Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
21
Таблица 1 - Бактериофаги- альтернатива антибиотикам
Сравниваемые
особенности
Антибиотики
Бактериофаги
Частота развития
вторичной резистентности
От незначительной до очень
высокой
Не характерно
Профилактическое
использование
Неэффективно, противопоказано
Широко используется
Длительность создания
нового препарата
От нескольких лет до
десятилетий
От нескольких дней до
нескольких месяцев
Сравниваемые
особенности
Антибиотики
Бактериофаги
Концентрация в
инфекционном очаге
Отличается для разных
препаратов, зависит от
локализации процесса, скорость
снижения различна
Нарастает путем
саморазмножения,
снижается после ликвидации
инфекции
Влияние на ферментные
системы организма
Характерно для всех препаратов
Не описано
Наличие побочных
эффектов и осложнений
Аллергические, токсические,
конкурентные (в отношении
прочих медикаментов),
дизбиотичесике изменения
различных органов, в том числе тяжелые (псевдомембранозный
колит, ассоциированный с
Clostidium difficile))
Не характерно. Редко аллергические реакции.
Могут вызывать реакцию
высвобождения при
массивном разрушении
микробов. Дизбиотических
нарушений не вызывают, но
используются для их
коррекции.
Рациональная комбинация
с другими
антибактериальными
препаратами
Зависит от класса
антибактериальных средств и
может быть по типу суммации,
потенцирования и т.д., в
зависимости от точек
приложения воздействия
препарата на бактериальную
клетку.
Всегда по типу взаимного
потенцирования, по
предварительным данным вне зависимости от класса
препарата.
Совместимость с другими
медикаментами
Различная, (конкуренцией за
ферментные системы,
связывание с тканями, усиление
токсических эффектов и пр.)
Полная, в том числе и с
антибиотиками.
Активность в отношении
патогенных микробов
Различная. Подавляюта
облигатную флору организма,
вызывая дисбиотические
нарушения. Число
чувствительных штаммов
составляет 60-90%.
Число чувствительных
штаммов составляет 70-90%.
Не влияют на облигатную
флору организма, не
вызывают дизбиоз..
22
Биологическими ограничителями бактерий являются бактериофаги, в
свою очередь, биологическими ограничителями фагов являются медиаторы
выделяемые клетками кожи ,бактериями и грибами. Так замыкается круг.
Фаги, бактерии, грибы, простейшие, даже мелкие насекомые, типа
клещей, могут быть легко обнаружены и уничтожены целой системой клеток
кожи, тем не менее, этого не происходит. В здоровом состоянии все находится
в гармонии, «все уживаются» друг с другом, а вот при нарушении этих
взаимоотношений возникают проблемы, и приходится восстанавливать
утраченное.
Таким образом, исчезновение бактериофагов из этой цепочки создаст
условия для размножения болезнетворных бактерий, следовательно, можно
рассматривать фаги как один из методов, созданных самой природой для
поддержания микробиоценоза организма человека или животных.
С 1940 г. фаги стали одним из наиболее популярных объектов
молекулярной биологии. Исследования с использованием фагов позволили
раскрыть механизмы таких фундаментальных биологических процессов, как
репликация ДНК, рекомбинация, транскрипция и генная регуляция. Благодаря
изучению фагов открылись также возможности разработки многих важных
методов и направлений генной инженерии
Экспериментальные методы работы с фагами весьма несложны
Одна из причин того, что фаги стали едва ли не наиболее изученными
объектами молекулярной биологии - это простота работы с ними и их
хозяевами-бактериями в лабораторных условиях. Заражение бактерий можно
производить по мере необходимости, в контролируемых условиях на плотных
агаровых средах или в суспензионной культуре (рис. 3). Инфицированные
клетки смешивают с избытком неинфицированных клеток в полужидком агаре
и затем распределяют по поверхности агара в чашке Петри, где полужидкий
агар застывает. Через несколько часов инкубации при 37 0С на месте
инфицированных клеток образуются «бляшки», или негативные колонии, т. е.
пятна, где нет роста бактерий. Они представляют собой области, в которых
23
лизис исходно инфицированных клеток и выход из них новых фаговых частиц
приводит к заражению ближайших неинфицированных клеток. Чем плотнее
агар, тем медленнее происходит диффузия фагов-потомков, продвигающихся
от первоначального места лизиса. В контролируемых условиях можно
наблюдать характерную морфологию бляшки (рис. 4).
Рисунок 3 - Титрование фагов. А) Процедура 100- и 10-кратных серийных
разведений в стерильном буфере, содержащем только соли и желатин для
стабилизации. Аликвоту из каждого разведения смешивают с небольшим
количеством свежевыращенной культуры индикаторной бактерии в
расплавленном мягком агаре. Смесь быстро выливают на агар в чашке Петри,
равномерно распределяя по поверхности. Чашки инкубируют при 37 °С.
Каждая фаговая частица дает начало образованию бляшки в бактериальном
газоне.
Б. Результаты инкубации чашек Петри с посевами из серийных разведений
(10-6, 10-7 и 10-8) фаговой суспензии, содержащей приблизительно 109 частиц
фага Т4 в 1 мл. Титр фага, т. е. число бляшкообразующих единиц, или число
активных фагов в объеме, подсчитывают, умножая число стерильных пятен
на величину разведения
Поскольку при этих условиях источником ее образования послужила
исходно одна инфицированная клетка, в данном месте присутствует
популяция генетически идентичных фаговых частиц, т. е. клон. Чтобы
выделить фаг из негативной колонии, просто вырезают содержащий его
кусочек агара и ресуспендируют в жидкой среде (рис. 5) либо собирают часть
24
материала с поверхности бляшки стерильной зубочисткой или стеклянной
палочкой.
Рисунок 4 - Типы морфологии бляшек, характерные для различных фагов.
Морфология бляшек, образуемых фагами Т4, ТЗ и Т7. На границах
обширных бляшек растут мелкие колонии устойчивых бактерий (на фото не
видны). Морфология бляшек, типичная для данного фага, может
существенно изменяться и варьировать у его мутантов. Это свойство широко
используется как маркерное при изучении генетической рекомбинации
Рисунок 5 - Фаговые частицы в бляшке представляют клон. Обычно из одной
фаговой частицы образуются многочисленные дочерние фаговые частицы,
образующие одну бляшку. Таким образом, в одной бляшке они генетически
идентичны и составляют клон. Фаги можно выделить из отдельной бляшки
смыванием и затем размножить путем повторного посева
Инфицированные клетки можно выращивать в больших количествах в
колбах Эрленмейера или в ферментерах, получая достаточно материаладля
биохимического анализа. Жизненный циклбольшинства фагов короток, и
время между инфицированием и лизисом (латентный период) коррелирует со
временем генерации клеток-хозяев. Этот период может составлять всего 25
мин.
Среднее число фагов в расчете на инфицированную клетку, называемое
выходом фага, варьирует в зависимости от его вида, но обычно в момент
лизиса клетки высвобождается несколько сотен фаговых частиц-потомков.
Одновременно, как правило, высвобождается эквивалентное количество
материала неполных фаговых частиц. Инфицированные клетки можно
выращивать в больших количествах в колбах Эрленмейера или в ферментерах,
получая достаточно материала для биохимического анализа. Жизненный
циклбольшинства фагов короток, и время между инфицированием и лизисом
(латентный период) коррелирует со временем генерации клеток-хозяев. Этот
период может составлять всего 25 мин. Среднее число фагов в расчете на
инфицированную клетку, называемое выходом фага, варьирует в зависимости
от его вида, но обычно в момент лизиса клетки высвобождается несколько
сотен фаговых частиц-потомков. Одновременно, как правило, высвобождается
эквивалентное количество материала неполных фаговых частиц.
Число инфицированных клеток в культуре зависит от количества фагов,
добавленных с целью ее заражения. Численное соотношение внесенных
фаговых частиц и клеток в культуре называют множественностью
инфицирования (multiplicity of infection - m.o.i.). Поскольку инфицирование
зависит от случайных столкновений фагов и клеток, одни клетки могут
столкнуться с несколькими фаговыми частицами, тогда как другие - не
столкнуться ни с одной. Доля множественно инфицированных клеток в
культуре определяется статистическими законами, и ее можно
приблизительно рассчитать по формуле Пуассона. Например, если желательно
25
26
получить инфицирование большей части клеток культуры только одной
фаговой частицей, величина m.o.i. должна быть меньше единицы.
Согласно распределению Пуассона, при m.o.i. = 1 в культуре может
оказаться 36% неинфицированных клеток, 36% клеток, инфицированных
только одной фаговой частицей, и 28% клеток, инфицированных более чем
одной фаговой частицей. Если требуется, чтобы большинство клеток было
инфицировано, величина m.o.i. должна быть соответственно больше единицы.
Классификация бактериофагов основана на их морфологии
Бактериофаги можно разделить на различные группы (семейства).
Классификация вирусов основана главным образом на таких
морфологических и биохимическихпризнаках, как размеры и форма вириона,
природа нуклеиновой кислоты генома, число и функции белков и наличие в
составе фага липидов, атакже на дополнительных структурных признаках,
таких как наличие оболочки, и на серологических характеристиках. Фаги
содержат в качестве генетического материала РНК или ДНК,молекулы
которых окружены защитным белковым капсидом. В большинстве случаев
капсид состоит только из белков, но известно несколько фагов, капсид
которых содержит дополнительно липиды и материал бактериальной
мембраны. Большинство фагов содержит только одну, линейную или
кольцевую хромосому в виде двойной или одиночной цепи нуклеиновой
кислоты, однако известно также несколько фагов, содержащих больше одной
хромосомы. Некоторые свойства бактериофагов приведены в табл. 2.
Капсид (оболочка) фагов выполняет двойную функцию. Он защищает
генетический материал от неблагоприятных внешних воздействий вне хозяина
и осуществляет функцию адсорбции, важную для проникновения в клеткухозяина. Наиболее сложноорганизованные фаги имеют, помимо собственно
капсида, специальную органеллу адсорбции -отросток («хвост») с базальной
пластинкой. Строение оболочки в значительной степени варьирует по
сложности у различных фагов. Несмотря на множество особенностей
оболочки, характерных для разных фагов, различают только две их основных
27
формы - нитевидную и полиэдрическую.
Таблица 2 - Основные характеристики некоторых фагов.
Структура и
свойства генома
Форма фаговой
частицы
Примеры
фагов
Примеры
организмов
Примечания
ДНК дц, лин, киз, кт
Полиэдрическая,
продолговатая
Т2, Т4, Тб
Escherichia coli
Вирулентные «четные» Тфаги; Т4 содержит два гена
с нитронами
ДНК дц, лин, киз, кт
Икосаэдрическая
PI, Р7, PBS1,
PBS2
Escherichia coli/
Salmonella
Bacillus subtilis
Умеренные фаги; Р1
персистирует в клетках в
виде свободной плазмиды
ДНК дц, лин,
уникальная с
липкими концами
Икосаэдрическая
Р2, Р4
Escherichia coli,
Shigella, Serratia
Умеренные фаги; для
развития Р4 необходим Р2
ДНК дц, лин,
уникальная с концами
из ДНК хозяина
Икосаэдрическая
Ми (ИЛИ Д)
Escherichia coli
K-12, С,
энтеробактерии
Умеренный фаг, «фагмутатор»; включается в
геном хозяина случайным
образом
ДНК дц, лин, с
липкими концами
Икосаэдрическая
А, <д80, <д82,
<д434, сд424
Escherichia
coliK-12
Умеренные фаги
ДНК дц, лин
уникальная
Икосаэдрическая
<д29, Х15,
Gal, M2Y
Bacillus subtilis
Вирулентные фаги
ДНК дц, лин,
уникальная в
отношении концевой
избыточности
Икосаэдрическая
Т1, ТЗ, ТБ, Т7,
SPOl
Escherichia coli,
Bacillus subtilis
Вирулентные, «нечетные»
Т-фаги
ДНК дц, лин, кт, киз
Икосаэдрическая
Р22
Salmonella,
Escherichia coli
Во многом сходен с фагом
А
ДНК оц, конц
Икосаэдрическая
<дХ174, S13,
tpR,GE
Escherichia coli
ДНК оц, лин
Икосаэдрическая
R17, f2, Q/3,
MS2, М12,
GA, SP, F1
Escherichia coli
Специфичны к мужским
штаммам энтеробактерий
ДНК оц, лин
Нитевидная
М13, fd, Ff,
IKe
Escherichia coli
Высвобождаются из клеток
без их лизиса
ДНК дц, лин
PM2
Alteromonas
espejiano
Морской фаг, состоит на
10% из липидов
ДНК дц, лин
<д6
Pseudomonas
phaseolicola
Морской фаг; содержит три
хромосомы; имеет
мембранную оболочку; на
20% состоит из липидов
ДНК дц, лин
SMI
Цианобактерии
(специфичен к
Synechococcuselon
gates)
Первый изолированный
цианофаг
ДНК дц, лин, кт
<дН
Halobacterium
halo- bium
Наиболее изученный из
галобактериофагов
Обозначения: дц - двухцепочечная; оц - одноцепочечная; лин - линейная; киз - концевая
избыточность; кт - кольцевая трансформированная генетическая карта; кольц - кольцевая
Нитевидные фаги, такие как fd и М13, содержат кольцевую
одноцепочечную хромосому, окруженную оболочкой продолговатой формы
28
из сотен и тысяч субъединиц - молекул одного и того же белка. Длина этой
трубкообразной, очень гибкой структуры составляет половину длины
окружности кольцевой ДНК, которую она покрывает (рис. 6).
Длина хромосомы у нитевидных фагов определяет длину фага,
поскольку капсид формируется вокруг ДНК до тех пор, пока вся хромосома не
будет обернута. Благодаря этому в хромосому нитевидного фага можно
вводить довольно крупные фрагменты чужеродной ДНК, не создавая
препятствий для ее упаковки. Это свойство нитевидных фагов широко
используется в генной инженерии. Несколько молекул специального белка,
прикрепленных к одному из концов фага, образуют органеллу адсорбции.
Для полиэдрических фагов характерна сложная структура капсида,
который чаще всего имеет октаэдрическую (восьмигранную) или
икосаэдрическую (двадцатигранную) форму (рис. 6). В этот ригидный капсид
заключена хромосома, причем капсид способен вместить только плотно
упакованную хромосому стандартных размеров. Эти фаги обладают
сложными механизмами упаковки ДНК для введения ее в предварительно
образованный капсид (см. ниже). От основания капсида отходит отросток,
варьирующий по степени сложности у разных фагов и представляющий собой
важную органеллу адсорбции.
Рисунок 6 - Строение фагов М13 и у>Х174. [Показаны электронные
микрофотографии и рисунки, иллюстрирующие различные типы фагов.] Для
структурных компонентов указаны обозначения соответствующих генов (gp -
от gene product, продукт гена)
А. Нитевидный фаг М13. На электронной микрофотографии стрелкой
указана шиповидная структура на одном конце фаговой частицы. На схеме
29
изображено, каким образом одноцепочечная кольцевая хромосома
ориентирована внутри белковой оболочки. Отдельные гены обозначены
номерами. Межгенная область (IG) всегда локализована на конце,
противоположном комплексу адсорбции (слева). Межцистронная область
богата вторичными структурами и в том числе содержит крупную шпилечную
структуру, относящуюся к сигналу упаковки, (не показана). Одноцепочечная
хромосома из 6407 нуклеотидов кодирует девять белков. Указаны
структурные белки, образующие оболочку. Длина фага М13 составляет 89 нм,
ширина - 6 нм.
Б. Икосаэдрический фаг <дХ174, не обладающий отростком. На схеме
показано расположение белковых субъединиц в составе капсида. Капсид
(диаметром 25 нм) имеет 12 вершин пятикратной симметрии и состоит из 60
молекул gpF. Каждая вершина образована одной молекулой gpH и пятью
молекулами gpG, которые формируют вместе шиповидную структуру, шип.
Внутри капсида находится одноцепочечная ДНК, включающая 5386
нуклеотидов и кодирующая 11 белков.
Несмотря на огромное число фагов, обнаруженных у бактерий и архей,
их морфологическое разнообразие весьма ограничено. Как правило, фаг имеет
оболочку - капсид, внутри которого находится линейная двухцепочечная
ДНК; реже носителем генетической информации служит ковалентно
замкнутая кольцевая одноцепочечная ДНК либо даже РНК. У большинства
фагов капсид представляет собой полиэдрическую структуру, либо с
отростком и базальной пластинкой в качестве органеллы адсорбции, либо без
них, и содержит определенное количество ДНК. Однако у немногих фагов
капсид имеет нитевидную форму; сборка фаговой частицы при этом
осуществляется вокруг ДНК и длину зрелого фага определяет длина ее
молекулы. Все эти признаки используются для морфологической
классификации бактериофагов (см. табл. 2).
Независимо от различий в способах существования все фаги имеют
общие «проблемы» развития, которым соответствуют следующие основные
30
пять стадий жизненного цикла: 1) адсорбция на клетке-хозяине, 2)
проникновение в клетку, 3) репликация ДНК, 4) синтез новых компонентов
оболочки, сборка фаговых частиц (морфопоэз) и 5) высвобождение фаговых
частиц - потомков. Вирулентные фаги размножаются только посредством
такого литического цикла. Для некоторых фагов характерна способность
помимо литического пути осуществлять развитие по лизогенному пути.
Вместо синтеза новых вирусных частиц и лизирования клеток-хозяев эти фаги
могут реплицировать свою ДНК при сосуществовании с геномом клеткихозяина, и поэтому их называют умеренными фагами. При лизогении фаг,
называемый в этом случае профагом, может присутствовать в клетке в
свободном плазмидоподобном состоянии (пример - фаг Р1) или
интегрироваться в хромосому клетки-хозяина. Интеграция либо происходит
во многих случайных участках, как в случае фага Ми, либо ограничена
специальными участками присоединения (att), как в случае фага А.
Лизогенное состояние клетки-хозяина может продолжаться в течение
длительного времени, пока не произойдет индукция литического пути
развития фага с образованием новых фаговых частиц и лизисом клетки в конце
цикла. Индукция может быть вызвана внешними факторами, например УФоблучением или отсутствием источников питания.
О сложности цикла развития фага (но не обязательно об эффективности
размножения) можно судить по числу генов в его хромосоме. Например, фаг
<£> 174, характеризующийся одним из наиболее мелких одноцепочечных
геномов (5386 нуклеотидов), содержит лишь 10 генов и имеет довольно
простой цикл развития. В то же время у фага Т4 (размеры генома
приблизительно 169 т.п.н.) имеется по меньшей мере 130 генов. Однако оба
эти фага образуют почти одно и то же количество дочерних фаговых частиц за
один цикл, занимающий у них примерно одинаковые промежутки времени. В
сравнении с фагом <£>174 фаг Т4 обладает чрезвычайно сложным циклом
развития. Дополнительные гены обеспечивают у него многочисленные
механизмы дублирования на всех этапах цикла развития и многочисленные
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]