Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
221
препаратов пипеткой (25 мкл 2х108 БОЕ/мл на дольку фрукта) на
экспериментально контаминированные фрукты привело к сокращению
популяции Salmonella на 3,5 порядка на дольках медовой дыни, хранившихся
при 5°С и при 10°С, и на 2,5 порядка - на дольках при 20°С (рис. 13.4), что
оказалось лучше использования обычных химических дезинфицирующих
средств. Тем не менее фаговые препараты действовали менее эффективно на
свеженарезанные яблоки Ред Делишес, чем на дольки медовой дыни. Важно,
что титр фагового препарата оставался относительно постоянным на дынных
дольках, тогда как на яблочных дольках он снизился до практически не
определяемого уровня уже через 48 часов при всех температурах. Авторы
предположили, что инактивация фагов, возможно благодаря более кислой
среде (pH 4,2 против pH 5,8 у дыни), привела к неспособности фагового
препарата значительно снижать контаминацию сальмонеллой яблочных
долек. Они также предложили использовать более высокие титры фагов и/или
толерантных к низким pH фаговых мутантов для повышения эффективности
фаговой обработки свеженарезанных продуктов с низким pH. Практическая
ценность этих методов еще не оценена.
В 2014 г. E.N. Silva с соавт. провели исследование, в котором оценивали
эффективность бактериофага P100 на L. monocytogenes в искусственно
контаминированных сырах до созревания. Образцы инокулировали смесью
штаммов L. monocytogenes 1/2a и Scott A в титре 105 КОЕ/г, после добавляли
бактериофаг в титре 8,3×107 БОЕ/г и оставляли при температуре 10 °C в
течение 7 дней. В нулевой момент времени, через 30 минут после
инфицирования, бактериофаг P100 снижал уровень L. monocytogenes в
среднем на 2,3 log в сыре Minas Frescal и на 2,1 log в сыре Coalho, в отличие от
контрольных образцов, не обработанных бактериофагом. Однако после 7 дней
хранения в холодильнике бактериофаг P100 показал слабую
антилистериозную активность: на 1,0 (MinasFrescal) и 0,8 (Coalho) log, по
сравнению с контрольными образцами. Данное исследование показало, что
эффективность фаговой обработки зависит от изначального уровня
222
контаминации и требуется более высокий титр фаговых частиц на
обрабатываемой пищевой поверхности для лучшего эффекта].
В 2015 г. Augustin J. с соавт. оценивали два специфических
бактериофага, ΦSP-1 и ΦSP-3, активных в отношении сальмонелл, в готовом к
употреблению (RTE) курином мясе при различных температурах хранения – 4
°C, комнатной температуре 28 ± 0,5 °C, 37 °C и с различной множественностью
инфицирования (MOI). При температуре 4 °C индивидуальное применение
бактериофагов ΦSP-1 и ΦSP-3 снизило уровень сальмонелл на 2,46 и 2,1 log
КОЕ/мл при высоких значениях MOI и 0,98 и 0,52 log КОЕ/мл при низких
значениях MOI, по сравнению с контрольными образцами на 3-й день
эксперимента. При комнатной температуре снижение бактериальных клеток
составляло 3,99 и 3,46 log КОЕ/мл при высоком MOI и 2,51 и 2,3 log КОЕ/мл
при низком MOI. При 37 °C снижение сальмонелл составило 1,98 и 2,38 log
КОЕ/мл при высокой MOI и 1,52 и 1,98 КОЕ/мл при низкой MOI. Лучший
эффект был получен, когда бактериофаги использовали коктейлем и с
высоким уровнем MOI. Так, на 3-й день эксперимента в обработанных
коктейлем бактериофагов образцах бактериальная нагрузка снижалась на 3,53
log КОЕ/мл при 37 °C и за пределами уровня обнаружения при 4 °C и
комнатной температуре.
В другом исследовании, связанном с сальмонеллой (Whichard et al.,
2003), бактериофаг Felix Ol и его мутант, обладающие in vitro повышенной
литической активностью против Salmonella typhimurium DTI04, были
использованы для обработки куриных сосисок, экспериментально
контаминированных S. typhimurium DT104. Фаг дикого типа и мутантный фаг
вызвали редукцию уровней заражения сальмонеллой на 1,8 и 2,1 порядка
соответственно, по сравнению с необработан-ными сосисками (Р=0,5).
Отмечено, что сходный способ, например, использование специфических
фагов для удаления или значительного снижения уровня контаминации
бактериями свеженарезанных фруктов и овощей, был изучен для Е. coli
0157:Н7 (Kudva et al., 1999).
223
Leverentz с коллегами (2003) недавно доложили о результатах своего
второго исследования эффективности фагов, отдельно и в комбинации с
бактериоцином низином, в снижении уровня L. monocytogenes на поверхности
экспериментально зараженных дынь и яблок. Фаговая смесь, нанесенная
пипеткой или распылителем, снизила популяцию L. monocytogenes от 2,0 до
4,6 порядков у медовых дынь по сравнению с контролем, обработанным
буфером без фага. Как наблюдалось ранее с сальмонеллой (Leverentz et al.,
2001), редукция была менее выраженной у яблок (0,4 порядка по сравнению с
контролем), чем у дынь. Использование фагового препарата вместе с низином
уменьшило популяцию L. monocytogenes на 5,7 порядков у дынь и на 2,3
порядка у яблок, по сравнению с контролем. Титры L. monocytogenes-
специфичных фагов были постоянны на дольках дыни, но быстро снижались
на дольках яблок. Эффективность фаговой обработки зависела от исходной
концентрации L. monocytogenes; например, самое сильное снижение было
отмечено при более высоком соотношении фаг/L. monocytogenes. Так как
реальная контаминация свеженарезанных продуктов L. monocytogenes обычно
не достигает такого высокого уровня бактерий, как в экспериментах
(например, 2,5х105 и 2,5х106 КОЕ L. monocytogenes на 0,785 см3 фрукта),
авторы предположили, что фаговые препараты могут оказаться более
эффективными в условиях реальной жизни, чем в ходе исследований.
Распыление фагов снизило число бактерий по крайней мере также сильно, как
и нанесение пипеткой, что очень важно для коммерческого применения. Было
показано, что распыление фагов (S.L. Burnett, устное сообщение) снижает
уровень L. monocytogenes на нарезанных и приготовленных цельных кусках
мышц (красное мясо и птица), нарезанных и приготовленных
законсервированных цельных кусках мышц (красное мясо и птица) и цельных
кусках мышц (красное мясо и птица) по крайней мере в 10 раз (и на некоторых
продуктах более чем в 100 раз), когда продукты хранились в холодильнике.
Эти исследования говорят о том, что использование фагов для снижения
контаминации продуктов различными патогенными бактериями эффективно
224
как минимум для нескольких типов продуктов, и что успешное использование
фагов будет зависеть от применения правильного фага в нужном месте и в
необходимой концентрации. Тем не менее, эффективность - это только начало
пути, много дополнительных важных вопросов должно быть решено перед
тем, как фагов можно будет использовать для повышения безопасности
продуктов питания на практике. Например, фаговые препараты, добавленные
к продуктам, должны удовлетворять строгим требованиям чистоты, это
сделает необходимым создание коммерчески обоснованных протоколов для
масштабного производства очищенных фагов.
Также в настоящее время неясно, как будет регулироваться вопрос о
хранении таких продуктов, основанных на фагах; например, непонятно, будут
ли фаги применяться как «прямые добавки к пище» (например, ингредиенты,
имеющие длительное влияние на продукты, например, лактоферрин) или как
«вспомогательные добавки к пище» (ингредиенты без длительного влияния на
продукты; например, озон). И, наконец, принятие потребителями идеи, что
фаги (разновидность вирусов) могут быть добавлены к их еде, - это еще одно
неизвестное. Большинство людей не знают о высоком естественном
содержании фагов в продуктах, которые употребляются в пищу ежедневно
поэтому они могут быть обеспокоены идеей добавления фагов к некоторым
продуктам питания, даже если целью служит удаление вредных бактерий и
создание более безопасных для людей продуктов.
225
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ БАКТЕРИОФАГОВ В ОКРУЖАЮЩЕЙ
СРЕДЕ
Как подробно описано выше, бактериофаги - самые вездесущие и
наиболее разнообразные живые существа на Земле. Их насчитывается 10301032, к они живут в изобилии в соленой и свежей воде, почве, растениях и
животных; у людей фаги обнаружены на коже, в желудочно-кишечном тракте
(ЖКТ) и во рту (Rohwer, 2003; Brussow and Hendrix, 2002; Bergh et al., 1989;
Gill et al., 2003; Bachrach et al., 2003; Yeung and Kozelsky, 1997). Бактериофаги
также были выделены из питьевой воды (Lucena et al., 1995; Armon et al., 1997;
Armon and Kott, 1993; Grabow and Coubrough, 1986) и широкого спектра
пищевых продуктов, включая говядину, свиные сосиски, курицу,
пресноводную рыбу из хозяйств, обычного карпа и морскую рыбу, масло,
сардины, сырое снятое молоко и сыр (Hsu et al., 2002; Whitman and Marshall,
1969; 1971; Kennedy et al., 1986; Kennedy et al., 1984; Gautier et al.,1995). Фаги
были выделены из 100% проанализированных образцов свежих куриных и
свиных сосисок и из 33% образцов деликатесного мяса (Kennedy et al., 1984).
Уровни различались от 3,3 до 4,4х106БОЕ/100 г свежей курицы, до 3,5х1010
БОЕ/100 г свежей свинины и до 2,7х ЮШБОЕ/100 г образца жареных куриных
грудок. В других исследованиях (Kennedy et al., 1986) были проанализированы
образцы свежих куриных грудок, свежей говядины, свежих свиных сосисок,
консервированного соленого мяса и замороженных смесей овощей на наличие
колифагов. Хотя только три АТСС (Американская коллекция типовых
культур) штамма Е. coli были использованы как индикаторные хозяйские
штаммы, колифаги были найдены в 48% различных образцов продуктов.
Несколько других исследований показали, что 100% говядины и куриного
мяса, проданного в розницу, содержат различные уровни разнообразных
бактериофагов (Hsu et al., 2002; Kennedy et al., 1986; Tierney et al., 1973).
Мясо и овощи - не все продукты, в которых присутствие фагов было
документировано. Gautier с колегами (1995), например, доложили, что 50%
проанализированных образцов швейцарского сыра содержат фагов,
226
литических для Propionibacterium freudenreichii (молочная пропионовокислая
бактерия, используемая в производстве швейцарского сыра для характерного
вкуса). Число бак-териофагов различается от 10 до 106БОЕ на грамм сыра.
Авторы считают, что, вероятно, эти концентрации недооценены, так как в
своем исследовании они использовали недостаточно индикаторных штаммов.
Бактериофаги часто обнаруживаются в морепродуктах. Например, в
ходе исследований, оценивающих значимость бактериофагов как
индикаторных организмов для определения загрязнения моллюсков, В.
/ragi/is-специфичные бактериофагов выделяли из черных мидий (Lucena et al.,
1994).
Бактериофагов часто обнаруживают в животном корме. В недавнем
исследовании в Texas А&М University (Maciorowski et al., 2001) специфичные
к мужским (F+) штаммам колифаги и соматические колифаги были
обнаружены во всех животных кормах, ингредиентах, птичьих кормах даже
после того, как образцы хранились при - 20°С 14 месяцев.
Ранее полученные данные показывают, что естественно встречающиеся
бактериофаги обычно потребляются людьми и животными; ежедневное
поедание фагов может быть важной стратегией пополнения фаговой
популяции в желудоч-но-кишечном тракте и для регуляции микробного
баланса толстой кишки.
Тем не менее, в настоящее время нет ни одного точного подсчета
количества фагов, поедаемых ежедневно средним человеком. Возможно,
только маленькая порция живых фагов в еде, включая фагов, намеренно
добавленных в продукты для снижения уровня пищевых патогенов,
поглощается или будет поглощена людьми, так как многие из обычно
используемых способов приготовления пищи губительны для бактериофагов;
например, нагревание в микроволновой печи более одной минуты и/или
кипячение больше двух минут снижает жизнеспособность фагов в различных
продуктах более чем на 99,9% (A. Sulakvelidze, неопубликованные данные).
Таким образом, возможно, что большинство доставленных с едой фагов в
227
ЖКТ приносится с необработанными продуктами. Более того, по крайней
мере, часть поглощенных живых фагов, вероятно, будут убиты кислой средой
в желудке; возможно, только маленький процент будет способен
«колонизировать»» кишечник. В настоящее время также неизвестно, как долго
отдельный фаг сохраняется в кишечнике. Тем не менее, данные о
преобладании фагов в человеческих фекалиях и образцах сточных вод могут
способствовать некоторому пониманию их превалирования в ЖКТ и сточных
водах.
Фаги, способные лизировать Е. coli, В. fragilis, и различные сероти
Salmonella, были выделены из образцов человеческих фекалий в концентрат
105 б.о.е./100 г фекалий (Calci et al., 1998; Сотах et al., 1998; Comax et al., 1994;
Furuse et al., 1983a; Kai et al., 1985). Важно, что из-за специфичности фагов
применение специфичных бактерий-хозяев для подсчета фагов даст возможно
подсчитать только тех фагов, которые смогут инфицировать этот
определенный хозяйский штамм; таким образом, ценность такого метода для
подсчета полной фаговой популяции ограничен. Интересный способ
преодоления этого ограничения недавно был открыт Breitbart и коллегами
(2003). Авторы использовали мет неполного «shotgun» геномного
секвенирования для осуществления метагеномного анализа
некультивированного вирусного сообщества в фекалиях человека.
Обнаружено, что фаги являются второй богатой категорией (после бактерий)
некультивированной фекальной библиотеке, содержащей 1200 различных ген
типов, 80% из них Siphoviridae. Вероятно, дальнейшая оптимизация этого
метода и развитие технологий микрочипов даст больше информации о
разнообразии фаговых популяций и особенностей взаимодействий между
фагами и бактериями ЖКТ.
До сих пор неопределенная доля фагов, «колонизирующих» ЖКТ
человека постепенно выделяется в окружающую среду из сточных вод.
Многочислен исследования были проведены для определения количества
различных баете офагов в образцах сточных вод (Lasobras et al., 1999; Hantula
228
et al., 1991; Puig al., 1999; Ketranakul and Ohgaki, 1989; Comax et al., 1990;
Havelaar and Hogebo 1984; Moce-Llivina et al., 2003; Leclerc et al., 2000; Duran
et al., 2002; Furuse et 1981; 1979; Osawa et al., 1981b; Tartera and Jofre, 1987;
Tartera et al., 1989), и не торые из них недавно были рассмотрены в обзоре
(Leclerc et al., 2000). Например, в одном исследовании (Lasobras et al., 1999)
были определены уровни сом ческих колифагов, F-специфичных РНКсодержащих фагов, и фагов В. fragilis двух установках для очистки воды в
Испании. Протоколы, использованные выделения, были скорее
оптимизированы для подсчета фагов в илистых почвах, нежели на
определение общих количеств фагов в образцах сточных вод. Так же
возможно, что часть фагов в образцах не была определена из-за особенностей
методических подходов; например, образцы ила центрифугировали короткое
время перед началом выделения фагов, супернатант был отобран (вероятно,
содержащий большое количество фагов), и только отжатый осадок был
обработан для подсчета фагов. Обнаружено, что концентрация фагов в
исследованных образцах довольно высока (например, около 105 БОЕ
соматических колифагов/г были выделены из исходных образцов ила, взятых
с биологической очистной станции). Другое исследование, проведенное в
Испании (Puig et al., 1999), показало преобладание фагов В. fragilis и S.
typhimurium в образцах городских сточных вод и сточных вод от животных.
Бактериофаги были выделены из всех образцов городских сточных вод и из
39% - 100% образцов сточных вод со скотобойни (процент положительных
образцов различался в зависимости от использованного для выделения
хозяйского штамма).
Концентрации бактериофагов различались в зависимости от образцов, и
они в целом были выше в образцах из города, чем со скотобоен.
Похожие наблюдения описаны в статье Leclerc и коллег (2000), в
которой авторы подсчитали ежедневные фаговые нагрузки специфичных к
мужским F+ штаммам фагов у разных животных (на голову). Авторы также
подсчитали количество фагов, выделяемых в окружающую среду (БОЕ/день)
229
на одно животное. Числа различались от низкого - 9х 102 БОЕ/день (собака) до
высокого 2x107 БОЕ/день (лошадь). Содержание в сточных водах было от
1,1х1012 БОЕ/день до 2,0x1013 БОЕ/день для некоторых, специфичных к
мужским штаммам, фагов. Фаги также были выделены из сточных вод в
Японии, Корее и других странах (Furuse et al., 1979, 1981; Furuse et al., 1983a;
Furuse et al., 1978; Furuse et al., 1983b; Havelaar et al., 1986; Havelaar et al., 1990;
Kai et al., 1985; Osawa et al., 1981a; Osawa et al., 1981b).
Как отмечено выше, количество фагов, выделяемых из ЖКТ человека в
ок-ружающую среду, не было пока точно определено, но некоторые
приблизительные подсчеты сделать возможно. Например, Puig и коллеги
(1999) сообщили, что средняя концентрация F-специфичных фагов S.
typhimurium WG 49 в сточных водах из 13 мест в 7 странах Европы была
приблизительно 7,7х103БОЕ/мл. Средний человек в США генерирует около
135 галлонов или 511 литров сточных вод в день (Anonymous, 1972). Таким
образом, при условии, что среднее число F-специфичных фагов в сточных
водах США такое же, как в Европе, число F-специфичных фагов,
приходящихся на одного человека в США, может быть подсчитано
следующим образом. 7,7х103БОЕ/мл х 511 л вода/человек/день =
3,9x1010фагов, специфичных против Salmonella серотип typhimurium штамм
WG49, теряется человеком в день. Согласно U.S. Bureau of the Census,
постоянное население США составляет приблизительно 292 млн. (на октябрь
2003); таким образом, число F-специфичных фагов в сточных водах США
будет достигать невероятной цифры в 1,1 х1010 БОЕ в день. Конечно, это очень
грубый подсчет, основанный, возможно, на многих неправильных
предположениях. Например, это допускает то, что фаги не размножаются в
сточных водах (допущение основано на ранее опубликованных данных
[Novotny and Lavin, 1971; Havelaar et al., 1990)] и что время жизни фагов в
сточных водах менее или равно 24 часам [что не является случаем Fспецифичных фагов, которые остаются жизнеспособными в сточных водах, по
крайней мере, несколько дней (Lasobras et al., 1999)]. Важно, что подсчет
230
основан только на численности F-специфичных фагов, другие фаги, также
присутствующие в сточных водах, не подсчитываются. Подобные оценки,
основанные на данных о преобладании фагов, полученные в ходе
исследований двух очистных сооружений в Испании (Lasobras et al.,1999),
говорят о том, что число соматических колифагов, теряемых человеком в день,
может быть даже выше, чем F-специфичных фагов. С другой стороны, число
бактериофагов В. fragilis, выделяемых человеком в день, намного ниже числа
F-специфичных фагов и колифагов (Lasobras et al., 1999). Наблюдаемая
разница в частоте встречаемости и титрах между фагами В. fragilis, F-
специфичных фагов и соматических колифагов вызвана низким
распространением фагов В. fragilis в ЖКТ человека. Другим возможным
объяснением наблюдаемого различия может быть то, что методологический
подход, использованный для подсчета фагов в сточных водах, больше
подходит для колифагов и F-специфичных фагов, чем для фагов, специфичных
более привередливой анаэробной В. fragilis. Тем не менее более быстрая
инактивация бактериофагов В. fragilis в сточных водах (по сравнению с
колифагами и F-специфичными фагами), возможно, не является
существенным фактором, так как было показано, что фаги В. fragilis и
соматические колифаги имеют одинаково низкие степени разрушения в
сточных водах, самые низкие среди всех исследованных фагов (Lucena et al.,
1994).
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]