Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
161
было обнаруже Немного фагоустойчивых мутантов Е. coli обнаружили у
получавших лече) фагами телят и поросят; как бы то ни было, у них был
фенотип КЗ О' и К101, i время тестов на животных оказалось, что
вирулентность их значительно ш чем у родительских штаммов дикого типа.
В серии дальнейших исследований Smith и коллег (1987b; 1987а) снова
пользовались инфицированные кишечной палочкой телята для измерения
эффективности фагового лечения. В ходе одного из этих исследований (Smith
et al., 1987b) они также измеряли чувствительность фагов к разным условиям,
с которыми эти вирусы могут столкнуться в процессе применения для лечения
животных. Авторы отметили, что низкий уровень pH содержимого сычуга
повлиял на жизнеспособность фагов, введенных перорально, но это вредное
влияние снижалось, если фагов давали вскоре после кормления молоком.
Похожий эффект достигался также при добавлении бикарбоната натрия в корм
перед или во время лечения фагами per os. В данном случае следует отметить,
что нейтрализация желудочного сока бикарбонатной минеральной водой
незадолго до введения фагов было обычной практикой при проведении
фаговой терапии людей в Советском Союзе и Восточной Европе.
Экспериментальные инфекции Е. coli у кур и телят-отъемышей
Исследования Smith и Huggins, которые были описаны несколькими
авторами (Barrow and Soothill, 1997; Sulakvelidze et al., 2001) и
проанализированы с использованием математических моделей и
статистического анализа (Levin and Bull, 1996), снова разожгли интерес к
фаговой терапии на Западе. Например, Barrow и коллеги (1998) использовали
бактериофагов Е. coli, прикрепляющихся к К1 антигену (изолированных из
сточных вод) для предупреждения септицемии и менингито-подобной
инфекции у кур, вызванных штаммом KL Е. coli. У цыплят без лечения
экспериментальная инфекция привела к 100%-ной смертности после
внутримышечной (в.м.) инокуляции 106 КОЕ. (CFU, КОЕ колониеобразующие единицы); в то же время однократная внутримышечная
инъекция фагового препарата перед заражением предупредила заболеваемость
162
и смертность. Эффективность фагового лечения зависела от дозы: лучшая
защита была достигнута при инъекции высоких доз фагов (например, 106
БОЕ). Инъекция 104 БОЕ обусловила значительную, хотя и меньшую защиту,
102 б.о.е. слабо защитили цыплят. Защитный эффект достигался, если
применение фагов было задержано до начала проявления признаков болезни.
Также обнадеживающие результаты были получены в экспериментах с
телятами. Например, пероральное заражение (около 1010 КОЕ с помощью
желудочного зонда) двух телят-отъемышей штаммом К1+ Е. coli вызвало
тяжелую септицемию через 18-36 часов, в это время их умертвили из
соображений гуманности. Для сравнения: трое из четырех телят, получивших
фаговый препарат через 8 часов после заражения, остались здоровыми и
четвертый оказался слегка больным (Barrow et al., 1998). Число телят в
эксперименте было слишком малым для статистического анализа, но фаговое
лечение, видимо, имело значительный терапевтический эффект.
Инфекции, вызванные Е. coli у мышей, и «длительно циркулирующие»
бактериофаги
Инфицированные кишечной палочкой мыши были использованы в
качестве модели для измерения эффективности in vivo «длительно
циркулирующих» бактериофагов как антимикробных агентов (Merril et
al.,1996). Авторы предположили, что отрицательное влияние на фаговую
терапию может оказывать быстрое удаление фагов различными защитными
механизмами млекопитающих, в особенности ретикулоэндотелиальной
системой. Таким образом, в целях снижения элиминации фагов они
использовали метод естественного отбора (который они назвали методом
«серийных пассажей») для получения фагов Е. coli, обладающих повышенной
способностью сохраняться в кровотоке мышей. Например, для получения
мутантов фага X, имеющих такое свойство, мышам были введены
интраперитонеально 105БОЕ фага X, W60, через 7 часов после инъекции
отбирались образцы крови, фаги, остававшиеся в крови, вновь наращивали и
вводили мышам, повторив этот цикл фага (инъекция животным, выделение,
163
наращивание) еще девять раз. Используя этот метод, авторы получили
мутантов фагов Е. coli AW60 и S. typhimurium Р22, способных циркулировать
у мышей значительно дольше, чем родственные фаги дикого типа. После
успешного получения мутантов, авторы сравнили соответствующие
способности фага X дикого типа и «серийно пассированных» мутантов
защищать 1-недельных мышей BALB/c от экспериментальной колисептицемии и обнаружили, что однократная интраперитонеальная инъекция
любого из двух длительно циркулирующих фагов, была более эффективна в
лечении мышей, чем однократная инъекция фага дикого типа, что говорит о
положительном влиянии длительного сохранения высоких фаговых титров в
крови на эффективность фаговой терапии.
Респираторные коли-инфекции у кур
В университете Арканзаса недавно была проведена серия исследований
по изучению возможностей фаговой терапии для предотвращения
смертельных респираторных инфекций, вызванных Е. coli у цыплятбройлеров. В ходе первого исследования (Huff et al., 2002b) авторы
осуществили 3 отдельных эксперимента. Первый эксперимент заключался в
заражении (введением в воздушный мешок) групп трехдневных цыплят
смесью, содержащей (i) 103 КОЕ Е. coli и 103 или 106БОЕ фага и (ii) КОЕ Е.
coli и 104 или 108 БОЕ фага. Во втором эксперименте птицы в возрасте одной
недели пили воду, содержащую 103 или 104 БОЕ/мл фага перед тем, как им
инъецировали 103 КОЕ Е. coli в воздушный мешок, или они пили воду,
содержащую фаг в концентрации 104 или 106 БОЕ/мл, перед заражением 104
КОЕ Е. coli. В течение третьего эксперимента однонедельные цыплята были
заражены 104 КОЕ Е. coli, затем им давали воду, содержащую фаг в титре 105
или 106 БОЕ/мл. В первом эксперименте смертность цыплят, зараженных
103КОЕ Е. coli, составила 80%; однако смертность была снижена до 20% и 5%
соответственно, когда птиц заразили смесью бактерий и 103 или 106 БОЕ фага.
Птицы, зараженные 104 КОЕ, имели уровень смертности до 85%, который
снизился до 35% и 0% , когда они были заражены смесью, содержащей
164
бактерий и 104 и 108 БОЕ фагов соответственно. С другой стороны,
применение фагов не защитило птиц во втором и третьем эксперименте. Во
втором исследовании (Huff et al., 2002а) авторы доложили, что аэрозольное
применение бактериофагов было эффективным в предотвращении летальных
респираторных инфекций Е. coli у цыплят-бройлеров. Третье исследование
авторов заключалось в сравнении аэ-розольного введения, и внутримышечных
инъекций бактериофагов в предотвращении летальных респираторных
инфекций Е. coli у цыплят-бройлеров (Huff et al., 2003b). Еще одно
исследование этих авторов было направлено на сравнение эффективности
однократных и многократных внутримышечных инъекций бактериофагов при
лечении острой, вызванной Е. coli, респираторной инфекции у цыплятбройлеров (Huff et al., 2003а). Как и в предыдущих исследованиях, авторы
обнаружили, что бактериофаги защищали птиц от респираторной инфекции Е.
coli и что результат лечения фагами зависел, помимо всего прочего, от пути
введения фагов (например, добавление фагов в воду не защищало птиц). Хотя
результаты вышеописанных исследований обнадеживают, они должны быть
осторожно интерпретированы. Например, как описано в разделе 13.2.2 этой
главы, смешивание фага с бактериями может привести к тому, что фаги заразят
бактерий до инъекции скорее, чем in vivo. Таким образом, некоторые или все
из представленных положительных результатов, могут быть артефактами,
вызванными применяемыми экспериментальными протоколами.
Инфекции Enterococcus faecium
Недавно было оценено значение использования бактериофагов для
предотвращения и лечения бактеремии, вызванной ванкомицин-устойчивым
энтерококком (VRE), на мышиной модели (Biswas et al., 2002). Авторы
разработали модель на основе заражения мышей Е. faecium для определения
эффективности фагового лечения для предотвращения летальной септицемии,
вызванной интраперитонеальной инъекцией Ю9КОЕ ванкомицинустойчивого штамма Е. faecium.
165
Однократная интраперитонеальная инъекция (произведенная спустя 45
минут после бактериального заражения) 3х 109 или 3х 108 БОЕ фагового
препарата с хорошей активностью in vitro против данной бактерии защитила
всех мышей; эффективность лечения зависела от дозы. Когда лечение было
отложено до начала падежа животных (от 18 до 24 часов после инфекции),
около 50% из них удалось спасти однократной инъекцией фагового препарата.
В обоих случаях выздоровление сопровождалось значительным уменьшением
числа патогенных бактерий в кровотоке животных. Авторы также изучили,
были ли необходимы для защитного эффекта живые фаги, которые могут
расти на бактерии-хозяине, или «фаговое спасение» могло оказаться функцией
неспецифического иммунного ответа, вызванного введением фага. Фаговый
препарат (около 1010 БОЕ/мл) был нагрет (80°С, 20 минут), и инактивация
фагов была подтверждена посевом препарата на газон чувствительной
культуры. Через 4 дня после заражения Е. faecium 80% мышей, получивших
лечение активным препаратом фага, выжили; тем временем в группе мышей,
обработанных инактивированным нагреванием фаговым препаратом, выжили
только 10%. Процент выживаемости в последней группе был идентичен
проценту выживших мышей в контрольной группе (получавших PBS вместо
фага). Результаты были статистически значимыми (Р<0,0006). Авторы также
проверили предположение, что исчезновение лечебного эффекта у прогретого
препарата может объясняться инактивацией или денатурацией других
компонентов фагового препарата (например, компонентов среды), которые
могли обладать терапевтической иммуностимулирущей активностью. Для
этого они сравнивали защитные возможности in vivo двух Е. faecium фагов с
разной литической активностью против штамма возбудителя Е. faecium in vitro
(то есть один фаг образовывал бляшки на газоне штамма возбудителя, а другой
нет). Все инфицированные мыши, которых лечили препаратом вирулентного
фага, выжили, в то время как уровень выживаемости инфицированных мышей,
пролеченных неактивным фаговым препаратом и фосфатным буфером (PBS),
составил 20% и 50% соответственно. Этот результат поддерживает теорию,
166
что наблюдаемый терапевтический эффект у мышей имеет место благодаря
присутствию живых фагов с литической активностью против штамма
возбудителя, а не из-за неспецифической иммуностимуляции. Многократно
привитые мыши не обнаруживали анафилактических реакций, лихорадки или
других побочных эффектов
Инфекции Vibrio cholerae
Sarkar и коллеги (1996) исследовали способность фагов V. cholerae
снижать in vivo уровни V. cholerae и уменьшать накопление жидкости,
вызванное холерным токсином, в модели петли подвздошной кишки кролика.
Десять фагов были инъецированы вместе или отдельно штаммом возбудителя
V. cholerae (МАК 757 или АТСС 51352) в петлю подвздошной кишки
беспородных новозеландских кроликов. Как отрицательный контроль
использовали PBS, а токсигенный штамм V. cholerae 569В - как
положительный. Животных умертвили через 18 часов после заражения и
измерили уровни накопления жидкости и число патогенных бактерий в петле
кишки. Было отмечено, что применение фагов не имело профилакти-ческого
эффекта, так как оно не уменьшало численность бактерий-возбудителей и не
снижало уровня накопления жидкости в петле подвздошной кишки. В этом
исследовании специально не анализировалась способность фагов лизировать
in vitro бактерий-возбудителей; тем не менее, так как была использована
большая коллекция фагов, вероятно, что хотя бы некоторые из них имели in
vitro литическую активность против данного штамма возбудителя. Авторы
предположили, что хотя антихолерные фаги сохранялись в кишке на
протяжении экспериментов, некоторые компоненты кишечной среды могли
ингибировать их активность против патогенного штамма V. cholerae.
Судя по ранней истории широкого и успешного использования
бактериофагов в предупреждении и лечении холеры у людей, отрицательный
результат вышеописанного исследования говорит о том, что модель петли
подвздошной кишки может не являться оптимальной для оценки
эффективности использования фагов в предупреждении и лечении
167
естественно вызванной холеры у людей. Это также подчеркивает, как пока
мало известно о взаимодействии фагов и их бактерий-мишеней в кишечном
тракте млекопитающих.
Инфекции Clostridium difficile
Ramesh и коллеги (1999) охарактеризовали способность фагов
предупреждать смертельное воспаление толстого кишечника и слепой кишки
(илеоцекита), вызванное С. difficile у экспериментально зараженных хомяков.
Эксперименты были организованы таким образом, чтобы изучить много
факторов, влияющих на эффективность фаговой терапии у животных;
например, сохранение фагов в теле животного, влияние желудочного сока на
жизнеспособность фагов, оптимальные режимы дозирования и т.д.
Бактериофаги, использованные в этом исследовании, были выделены из
лизогенного штамма С. difficilei, а в качестве экспериментальных животных
использовались 26 взрослых хомяков. Группы la, lb, 1с содержали по 6
хомяков каждая, группы 2 и 3 - по 4 хомяка. Для облегчения возникновения
клостридиальнош илеоцекита хомяки из групп 1 и 2 получили клиндамицин
перед заражением (3 мг/ 100г веса, внутрижелудочно); хомяки контрольной
группы 3 получили физраствор вместо антибиотика. 24 часа спустя
желудочная кислота была нейтрализована (посредством введения 1 М
бикарбонатного буфера орально; 1 мл на животное), и животным
внутрижелудочно ввели суспензию (1 мл, содержащий 103 КОЕ) патогенного
штамма С. difficile. Сразу после бактериального заражения хомяки из групп la,
lb, 1 с получили фаговый препарат (1 мл 108 БОЕ). Хомяки из групп lb и 1с
получили дополнительные дозы фагового препарата через интервалы в 8
часов, в течение 48 и 72 часов соответственно (желудочная кислотность была
нейтрализована с помощью внутрижелудочного введения бикарбонатного
буфера сразу после очередного применения фагов). Хомяки в группах 2 и 3
служили контролем, то есть им не давали фаговых препаратов. Все животные
в контрольных группах умерли спустя 96 часов после инфицирования; в то же
время, за исключением одного хомяка, все животные, получавшие фаговый
168
препарат, выжили. Фаги не обнаруживались в содержимом слепой кишки
вскоре после получения последней дозы фагового препарата. Фаговая терапия
не имела длительного защитного эффекта у хомяков; в частности, когда
выжившие хомяки были обработаны клиндамицином и снова заражены С.
difficile (через 2 недели после окончания фаговой терапии), они погибли спустя
96 часов. Фаг С. difficile, использованный в эксперименте, не был тщательно
охарактеризован и он, возможно, не был оптимальным выбором для фаговой
терапии из-за его лизогенизирующего потенциала и, таким образом, вероятно
обладал литической активностью ниже оптимальной. Тем не менее результаты
исследования показали, что инфекции С. difficile поддаются фаговой терапии
и они подчеркивают важность нейтрализации желудочного сока перед
применением фагов перорально. Как отмечено ранее, протокол, включающий
нейтрализацию желудочного сока также предложили другие исследователи
(Smith et al., 1987b), и это было общей практикой при проведении фаговой
терапии у людей в Советском Союзе и Восточной Европе.
Инфекции Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa и
Staphilococcus aureus
Soothill (1992) изучал эффективность фагов в лечении мышиных
инфекций, вызванных Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa и
Staphilococcus aureus. Фаги, специфичные к A. baumanii и Р. aeruginosa, были
выделены из сточных вод Бирмингема, Великобритания, Staphilococcus
aureus-специфичныйфаги-131 был получен в Институте иммунологии и
экспериментальной терапии (Вроцлав, Польша). Защитный эффект фагов
измеряли на группах взрослых беспородных мышей, инфицированных
интраперитонеально заранее установленной летальной дозой бактерий
одновременно с фаговыми препаратами. Снижение температуры тела (до
34°С) было решено считать признаком скорой смерти; таким образом, когда
температура тела инфицированных мышей достигала 34°С, их умерщвляли, и
органы и ткани были исследованы на предмет наличия бактерий-возбудителей
и бактериофагов. Всего лишь 102 БОЕ специфичного фага A. baumanii
169
защищали мышей от 5 ДЦ50 вирулентного штамма A. baumanii, причем фаги
размножались в организмах мышей в течение эксперимента.
Результат также подтвержден отрицательными посевами на A. baumanii
у вылеченных фагами мышей. В случае инфекции Р. aeruginosa для защиты
мышей от заражения требовалась намного большая доза соответствующего
фагового препарата, но защитный эффект был значительным против 5 и 10
ЛД50 доз бактерий. Для сравнения: специфичный фаг S. aureus (который был
слабо вирулентным in vitro) не защитил мышей от смертельного воздействия
двух патогенных штаммов S. aureus. Интересно, что тот же фаг S. aureus
широко и успешно использовался в лечении S. aureus инфекций у людей в
Польше (Slopek et al., 1987). Причина видимых расхождений в результатах не
ясна. Так как один из штаммов (Soothill, 1992) возбудителя был клиническим
изолятом из Польши (где он также использовался как хозяйский штамм для
<р-131), разница в хозяйских штаммах не объясняет различных результатов.
Количество животных, использованных в ходе исследований Soothill, было
маленьким, усложняющим необходимый статистический анализ его данных.
Кроме того, в этих работах фаговые препараты вводили тем же путем, что и
бактерии - то есть в полость тела, что давало хорошую возможность фагам
прикрепиться к бактериям-мишеням в условиях, которые маловероятны в
реальной жизни при лечении фагами инфекций, вызванных A. baumanii и Р.
aeruginosa. Таким образом, хотя результаты Soothill многообещающие, они
требуют подтверждения наиболее клинически релевантных животных
моделях. Интересно, что фаг BS24 Р. aeruginosa, использованный Soothil, был
признан способным предотвращать вызванную Р. aeruginosa деструкцию
свиной кожи in vitro (Soothill et al., 1988) и защищать от связанной с Р.
aeruginosa деструкции пересаженной кожи in vivo (Soothill, 1994). Успешный
результат последнего исследования подсказывает, что местное применение
фага может быть успешным для предотвращения и лечения вызываемых Р
aeruginosa инфекций при пересадках у ожоговых больных.
170
Приблизительно от 50% до 70% антибиотиков, используемых в США,
даются сельскохозяйственным животным (Gustafson, 1991). Три главных
причины такого их использования - это: (i) профилактика заболеваний в стаях
и стадах животных, (ii) лечение больного скота (антибиотики, используемые в
животноводстве, обычно те же, что и в человеческой медицине, и их
назначают с водой или кормом в течение нескольких дней), (ш) для улучшения
пищеварения и усвоения корма, что приводит к усиленному набору веса.
Антибиотики, используемые в последнем случае, называются антибиотиками
- усилителями роста или GPA. Большинство GPA, как правило, не
применяются в медицине, их обычно прописывают в небольших количествах
домашней птице и другому скоту с кормом. Использование антибиотиков при
содержании скота вызывает большую озабоченность среди представителей
здравоохранения, потребителей и лидеров животноводческой отрасли из-за
вероятности того, что они косвенно способствуют снижению эффективности
антибиотиков, применяемых для лечения бактериальных инфекций у людей
(Smith et al., 2G02). Эти опасения заставили ЕС запретить использование
четырех антибиотиков (virginiamycin, bacitracin zinc, spiramycin, tylosin
phosphate) в качестве добавок к животным кормам. Хотя в США никаких
похожих запретов до сих пор не было, US Food and Drug Administration (FDA)
недавно предложила ввести законодательные нормы, которые могли бы
установить жесткие пределы дальнейшего использования антибиотиков в
сельскохозяйственной и фермерской ветеринарии. Более того, законопроекты,
которые будут сдерживать использование сельскохозяйственных
антибиотиков, схожих с человеческими, уже были представлены в сенате
США и нижней палате конгресса США (Ferber, 2003). Запрет или
значительное снижение сельскохозяйственного и ветеринарного
использования антибиотиков может иметь отрицательное влияние на
безопасность продуктов и лечение больных стай птиц или стад домашнего
скота - пока не будут созданы эффективные, безопасные и дружественные
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]