
предоставит один из наиболее дружественных природе подходов из
существующих сегодня. Кроме того, несколько важных преимуществ фагов
над антибиотиками (Pirisi, 2000) делает их использование в животноводстве
потенциально очень заманчивым.
Например:
• из-за специфичности фагов при их использовании в сельском
хозяйстве невозможно отобрать фагоустойчивых бактерий среди других
видов, тогда как благодаря широкому спектру активности антибиотики
вызывают появление и распространение многих устойчивых штаммов
различных видов бактерий, а не только устойчивых мутантов возбудителей
заболевания;
• так как принципы устойчивости бактерий к фагам и антибиотикам
отличаются, возможное появление устойчивости к фагам не повлияет на
чувствительность бактерий к антибиотикам, используемым в лечении людей,
что является ключевой проблемой применения антибиотиков в сельском
хозяйстве;
• в отличие от антибиотиков (с длинным и дорогим циклом
производства), фаговые препараты могут быть быстро модифицированы в
ответ на изменения в популяции патогенных бактерий или чувствительности,
и возможно быстро разработать эффективные терапевтические фаговые
препараты против появления антибиотико- или фагоустойчивых
бактериальных мутантов.
Спектр бактериальных патогенов, которые могут быть мишенями для
фагов, достаточно широкий, но начальная работа в этой области, возможно,
пойдет от бактериальных патогенов, известных как наиболее значимые для в
птицеводства и скотоводства. Например, поскольку некротический энтерит,
вызываемый Clostridium perfringens, является важной причиной
172
заболеваемости и смертности цыплят, исходные исследования для снижения
использования антибиотиков в профилактике и лечении в птицеводстве могут
сфокусироваться на определении ценности применения фагов против данного
патогена. Фаговые препараты возможно создать также и против иных
бактериальных патогенов, вызывающих болезни других домашних животных;
например, фаговые препараты для лечения мастита у коров могут быть
востребованы в молочной промышленности. Такие препараты (главным
образом направленные против S. aureus) разработаны в Советском Союзе и
были получены обнадеживающие предварительные результаты (Т. Gabisonia).
Если исходные исследования в этом направлении дадут сходные
обнадеживающие результаты в США и Западной Европе, этот подход может
привести к созданию нескольких, основанных на фагах, препаратов для
ветеринарии. Дальнейшие исследования бактериофагов, связанные с
сельскохозяйственным применением, могли бы вначале идти в двух главных
направлениях: (i) создание фаговых препаратов для использования как
профилактических и терапевтических антимикробных средств (то есть
способных непосредственно лизировать патогенную мишень), и (ii) создание
препаратов, основанных на фаговых лизатах, для использования в качестве
вакцин. Применение таких препаратов может сократить профилактическое и
терапевтическое использование антибиотиков у домашнего скота.
Кроме того, они могут оказать стимулирующее влияние на рост
(например, сокращая стресс, вызванный бактериальными инфекциями), что
поможет снизить или прекратить использование GPA в различных
животноводческих отраслях.
Бактериофаги могут иметь значение для сокращения использования
антибиотиков в рыбоводстве и фермерском хозяйстве. Например,
бактериальный ожог, вызываемый Erwinia amylovora, опасное заболевание
яблонь и груш в разных странах по всему миру, и многие коммерческие
производства сильно зависят от антибиотиков (в частности, стрептомицина)
для предупреждения заболевания и снижения количества эпифитных
173
популяций Е. amylovora на рыльцевых поверхностях цветков (Schnabel and
Jones, 2001). Тем не менее эта практика привела к появлению
стрептомицинустойчивых мутантов Е. amylovora (Jones and Schnabel, 2000),
что служит хорошей демонстрацией того, как использование антибиотиков в
сельском хозяйстве может способствовать появлению
антибиотикоустойчивых штаммов бактерий. Хотя они не представляют
прямую угрозу здоровью людей, распространение стрептомицинустойчивых
штаммов Е. amylovora может способствовать усиленному распространению
генов устойчивости к стрептомицину (и, возможно, других генов
резистентности к антибиотикам) среди разных видов бактерий, включая
патогенные для человека.
Бактериофаги впервые использованы как потенциальные агенты
контроля бактериальных инфекций растений еще в 1926 г. (Мооге, 1926; Okabe
and Goto, 1963), и они были успешно использованы для контроля болезни
Стюарта у кукурузы (Thomas, 1935).
Фагов успешно использовали Civerolo с коллегами (1969) и позднее
Civerolo (1973) для снижения на 86% - 100% заболеваемости саженцев груш
бактериальной пятнистостью, вызванной Xanthomonas oryzae. Тем не менее,
большинство опубликованных исследований относительно фагов,
специфичных к бактериальным патогенам растений, не были ориентированы
на лечение; фаги зачастую использовались как средство для типирования
поражающих растения бактерий. Обзоры о бактериофагах различных
растительных патогенов были опубликованы Okabe и Goto (1963) и Gill и
Abedon (2003).
Е. amylovora является одним из наиболее изученных видов растительных
патогенных бактерий, и в нескольких публикациях 1960-го года описали
выделение, характеристику и использование различных фагов для
типирования штаммов Е. amylovora.
Первое сообщение, в котором обсуждается возможная роль
бактериофагов в эпидемиологии ассоциированных с инфекцией Е. amylovora
174
бактериальных ожогов, принадлежит Erskine (1973). Позднее Е. amylovora -
специфичный фаг 0Еа1 был успешно использован для профилактики и
лечения бактериального ожога у саженцев яблонь, пораженных Е. amylovora
(Richie and Klos, 1979; 1977). Лечение с помощью рекомбинантной
полисахариддеполимеразы, кодируемой 0Еа1, также ослабляло симптомы
бактериального ожога у груш, привитых Е. amylovora (Hartung et al., 1988).
Schnabel и коллеги (2001) недавно доложили о выделении нескольких
специфичных к Е. amylovora бактериофагов (идентичных или родственных
иЕа1) из различных фруктов и образцов почвы, собранных в местах
обнаружения симптомов бактериального ожога. Позднее Gill с коллегами
(2003) выделили более сорока бактериофагов Е. amylovora из различных мест
в области Ниагара южного Онтарио и Королевских ботанических садов в
Гамильтоне, Онтарио, Канада. Молекулярная характеристика фагов с
помощью полимеразной цепной реакции и RFLP (анализ рестрикционных
фрагментов) выявила, что некоторые из них были близкородственны oEal.
Изучение хозяйского спектра фагов показало, что определенные изоляты
фагов не могли эффективно лизировать некоторые штаммы Е. amylovora, но в
то же время литический потенциал фагов не ограничивался этим видом
(например, некоторые фаги были способны лизировать и эпифитных бактерий
Pantoea agglomerans). Авторы пришли к заключению, что потенциал их фагов
как агентов биоконтроля требует дальнейших исследований.
Такие исследования проведены другими исследователями для других
бактериальных заболеваний растений и на ряде других необычных объектов.
Колонизация растений Е. herbicola и Pseudomonas syringae способствует, как
считается, повреждению тканей низкими температурами, так как клетки этих
микроорганизмов действуют как зародыши кристаллов льда при -1-3°С.
Kozloff с коллегами (1983) получили патент США, основанный на идее
использования фагов, специфичных к этим двум видам, для растений.
Результаты их экспериментов показали, что растения, инфицированные Е.
herbicola и обработанные специфичными к этим бактериям фагами,
175
испытывали на 20%~25% меньше повреждений, чем растения,
экспериментально зараженные Е. herbicola, но не обработанные фагами.
Jackson (1989) получил патент США на использование фаговых
препаратов для (i) уничтожения естественно присутствующих Р. syringae на
зараженных бобовых растениях, (ii) снижения тяжести симптомов
заболевания у листьев бобовых, экспериментально инфицированных Р.
syringae. Тот же автор позже создал препараты фагов, направленные на
Ralstonia solanacearum и Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,
бактериальных патогенов, ответственных за два главных заболевания томатов,
известных как бактериальное увядание и бактериальная пятнистость
соответственно. В полевых испытаниях фаговые смеси обычно разливали на
почву у основания 6-8-недельных растений; в теплицах фаги применялись с
поливочной водой (Fox, 2000). Через две недели после обработки патогеном
60% растений без фагового лечения потеряли более 12 % листьев, тогда как у
растений, обработанных фагом, потери листьев были менее 12 %. Наглядные
результаты также оказались впечатляющими. Они дают основание
предположить, что бактериофаги могут быть действительно ценными
средствами для борьбы с различными растительными заболеваниями
бактериальной природы. Тем не менее, исследования не были опубликованы в
рецензируемой литературе, и некоторые важные детали относительно
разработки и характеристик использованных фагов пока недоступны для
критического анализа.
Наземные животные и растения - не единственные объекты для лечения
с помощью бактериофагов, и возможная ценность фагового лечения
бактериальных инфекций у рыб в аквакультуре вызывает в последнее время
пристальное внимание. Одно из первых сообщений в этой области касалось
использования фагов Lactococcus garvieae для лечения экспериментально
зараженных молодых желтохвостов Seriola quinqueradiata (Nakai et al., 1999).
Рыбы были экспериментально заражены интраперитонеальной инъекцией
патогенного штамма L. garvieae с последующим интраперитонеальным или
176
пероральным введением фагов, обладающих литической активностью против
штамма возбудителя in vitro. Все инфицированные рыбы, получившие фагов,
выжили, тогда как в группе рыб, необработанных фагом, выживаемость
составила лишь 10%. Самый сильный защитный эффект наблюдался при
применении фагов вскоре после заражения бактериями. Защита также
наблюдалась у желтохвостов, получавших фагов с кормом. Авторы
исследовали внутренние органы рыб на предмет наличия фагов, и тестировали
изоляты L. garvieae, выделенные из мертвых рыб, на чувствительность к
фагам. Все проверенные изоляты остались фагочувствительными; в образцах
сыворотки желтохвостов не были обнаружены фаг-нейтрализующие антитела
(Nakai et al., 1999; Nakai and Park, 2002).
Похожие исследования были позже проведены на модели вызванного
Pseudomonas plecoglossicida бактериального геморрагического асцита у
разводимых в аквакультуре рыбах (Plecoglossus altivelis) (Park et al., 2000; Park
and Nakai, 2003). P plecoglossicida - это оппортунистический патоген, который
при определенных условиях может вызывать заболевание с высоким уровнем
смертности у рыб, родственных айю (Nishimori et al., 2000). Фаги, литические
для Р plecoglossicida, были выделены из больных рыб и из прудовой воды,
отобранной на разных рыбных фермах в префектуре Токусима, Япония. В
первом эксперименте четыре группы из 20 рыб (средний вес 10 г) были
накормлены сухими гранулами, пропитанными живыми культурами Р
plecoglossicida (107 КОЕ/г гранул).
Через 15 минут кормления 2 группы накормили гранулами,
пропитанными фаговым раствором (107 БОЕ/г гранул). Контрольные группы
получали второе кормление без фага. Второй эксперимент был построен
практически по той же схеме, за исключением: (i) были использованы рыбы
меньшего веса (2-4 г), (ii) количество рыб было больше, например, в каждой
группе было по 40-50 рыб и (iii) одна из тестовых групп получила фагов спустя
1 час после скармливания им гранул, содержащих бактерий, а другая - через
24 часа после кормления гранулами с возбудителем. Продолжительность
177
исследований в обоих случаях была 2 недели. В первом эксперименте рыбы из
контрольной группы (без фагового кормления) начали умирать через 7 дней
после бактериального заражения, и суммарный уровень смертности в этой
группе к концу эксперимента составил около 65%. Для сравнения: уровень
смертности в группе, накормленной фагами, был около 23% (Р<0,001).
Фаговое кормление также снизило уровень смертности у леченных фагами
рыб во втором эксперименте; следует отметить, что назначение фагов через
час после заражения было значительно эффективнее для предотвращения
гибели, чем применение фагов через 24 часа после заражения (0% против 13%
смертности соответственно). Р plecoglossicida были выделены из почек рыб I
первом эксперименте, и все полученные культуры оказались
чувствительными: фагам, использованным в исследовании. Кроме того,
фагоустойчивые мутанты, (отобранные in vitro, оказались менее
вирулентными для рыб (Park et al., 2000).
Терапевтическая эффективность анти- Р plecoglossicidaфагов,
использованных в этих исследованиях, недавно была показана в полевых
испытаниях, когда, содержащий фагов корм был назначен рыбам в пруду, где
заболевание началось естественным образом. Показатель ежедневной
смертности снизился до постоянного уровня (5% в день), и к концу
двухнедельного исследования он составлял приблизительно 1/3 от уровня
смертности в контрольной группе. Как и в предыдущих экспериментах, не
было обнаружено фагоустойчивых микроорганизмов или фагнейтрализующих антител у рыб (Park and Nakai, 2003).
Интригующий способ применения фагов в сельском хозяйстве (и,
возможно, в медицине человека) включает использование их для
приготовления бактериальных лизатов, которые могут быть использованы как
вакцины. Этот подход, такой же старый, как и традиционная фаговая терапия
(то есть метод использования фагов для лизиса этиологического агента in
vivo), был разработан в лаборатории д'Эрелля в институте Пастера вскоре
после публикации в 1917 году главной работы (d'Herelle, 1917) об открытии
178
бактериофагов. С 1914 года д'Эрелль работал над приготовлением
бактериальных вакцин для армий союзников, сражающихся в Первой мировой
войне (Summers, 1999). В то время терапия бактериальными вакцинами была
очень важным объектом исследований в институте Пастера, и директор
института (Эмиль Ру, один из создателей очень удачной антидифтерийной
вакцины) вдохновил сотрудников на создание новых вакцин и методов,
необходимых для их приготовления. Д'Эрелль протестировал способность
различных растительных экстрактов лизировать патогенных бактерий и
создавать лизаты, эффективные как вакцины. Много редких
бактериолитических веществ было исследовано в ходе проекта: например, в
ходе работы по созданию сальмонелльной вакцины д'Эрелль протестировал
горчицу, корицу, чеснок, душицу, гвоздику и тимьян на способность
лизировать Salmonella (Summers, 1999). Все они лизировали бактерий, и
д'Эрелль доложил, что горчичные лизаты защитили мышей от заражения
живой сальмонеллой (интересно, что расширение границ этого исследования
- попытки создать вакцину против Shigella - привело к его сооткрытию
бактериофагов в 1917 г). Тем не менее, хотя д'Эрелль установил, что фаги
были иммуностимулирущими (в его понимании. - Ред.) агентами, он никогда
не тестировал эффективность фаговых бактериальных лизатов как вакцин.
Первым исследователем возможной способности фаговых лизатов к
активной иммунизации был Тамезо Кабешима, который приезжал в
лабораторию д'Эрелля в институте Пастера из лаборатории Шига в Японии.
Kabeshima (1919) успешно использовал лизированный фагом препарат Shigella
(«бактериолизат») для иммунизации мелких лабораторных животных, и это
стало первым известным использованием фаговых лизатов как защитных
вакцин. В нескольких следующих публикациях сообщалось, что препараты
лизированных фагами бактерий были на самом деле хорошими
иммунизирующими агентами, чей защитный эффект был сильнее обычных
вакцин (например, вакцин, приготовленных с помощью тепловой или
179
химической инактивации бактерий) (Arnold and Weiss, 1924; Larkum, 1929;
Compton, 1928).
Механизм, лежащий в основе отличной иммуногенности фаговых
лизатов, не ясен, но возможно, что вызванный фагами лизис - более
эффективный и мягкий метод воздействия на антигены бактерий, чем прочие
методы, используемые для получения «мертвоклеточных» вакцин. В таком
случае общие методы, применимые для инактивации бактериальных
патогенов до «мертвоклеточных» вакцин (например, нагревание, облучение
или химическое воздействие) могут на самом деле вредно влиять на
эффективность вакцин, уменьшая антигенность значимых иммунологических
эпитопов (Melamed et al., 1991; Holt et al., 1990; Lauvau et al., 2001). Интересно,
что идея о том, что мягкий лизис способствует достижению оптимальной
иммуногенности, была предложена д'Эреллем (1916). Использование фаговых
лизатов как вакцин, вероятно, продолжалось бессознательно после первых
экспериментов Кабешимы, потому что большинство фаговых
терапевтических препаратов, использованных как направленные
антимикробные агенты, были контаминированы многочисленными
бактериальными антигенами, вышедшими из лизированных бактерий, и,
таким образом, вдобавок к их прямому бактериолитическому эффекту эти
препараты могли непреднамеренно работать как вакцины.
Возможно, самым известным фаговым бактериальным лизатом,
доступным в настоящий момент в США, является SPL, который производится
Delmont Laboratories, Swathmore, РА. SPL приготовлен из жидких культур по
крайней мере двух вирулентных штаммов коагулазоположительного S. aureus
(тип I и III) путем лизиса бактерий избытком специфичных к ним фагов. Лизат
содержит клеточную стенку и внутриклеточные компоненты, освобожденные
в результате клеточного лизиса, компоненты культуральной среды и живых
бактериофагов. Как описывается в главе 14 этой книги, SPL был использован
для предотвращения или лечений инфекций у людей в США с 1950 по 1990-й
год, но сейчас он официально примейяется только в ветеринарии. В одной из
180
ранних публикаций, описывающих использование SPL, Esber с коллегами
(1981) использовали мышь как модель для оценки эффективности SPL для
предупреждения или лечения животных от инфекции, вызванной S. aureus.
Применение SPL привело к повышению выживаемости зараженных мышей до
80%-100% по сравнению с полной гибелью инфицированных мышей, не
получавших SPL. Выживаемость предположительно связана с повышением
неспецифической иммунной устойчивости, вызванным SPL-активацией
тимус-модулированных лимфоцитов и макрофагов. В другом исследовании
Esber et al. (1985) применение SPL было отмечено значительным \
повышением уровней антистафилококковых IgGl, IgG2a и IgG2b у
получавших препарат животных. Еженедельные инъекции SPL были
признаны эффективным лечением (Chambers and Severin, 1984) хронического
стафилококкового блефарита у собак; препарат контролировал заболевание
без каких-либо неблагоприятных побочных эффектов у животных. Также
одновременное использование SPL и доксициклина натрия было значительно
(Р<0,05) более эффективно в лечении идиопатической рецидивирующей
поверхностной пиодермы у собак, чем лечение одним антибиотиком (DeBoer
et al., 1990). Тем не менее, не все результаты оказываются одинаково
обнадеживающими. Например, как минимум в одном исследовании (Giese et
al., 1996) вакцинация SPL не предотвратила развитие вызванного S. aureus
блефарита и катарральных инфильтраций у экспериментально зараженных
кроликов. Дополнительные исследования необходимы для улучшения
понимания, какие инфекционные заболевания и(или) клинические симптомы
в наибольшей степени поддаются профилактике и лечению SPL (и другими
фаговыми лизатами бактерий) и определению оптимальных режимов
дозирования, путей применения и т.д.
Использование кодируемых фаговыми геномами бактериолитических
ферментов вместо живых бактериофагов для приготовления
противобактериальных вакцин недавно привлекло повышенное внимание, в
частности в Западной Европе (Szostak et al., 1990; Szostak et al.,1996; Szostak et
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]