Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
31
необычные структурные особенности. Некоторые из них можно видеть в
электронном микроскопе.
Рисунок 7 - Строение фагов Л и Т4. А. Икосаэдрический фаг Л с отростком.
Электронная микрофотография - очищенный препарат фага Л. На схеме
показаны капсид и отросток, состоящие из б и 11 белков соответственно.
Белки обозначены их буквенным кодом. Диаметр икосаэдрического капсида
составляет 50 нм, длина отростка - 135 нм. Отросток заканчивается
конической частью с одиночной терминальной нитью. Двухцепочечная ДНК,
содержащая примерно 48 т.п.н. (~50 генов), имеет линейную форму и липкие
концы. Левый конец, как следует из генетической карты, упаковывается
последним и выходит из головки (головкой называют капсид, содержащий
ДНК) в верхнюю часть полого внутреннего стержня отростка. Этот конец
ДНК впрыскивается в клетку первым.
Б. Удлиненный икосаэдрический фаг Т4 с длинным отростком. Электронная
микрофотография - очищенный препарат фага. Длина головки 100 нм,
ширина 75 нм. На рисунке указано расположение известных основных и
минорных белков головки и отростка. Вершины головки образованы
протеолитически расщепленным gp24, промежутки между вершинами
состоят из белков gpSoc, gpHoc и gp23. Двухцепочечная линейная ДНК(га1бб
т.п.н.) содержит примерно 130 известных генов и почти 100 функционально
не идентифицированных открытых рамок считывания. Каждый упакованный
геном имеет 5% избыточность на одном конце, вследствие чего полная
хромосома содержит 171 т.п.н. Геномная карта - кольцевая пермутированная.
Обе эти характеристики объясняются непрерывностью механизма упаковки
ДНК из конкатенированной ДНК-предшественника.
32
Геном фага А включает 50 т.п.н., т. е. его размеры примерно в 10 раз
больше, чем размеры генома фага <£>174, и на две трети меньше размеров
генома фага Т4. Фаг А обладает способностью как к литическому, так и к
лизогенному способу существования, и многие его гены служат для тонкой
регуляции, необходимой при выборе того или иного из этих путей развития.
Для вирулентных фагов характерно развитие по литическому пути
Размножение вирулентных фагов всегда вызывает лизис клетки-хозяина
Впервые литический жизненный цикл фага описали в 1939 г. Э. Эллис и
М. Дельбрюк по результатам своего знаменитого эксперимента с одиночным
циклом развития фага Т4 Escherichia coli. В этом эксперименте фаг добавляли
к клеткам Е. coli в количестве 10 частиц на клетку (m.o.i. = 10) в присутствии
KCN - ингибитора дыхания бактерий, внесенного до инфицирования, чтобы
предотвратить преждевременное развитие фага. Синхронное размножение
фага начиналось с момента суспендирования инфицированных клеток в
свежей среде без KCN. Через определенные интервалы времени из культуры
отбирали аликвоты и титровали для определения свободных фаговых частиц
(после отделения интактных клеток путем центрифугирования). Свободных
вирионов не наблюдалось в течение 22 мин после инфицирования - такое
время продолжался латентный период в цикле фага. Этот эксперимент
повторил в 1952 г. А. Дерман, добавив к нему новый важный этап определение жизнеспособных фаговых частиц внутри клеток- хозяев до
начала их лизиса. С этой целью он вызывал преждевременный лизис клеток
воздействием хлороформа и затем титровал лизаты. Новообразованные
вирионы обнаруживались внутри клеток через 12 мин после инфицирования.
В предшествующий период, называемый скрытой фазой, в отсутствие
жизнеспособных фагов в клетках, несомненно, присутствовала фаговая ДНК
(«вегетативный фаг»). Период времени от инфицирования до спонтанного
лизиса с высвобождением фагов в среду назван латентным периодом; за ним
следует период лизиса, когда все клетки разрушаются и культура становится
полностью прозрачной.
33
Рисунок 8 - Генетическая карта фага <рХ 174. На кольцевой карте <£>Х174
показаны 10 генов (А-Н, J, К), обеспечивающие образование 11 белков, и 2
межцистронные области, которые не транскрибируются. Одна область IR
содержит точку начала репликации для синтеза цепи ДНК и образует
складчатую вторичную структуру. Несколько генов перекрываются, что
экономит величину генома. Указаны предполагаемые функции продуктов
генов. Стрелками показаны промоторыи направление транскрипции.
Множество проведенных позднее детальных исследований показало,
что скрытая фаза, несмотря на свое исходное название - eclipse period, в
буквальном смысле - пустой, представляет собой наиболее активный период в
развитии фага. В это время действуют сложные регуляторные программы и
метаболизм клетки-хозяина
берется под контроль фаговым геномом. При этом быстро реализуется
программа получения определенных молекул от хозяина и экспрессии
продуктов собственного генома. Функции фага соответственно времени их
проявления разделяют на ранние и поздние, принимая за границу между ними
начало репликации фаговой ДНК.
Ранние гены фага Т4 имеют обычные промоторы, которые
соответствуют промоторам Е. coli и транскрибируются РНК-полимеразой
хозяина, содержащей собственную субъединицу а70 (см. разд. 18.9). Продукты
нескольких ранних генов отвечают за модификацию субъединиц РНК-полимеразы Е. coli путем ADP-рибозилирования (гены mod и alt) или добавления
новых <т-фак- торов (гены 33 для сг33 и 55 для и55); эти модификации делают
34
РНК-полимеразу специфичной к определенным ранним и ко всем поздним
промоторам. Модифицированная таким образом РНК-полимераза уже не
способна транскрибировать гены хозяина.
Все этапы репликации ДНК, начиная с синтеза предшественников
нуклеотидов, детерминированы ранними фаговыми генами. Функции поздних
генов в основном относятся к образованию морфологических компонентов и
сборке капсида. Примечательно, что ранние и поздние гены в большинстве
локализованы в двух раздельных кластерах на геномной карте и
транскрибируются в противоположных направлениях с различных цепей
ДНК.
Традиционно функции фагов разделяют на ранние и поздние. Ранние
гены участвуют главным образом в преодолении защитных барьеров клеткихозяина и переориентации ее метаболизма на образование фаговых частиц и
репликацию фаговой ДНК. Поздние гены участвуют в образовании белков
оболочки фага и его сборке с последующим выходом вирионов и лизисом
клетки.
Период между адсорбцией и лизисом существенно варьирует по
длительности у различных фагов. У фагов Т1 и Т5 цикл развития завершается
через 12 мин после инфицирования, тогда Цикл развития фагов начинается
после их адсорбции на поверхности клетки-хозяина и проникновения в нее
фаговой ДНК.
Первый контакт между фагом и клеткой-хозяином происходит в
результате случайного столкновения. Если клетка несет на поверхности
специфические рецепторы, может последовать стабильное связывание
(адсорбция) фага. Взаимодействие обычно опосредуют рецепторные белки
клетки и специфические фаговые белки, локализованные на кончике отростка,
нитях отростка или, как в случае нитевидных фагов, на одном из концов фага.
Фаг Т4 распознает соответствующие ему рецепторы посредством белка gp37.
Димер этого полипептида присутствует в дистальной части длинных нитей
отростка. У некоторых фагов (А и Т4) стабильной адсорбции предшествует
35
стадия временной, обратимой адсорбции как фагу Т4 требуется на это 30 мин,
фагу А - до 65 мин. Особенность нитевидных фагов состоит в том, что они не
лизируют клетки-хозяева, но непрерывно производят новые фаговые частицы,
которые выходят наружу сквозь клеточную оболочку. В этом случае проходят
часы, прежде чем метаболизм клеток-хозяев окончательно нарушится и
ослабленные клетки утратят способность продуцировать фаговые частицы.
Рецепторами фагов могут служить многие компоненты оболочки бактерий, в
том числе компоненты наружной или внутренней мембраны либо клеточной
стенки. Фаг Т4 связывается с липополисахаридом (ЛПС), входящим в состав
наружной мембраны. Фаг А адсорбцируется на клетках Е. coli путем
взаимодействия с мембранным белком LamB, представляющим собой
мальтодекстриновый порин наружной мембраны. Нитевидные ДНКсодержащие фаги прикрепляются к верхушке половых пилей мужских
бактериальных клеток, тогда как РНК-содержащие фаги - к боковым сторонам
тех же пилей. В случае мутаций гена рецептора клетки приобретают
устойчивость к определенным фагам. Фаги способны преодолевать эту
устойчивость благодаря мутациям их генов, кодирующих белки, которые
распознают рецепторы (приспособительная супрессия). Такие фаги называют
мутантами с измененным кругом хозяев.
Фаги Ми и Р1 обладают сложной генетической системой, позволяющей
им сменять хозяев. Участок гена, кодирующего белок адсорбции, может
инвертироваться в результате сайт-специфичной рекомбинации, после
которой считывание его происходит уже в противоположном направлении.
Такое переключение осуществляется настолько часто, что примерно
50% фаговых частиц-потомков представляет собой фаги с одним кругом
хозяев и 50% - с другим.
Некоторым фагам для эффективной адсорбции требуются кофакторы.
Например, фаг Т4 нуждается в L-триптофане для полного развертывания
нитей его отростка перед адсорбцией. Другие фаги, такие как А и Р1,
нуждаются в добавлении генов Са2+ и Mg2+ соответственно.
36
За стабильной адсорбцией на поверхности клетки немедленно следует
впрыскивание фаговой ДНК в клетку. Хотя механизм этого процесса до конца
не ясен, считается, что энергию, необходимую для переноса ДНК,
обеспечивают в том числе силы отталкивания между отрицательно
заряженными боковыми группами высококонденсированной ДНК. Фаг Т4
несет несколько молекул лизоцима, прикрепленных к базальной пластинке
отростка, по-видимому для локального гидролиза пептидогликана клеточной
стенки. Фагу А для инъекции своей ДНК требуется участие клеточной
системы транспорта углеводов, а именно маннозо-специфичной
фосфотрансферазной системы (гены manXYZ). Перенос фаговой ДНК через
плазматическую мембрану, по-видимому, не требует дополнительной энергии
[протондвижущей силы (Ар) или АТР] и, скорее всего, происходит через поры
или каналы.
В случае фага Т4 протонный потенциал на мембране, видимо, важен для
поддержания поры (канала) в открытом состоянии или для образования
участка активного прикрепления.
За исключением некоторых фагов, например Т5, процесс инъекции
протекает очень быстро. Интересно, что фаг Т5 впрыскивает свою ДНК в две
стадии, вначале перенося ее на 8% длины от проксимального конца
хромосомы (FST DNA) и затем, после паузы примерно в 4 мин, вводя
дистальную часть (опДНК). Во время паузы происходит экспрессия генов,
находящихся на проксимальном конце генома, и синтезируются кодируемые
ими белки, которые разрушают геном клетки-хозяина, инактивируют ее
рестриктазы и, наконец, обеспечивают продолжение процесса инъекции.
Проксимальная последовательность ДНК предположительно не содержит
сайтов рестрикции, чувствительных к рестрикта- зам хозяина.
Как было установлено в историческом эксперименте А. Херши и М.
Чейз, в клетку проникает только ДНК фага, но не его белки. В этом опыте
белок и ДНК фага Т2 дифференцированно метили [35S] и [32Р]
соответственно. Среди фаговых частиц-потомков, высвобождавшихся после
37
заражения клеток родительскими фагами с двойной меткой, некоторые
содержали [32Р], но не было фагов, меченных [32S]. В настоящее время
известно несколько исключений из этого правила; у некоторых фагов вместе с
хромосомой инъецируется небольшое количество белков. Например, фаг Т4
несет копии белка gp2, связанные с обоими концами его ДНК. Этот белок мол.
массой 25 кДа эффективно защищает ДНК от ранней фрагментации под
действием белка рекомбинации и репарации RecBCD клетки-хозяина
(экзонуклеаза V). Следовательно, фаги, у которых отсутствует белок gp2,
могут развиваться только в том случае, если у хозяина не функционирует
RecBCD-экзонуклеаза.
Рисунок 9 - Различные стадии развития фага ТА (электронные
микрофотографии).
A.Свободная фаговая частица. Б.Фаг, адсорбированный на поверхности
клетки Escherichia coli и инъецирующий свою ДНК (вверху - поясняющий
рисунок). B.Клетка с адсорбированными фагами и новообразованными
фаговыми частицами в цитоплазме. Г.Клетка с адсорбированными фагами и
внутриклеточными фагами, прикрепленными к мембране. Д.Лизированная
клетка. Размеры головки фага Т4 -100 х 75 нм.
38
Эксперимент Херши и Чейз не дал бы своих исторических результатов,
если бы авторы выбрали для него взамен Т2 нитевидные фаги, поскольку,
например, нитевидный фаг М13 проникает в клетку бактерии целиком. В
процессе пересечения мембраны ДНК этого фага освобождается от
окружающего ее белка оболочки. Позднее старый белок оболочки
возвращается в цикл и вновь используется для того, чтобы «одеть» новые
хромосомы фагов-потомков на их пути через клеточную мембрану наружу.
Наиболее ранние этапы фаговой тинфекции обеспечивают переориентацию
метаболизма клетки-хозяина на продукцию фаговых частиц. Фаг Т4 образует
в цикле инфекции примерно 600 копий своей хромосомы. Из них примерно
половина полностью упакована к моменту лизиса клетки в инфекционные
фаговые частицы. Остальные копии ДНК остаются не полностью
упакованными и теряются после лизиса. Сверхпродукция - это, вероятно,
плата за быстрое развитие. В течение 30 мин активного жизненного цикла
ДНК-полимераза Т4 связывает примерно 108 п.н. (600 • 1,7 • 105), синтезируя
высокополимерную ДНК. Для сравнения, приблизительно за такое же время
Е. coli реплицирует свою хромосому только один раз, что эквивалентно
полимеризации примерно 2 • 106 п.н. Таким образом, Т4 реплицирует ДНК
почти в 100 раз быстрее, чем Е. coli. Это требует участия быстродействующих
ферментов, кодируемых фагом Т4, и достаточного поступления
дезоксинуклеотидтрифосфатов. Будучи паразитом, фаг Т4 использует как
источник нуклеотидов хромосому клетки-хозяина.
При детальном изучении цикла инфекции в случае фага Т4 можно
наблюдать резкие изменения в хромосоме клетки-хозяина, в норме свернутой
в компактную структуру - нуклеоид. Нуклеоид теряет компактную форму,
затем распадается и, наконец, разрушается. Эти события независимы одно от
другого, и известны мутации, которые влияют на одно из них, не затрагивая
остальные.
Хромосома Е. coli, в норме свернутая с образованием многочисленных
отрицательных сверхвитков, постепенно разворачивается. Это зависит от
39
функционирования продукта гена unf/alc фага Т4, который несет двойную
функцию и необходим также для блокады транскрипции ДНК хозяина,
содержащей цитозин. Ген разрушения нуклеои- да ndd ответствен за
передвижение ДНК из центральной области клетки к ее периферии, где она
прикрепляется к внутренней мембране. Продукт этого гена, белок мол. массой
15 кДа, синтезируется вскоре после инфицирования (через 3-6 мин) в
стехиометрическом количестве - примерно 4000 молекул на инфицированную
клетку - к концу ранней стадии инфекции.
Затем происходит деградация клеточной ДНК, инициируемая двумя
фаговыми эндонуклеазами: эндонуклеазой II (ген denA, от deficient for
endonuclease А) и эндонуклеазой IV (ген denB, от deficient for endonuclease В).
Оба эти фермента разрушают только цитозинсодержащую ДНК (т. е. ДНК
хозяина) и не затрагивают модифицированную фаговую ДНК с полностью
глю- козилированными и гидроксиметилированными цитозиновыми
остатками. Деградация ДНК клетки-хозяина начинается с массированного
эндонуклеолитического расщепления этими ферментами и в конце концов
приводит к образованию мононуклеотидов под действием мембраносвязанной
экзонуклеазы (предположительно gp46 и gp47).
Нуклеотиды, высвобождающиеся в результате деградации клеточной
ДНК хозяина, фаг Т4 использует для собственного размножения: их
достаточно для образования примерно 20 копий фагового генома.
Необходимый процессинг этих рециклизованных нуклеотидов
осуществляется сложной системой из 14 ферментов, 12 из которых кодирует
фаговая ДНК.
40
Рисунок 10 - Синтез предшественников ДНК в клетках Escherichia coli,
инфицированных фагом Т4. ДНК фага Т4 содержит вместо дезоксицитозина
(dC) глюкозилированный гидроксиметилдезоксицитозин (dHMC). Чтобы
гарантировать полную замену dC на dHMC в ДНК дочерних вирионов,
требуется 14 продуктов генов, 12 из которых кодирует фаг Т4. ДНК этого
фага устойчива почти ко всем ферментам рестрикции и многим обычным
нуклеазам благодаря присутствию в ней глюкозилированного dHMC.
Основной пул дезоксинуклеотидмонофосфатов образуется путем синтеза de
novo и в результате вызываемой фагом деградации ДНК хозяина. Некоторые
из этих реакций катализируют ферменты хозяина (показано жирными
стрелками), часто с участием кодируемых фагом ферментов с аналогичными
функциями (показано тонкими стрелками). Однако образование характерного
для Т4 dHMC зависит исключительно от фаговых генов. Глюкозилирование
остатков цитозина (начинающееся с образования UDPGIc) происходит в
синтезированной ДНК и регулируется фаговыми генами
А. Хромосомы дочерних частиц фага М13 появляются после репликации
в виде колец одноцепочечной ДНК, защищенной от действия нуклеаз
покровом из димеров белка gp5, связанного с оцДНК. Белки gp7 и gp9
связываются с крупной шпилечной структурой (сигнал упаковки) в межгенной
области ДНК. В зрелой частице эти белки локализованы на одном ее конце. Б.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]