Бактериофаги. Учебно-методическое пособие

стала возможной рекомбинация последовательностей ДНК из различных источников в условиях in vitro и, таким образом, создание искусственных генных конструкций. Следует подчеркнуть, однако, что используемые в генной инженерии ферментативные методы можно считать аналогами природных феноменов, поскольку in vivo эти ферменты служат для осуществления тех же самых основных реакций.

репликации, с которой может начинаться синтез ДНК по механизму катящегося кольца, и два фагоспецифичных белка - белок оболочки gp8 и белок адсорбции gp3. Эти модули могут происходить из различных нитевидных фагов, и их можно комбинировать с другими необходимыми модулями, происходящими, например, из плазмид. Благодаря большим возможностям комбинирования эта система позволяет получать конструкты со смешанными функциями, называемые фагмидами, поскольку они содержат компоненты фагов и плазмид. Следует отметить, что белок оболочки gp8 не является частью самого вектора, а поставляется хелперным фагом, добавляемым позднее в процессе роста фагмид-содержащих клеток. Принцип этой системы довольно прост. Гены вариабельных областей тяжелой цепи и соответствующей легкой цепи антител выделяют из антителообразующих клеток (например, клеток ги- бридомы или селезенки мыши). Конструкцию создают таким образом, чтобы тяжелая и легкая цепи были связаны коротким искусственным пептидом и чтобы оба пептида, происходящие из антитела, могли образовать присущую им индивидуальную структуру антигенного домена. Затем эту конструкцию клонируют, помещая ее в ДНК после индуцибельного промотора и перед геном 3 вектора. При индукции связанные последовательности антител транслируются вместе с геном gp3. После упаковки векторной ДНК в фаговую частицу составной белок переносится на ее поверхность, в место естественной локализации gp3 как белка адсорбции. Упаковка ДНК начинается после добавления фагов-помощников, обеспечивающих доставку gp8. Каждая фаговая частица несет на поверхности составной белок, образующий иммуноглобулиновый домен. Функциональные домены отбирают путем инкубации фаговых частиц с антигеном, который исходно был использован для иммунизации эукариотического организма. Негативные фаги с нереактивными антителами теряются при очистке. Позитивные фаги с реактивными антителами можно использовать для образования фагоподобных частиц в неограниченных количествах. Возможно даже получение чистых антител, если использовать другого хозяина, в

Фаги сильно различаются по своей чувствительности к различным химическим и физическим агентам. Это их поведение обычно непредсказуемо и требует в каждом конкретном случае экспериментального анализа. Например, никто до сих пор не объяснил устойчивость фага Т1 к высушиванию, которая привела ко многим бедам как на биотехнологических производствах, так и в лабораториях, из-за контаминации вездесущими Т1­подобными фагами. Однако существуют определенные общие принципы. Например, все фаги очень чувствительны к УФ излучению в области 260 нм, также как и к длинноволновому: хорошо известен вирицидный эффект солнечного света, и есть множество сообщений о коллекциях фагов, потерянных из-за хранения в холодильниках, освещенных лампами дневного света. Есть и другие факторы, способные влиять на жизнеспособность фагов: pH, аскорбиновая кислота, мочевина, уретан, детергенты, хелатирующие агенты, иприт, спирты и тепловая инактивация. Наиболее исчерпывающая информация о влиянии химических и физических агентов на фагов представлена в книге Адамса (1959); очень интересные данные приведены Аккерманом (1987).

Как было сказано ранее, бактериофаги - вирусы, которые способны инфицировать бактерий. Подобно сложным космическим станциям, фаги состоят из множества белковых деталей и путешествуют от одной чувствительной к ним бактерии к другой, перенося свой геном. Каждая фаговая частица (вирион) содержит геном, представленный молекулой (в некоторых случаях несколькими молекулами) ДНК или РНК, заключенный в белковую или липопротеиновую оболочку (капсид); нуклеиновая кислота и капсид вместе формируют нуклеокапсид. Мишенью для каждого вида фага является определенная группа бактерий. Эта группа может быть представлена некоторым набором штаммов одного вида, но штаммы нескольких

Некоторые фаги содержат в своем геноме всего несколько тысяч пар оснований; в то же время фаг G, самый большой из секвенированных к настоящему моменту, имеет 480 тысяч пар оснований - столько же, сколько и некоторые бактерии-микоплазмы, которые в отличие от фага имеют в собственные гены для строительства рибосом и других необходимых клеточных структур. Более 95% фагов, описанных в литературе, принадлежат к семейству Caudovirales. Приблизительно половина массы их вирионов приходится на двухцепочечную молекулу ДНК, другую половину составляет белок; икосаэдрические головки этих вирусов построены из большого числа копий одного или двух белков. Вершины икосаэдра построены из пентамеров белка, а грани - из гексамеров того же или сходного белка - уложенны в плоскую гексагональную решетку.

клеток умеренный фаг инициирует литический цикл, приводящий к лизису клетки и выходу новых фагов, как описано ранее. Однако в некоторых случаяхфаг может пойти по пути лизогенизации; вместо немедленной репликации фаговый геном принимает покоящуюся форму, называемую профагом, часто интегрированную в бактериальный геном, но иногда существующую и в виде плазмиды. Такая форма способна существовать скольугодно долго, реплицируя геном вируса в процессе деления клетки; эти бактерии называют лизогенизированными или лизогенными, потому что в некоторых клетках лизогенной культуры профаг спонтанно выходит из покоящегося состоянияи вступает в литический цикл. Факторы, влияющие на выбор между лизогенным или литическим путем, обсуждаются ниже. Как описано Levinи Lenski (1985), лизогенное состояние - высокоразвитое, требующее коэволюции вируса и хозяина, что, вероятно, отражает различные выгоды для обоих.

Умеренные фаги помогают защищать клетку хозяина от инфицирования другими фагами и могут вызвать значительные изменения свойств хозяина, включая систему рестрикции-модификации, устойчивости к антибиотикам и другим влияниям окружающей среды. Они способны конвертировать фенотип хозяина в патогенный, как у возбудителей дифтерии или энтерогеморрагической Е. coli(ЕНЕС). Бактериофаг лямбда (А.), Р, Ми и многие фаги молочнокислых бактерий входят в число наиболее изученных умеренных фагов (из-за мутаций определенных генов могут возникать вирулентные мутанты умеренных фагов, однако они все еще считаются членами соответствующих семейств умеренных фагов.)

бы в жестком контроле при длительной лизогении. Они всегда несут репрессорный белок, который действует на несколько сайтов-операторов, чтобы блокировать транскрипцию других генов фага. Этот репрессор может быть единственным белком, кодируемым фагом, и экспрессируемым в состоянии лизогении, но часто с профага экспрессируется целый ряд генов, полезных для выживания клетки-хозяина профагов. Репрессор также блокирует литическую инфекцию другими фагами из той же группы иммунности - то есть фагами, чьи гены могут регулироваться тем же репрессором.

Д’Эрелль (1926) и Адамс (1959) описали это явление одними из первых. Для большинства фагов реакция нейтрализации следует кинетике первого порядка до инактивации около 99% фагов, после чего процесс замедляется. Выжившие, более резистентные вирусные частицы, часто образуют бляшки меньшего размера. Активность препарата антител при стандартной температуре и концентрации соли характеризуется константой скорости К, которая связана с логарифмом процента фагов, все еще способных инфицировать бактерии после данного времени экспозиции t. Как подчеркивал Адамс, такой фактор, как концентрация соли, очень важен при титровании активности антител, так как при концентрации моновалентных катионов более 102М и бивалентных более

мембранами цепь транспорта электрона и удаляются при восстановлении кислорода до воды (при обычном аэробном дыхании) или, при анаэробном дыхании, с восстановлением железа (III) до двузарядного иона, сульфата до сульфида, фумарата до сукцината либо нитрата до нитрита или молекулярного азота.