Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
121
кодирующих токсины суперантигенов во многих стрептококковых и
стафилококковых профагах, возможно, объясняет их широкое
распространение и вероятный механизм появления и распространения новых
патогенных штаммов. Например, распространение новых генов суперантигена
speLв инвазивных и неинвазивных изолятах МЗ/ТЗ S. pyogenes,недавно
полученных в Японии, вероятно, ассоциировано с носитель ством
бактериофага (Ikebeetal., 2002).
ПРЯМОЕ УЧАСТИЕ БАКТЕРИОФАГОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ
Осуществление жизненного цикла бактериофага может быть важным
элементом патогенеза бактериальной инфекции (описано у WagnerandWaldor,
2002). Например, находящаяся под контролем фага продукция и экспорт
токсинов Stxнепосредственно влияет на патогенез заболеваний, вызываемых
STEC. У фага Н 19В Е. coli0157 гены stxрасположены непосредственно за Р'
промотором перед генами лизиса (NeelyandFriedman, 1998а; 1998b). Индукция
профага под воздействием внешних (митомицином С и другими
антибиотиками) или внутренних (перекись водорода продуцируется
человеческими нейтрофилами) агентов увеличивает продукцию Stxу штаммахозяина (WagnerandWaldor, 2002). Функциональный анализ обнаружил
(NeelyandFriedman, 1998а), что белок Qфага Н-19В, действующий
intrans,обусловливает высокий уровень экспресии Stxс репрессированных
профагов Н-19В и 933W. (WagnerandWaldor, 2002). Транскрипция с позднего
фагового промотора P'R,происходящая при индукции профага, также была
важна для продукции Stxтоксина клиническим изолятом 1:361 E.coli0157:Н7.
Индукция профага СТХ также приводит к высокому уровню продукции
токсина у V. cholerae. СТХо либо интегрируется в геном бактерий, либо
реплицируется как эписома, и такая репликативная форма (ЛЕ)дает начало
высо ким титрам вирионов. Skorupskiи Taylor(1997) показали, что экспрессия
ctxABс профага СТХ зависит от активаторов транскрипции ToxRи ТохТ.
Однако также сообщалось, что экспрессия СТ из CTX0RFinvitroи invivoне
нуждается в ToxRи ТохТ (WagnerandWaldor, 2002). Эти данные позволяют
122
предположить, что индукция профага СТХ в момент инфекции кишечника
может усиливать экспрессию токсинов путем увеличения числа копий ctxABи
путем устранения необходимости в ToxRи ТохТ. Это наблюдение также
может указывать на наличие пока еще неизвестных, альтернативных,
связанных с индукцией профага регуляторов транскрипции ctx
(WagnerandWaldor, 2002).
ВЛИЯНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ФАГ – ФАГ НА ВИРУЛЕНТНОСТЬ
БАКТЕРИЙ
В предыдущем разделе обсуждалась роль бактериофагов в патогенности
бактерий как пассивных векторов для распространения генов либо как
регуляторов экспрессии генов вирулентности, В этом разделе представлена
информация, касающаяся влияния взаимодействия фагов между собой на
вирулентность бактерий (табл. 8.5) (см. обзор Boydetal., 2001).
Рассматриваемые взаимодействия фаг - фаг можно разделить на три категории
в зависимости от того, для чего необходим хелперный фаг: для мобилизации
другого, неродственного фага, для проникновения другого бактериофага в
клетку-хозяина или, наконец, для экспрессии кодируемых бактериофагом
генов вирулентности.
Классический пример мобилизации хелпер-зависимого фага фагомпомощником - это взаимодействие между лямбдоидными фагами Е. coliР2
(хелпер) и Р4 (хелпер-зависимый фаг). Р4 нуждается в присутствии Р2 или
иного родственного бактериофага, который обеспечивает функции генов
белков капсида, хвоста и лизиса клетки. Эти функции необходимы, чтобы Р4
мог завершить литический цикл и образовать вирионы (ChristieandCalendar,
1990; Lindquistetal., 1993). Таким образом, P4 - это зависимый от фага-хелпера
фаг, который, будучи освобожден в виде вириона, способен - в отсутствие Р2
- реплицировать и интегрировать свою ДНК в геном бактерии-хозяина.
Потребность фага RS10 в морфогенетических белках фага V.
choleraeCTX0аналогична взаимоотношениям фагов Р2 и Р4 Е. coli.Штаммы V.
cholerae,ответственные за современные холерные эпидемии (т.е. серогруппа
123
Е1 биовара Тог 01, а также штамма серогруппы 0139), несут полностью
функциональных профагов, способных продуцировать инфекционную RFфага
СТХи (Davisetal., 1999). В этих изолятах профаг СТХ всегда фланкирован
другим генетическим элементом - RSI. RS1 идентичен региону RS2, однако
содержит дополнительную рамку считывания, rstC,кодирующую
антирепрессор, который вызывает агрегацию репрессора rstR(рис. 8.3),
воздействуя таким образом на регуляцию и передачу CTX0 (Davisetal., 2002).
Для образования вирионов СТХи лизогенными клетками необходимо наличие
либо двух тандемно расположенных СТХ профагов либо единичного профага,
после которого следует элемент RSI (Davisetal., 2000а). Недавно было
показано, что RS1 способен к горизонтальному переносу в виде нитчатого
бактериофага, который использует морфогенетические гены CTX0
(Faruqueetal., 2002). Авторы также подтвердили присутствие вырезанной
копии RS1 и показали, что эта копия RFRS1, маркированная геном
устойчивости к канамицину, PRS1-KN, трансдуци- ровала изоляты V. choleraк
фенотипу Knr (Faruqueetal., 2002). Эти изоляты несли однонитевую форму
pRSl-Rm, таким образом, они соответствовали геному нитчатого бактериофага
(RSI-K110). Подобно СТХи, геном RSI0использует последовательность
ATTRSдля сайт-спцифической интеграции в геном Vcholera. Однако только
те трансдуктанты RSl-Кш, котрые уже несут геном CTX0, могут образовывать
детектируемые вирионы RSI-K110 (Faruqueetal., 2002). Был также
идентифицирован другой нитчатый фаг, KSFI0, также способный
обеспечивать функции, необходимые для продукции RSI0 (Faruqueetal.,
2003b). Однако, в отличие от CTX0, он не нуждается в TCPдля проникновения
в кллетки V. cholera. Таким образом, предположительный сценарий эволюции
CTX0должен включать три главных этапа (рис. 8.10). Первый предшественник CTX0- рге СТХ, возник в результате интеграции RSI0рядом с
кор-регионом, вероятно, сопровождавшейся потерей rstC,что привело к
образованию доменов RS2 и кор. Второй - рге СТХ инфицировал неизвестного
хозяина, содержавшего гены СТХ АВ, и третий - токсигенный
124
CTX0образовался по механизму, сходному с неточным вырезанием.
Репликация генома CTX0не требует вырезания профага из хромосомы, а
происходит подобно размножению репликативных транспозонов или фага
ти(DavisandWaldor, 2000). Как отмечено выше, продукция СТХи требует
присутствия тандемного элемента: либо СТХ - СТХ профага, либо профагов
СТХ RS1.
БАКТЕРИОФАГИ И ОСТРОВКИ ПАТОГЕННОСТИ
Многие патогенные бактерии кодируют PAI (HackerandKaper, 2000),
которые обладают набором общих свойств, например, они представляют
собой большие хромосомные регионы (35-200 т.п.н.), кодируют несколько
факторов вирулентности, которые обычно присутствуют в патогенных и
отсутствуют в непатогенных штаммах. Во многих случаях они также
кодируют интегразы фагового типа (например, Р4-подобные интегразы, табл.
8.6), интегрированы около генов тРНК и фланкированы повторяющимися
последовательностями. Процент Г-Ц ДНК PAIобчно отличается от остального
генома хозяина, что является признаком чужеродной ДНК, приобретенной из
другого источника (HackerandKaper, 2000). Механизмы, с помощью которых
PAIперемещаются из одного бактериального штамма в другой, не выяснены,
и PAIне кодируют генов, необходимых для их автономной мобилизации. Как
предположили Karaolisс коллегами (1999), VPI- решн изолятов V.
cholerae,который кодирует TCP, соответствует геному нитчатого фага,
названного VPI0. Однако, как отмечено выше, существование VPI0 вызывает
сомнение. И даже авторы исходного сообщения (Karaolisetal., 1999) не
наблюдали переноса VPI0в штаммы V. choleraeсерогруппы Ol, являющиеся
преобладающими возбудителями эпидемий холеры. Тем не менее
горизонтальный перенос этого региона между штаммами является
бесспорным, и сравнение последовательности (Boydetal., 2000) убедительно
свидетельствует о недавнем перемещении этого региона между Vcholeraeи
Vmimicus.Кроме того, O’Sheaи Boyd(2002) показали, что канамицинмаркированная копия VPIмогла быть перенесена из нескольких изолятов V.
125
choleraeв рецепиентные штаммы с помощью общетрандуцирующего фага СРТ1. Другой пример опосредованного фагом переноса PAI- это перенос SaPI-1,
который кодирует токсин токсического щока S. aureus.Стафилококковый фаг
80а необходим для эксцизии, репликации и упаковки SaPIl (Lindsayetal., 1998).
Наблюдение, что общая трансдукция является преобладающим способом
переноса SaPI-1 у S. aureus,согласуется с мыслью, что общая трандукция PAI-
это наиболее вероятный механизм их переноса в природе (Lindsayetal., 1998;
O’SheaandBoyd, 2002).
Некорректное описание PAIкак фагов и наоборот затрудняет наше
понимание происхождения и эволюции PAI. VPI, несомненно, относится к
категорииPAI, но SaPI-1 не вполне соответствует критериям PAI.Поскольку
многие характеристики PAIсвойственны также и бактериофагам, например
кодирование интегразы, интеграция около генов тРНК, фланкирующие
повторы и отличие GCсостава от остального генома хозяина, возможно, что
некоторые PAIмогут иметь фаговое происхождение, однако в большинстве
случаев это не так. Некоторые PAIявляются мозаичными структурами,
имеющими характеристики как PAI, так и фагов, напрмер VPI-2 регион V.
cholerae(рис. 8.8, Jermynи Boyd, 2002). Регион VPI-2 содержит кластер
рестрикции-модификации, другой кластер, отвечающий за использование
аминосахаров, и многочисленные гены, кодирующие гипотетические белки,
расположенные в 5 '-концевой области островка. Также 20 т.п.н. область на 3
'-конце этого региона содержит несколько генов, гомологичных фагу Ми.
Интересно, что у V. mimicusи Vvulnificusприсутствуют только гены утилизации
аминосахаров, а у большинства штаммов V. cholerae0:139 VPI-2 регион
содержит лишь 20 т.п.н. область остатков Mu-подобного фага (JermynW.S.,
личное сообщение). Дополнительный фактор, осложняющий четкое
разделение бактериофагов и PAI, - это взаимная зависимость этих элементов
у многих вдов бактерий (Boydetal., 2001). Например, эффекторный белок
GtgBS. entericaкодируется фагом Gifsy-2, но секретируется посредством
системы секреции III типа, кодируемой SPI-2 PAI (Figueroa-Bossietal., 2001).
126
Дискуссии о взаимоотношениях между бактериофагами и PAIеще
больше запутывает тот факт, что некоторые исследователи обозначают
критических профагов и остатки профагов как геномные острова. Регионы,
которые содержат в основном гены фаговых структурных белков и
регуляторные гены, не обязательно должны рассматриваться как PAI.
Общие свойства PAIи бактериофагов, например интеграция в сайты
тРНК и то, что они содержат фагоподобные интегразы, могут отражать скорее
одинаковый механизм перемещения и интеграции, нежели их общее
происхождение. Например, тот факт, что многие бактериофаги интегрируются
в тРНК-гены, может отражать обилие и консервативность этих регионов, а не
общее происхождение фагов и PAI. Действительно, наличие Р4-подобных
интеграз в составе PAIпривело к предположению (Boydetal., 2001), что какието взаимодействия, подобные фагам Р2/Р4, могли способствовать
приобретению и распространению генов интеграз. Наконец, способность
общетрансдуцирующих фагов переносить большие регионы ДНК в некоторые
PAIможет объяснить тесную ассоциацию между фагами и PAI.
127
ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ
ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
Специфическое взаимодействие бактериофагов с бактериальной
клеткой-хозяином дает непосредственную возможность использовать их для
идентификации бактерий, в том числе патогенных. В отличие от множества
искусственно созданных систем для определения и дифференциации
различных структур бактериальных клеток, основанных на использовании
антител или на амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР), здесь мы имеем
систему, естественно возникшую в ходе эволюции, когда бактериофаг
специфически распознает свои рецепторы и связывается исключительно с
клетками своего хозяина.
Это взаимодействие используется в целом ряде различных методик
специфического определения и дифференциации штаммов бактерий - хозяев
бактериофагов. Одной из первых методик практического применения фагов
стало фаготипирование - метод, в котором набор фагов используется для того,
чтобы по их способности лизировать исследуемые культуры и образовывать
на них бляшки различать рода и виды бактерий (а также штаммы одного вида).
Различия в восприимчивости к инфекции фагами отражают целый ряд
характеристик бактерий, таких, как наличие специфических поверхностных
рецепторов, систем рестрикции - модификации, резидентных профагов
определенных типов, плазмид и т.д.
При использовании идентичных типирующих коллекций фагов
результаты этого метода хорошо воспроизводятся в различных лабораториях.
Необходимо также, чтобы фаги использовались и выращивались в
стандартных условиях. Простота применения и дешевизна фаготипирования
способствовали тому, что по сей день этот метод остается в числе самых
широко используемых способов дифференциации штаммов многих бактерий,
в особенности Salmonella, Listeria и Staphylococcus.
128
Были разработаны и другие методы, основанные на способности
бактериофагов специфически связываться с клетками бактерий-хозяев. В их
числе использование флуоресцентно-меченых антител против специфически
адсорбирующихся фаговых частиц (WatsonandEveland, 1965) или
флуоресцентно-меченых фагов за счет ковалентного пришивания красителей
к поверхности фагов (Hennesetal., 1995; Goodridgeetal., 1999). В обоих этих
методах идентификация происходит после связывания фагов с поверхностью
клеток путем регистрации связавшегося с клетками флуоресцентного сигнала.
И хотя этот принцип остается в сущности неизменным в целом ряде методик,
обсуждаемых в этой главе, растущее понимание генетики и генно-инженерные
реагенты для обнаружения бактерий.
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФАГИ. ФАГИ С РЕПОРТЕРНЫМ ГЕНОМ
ЛЮЦИФЕРАЗЫ (LRP)
Идея о том, что фаги могут трансдуцировать определенные гены в
клетки хозяев, не нова, однако мысль, что репортерные генные конструкции,
доставляемые фагом, возможно использовать для обнаружения самого факта
инфекции, была впервые предложена в качестве метода детекции
UlitzurandKuhn(1987). В нашем случае в качестве репортера были выбраны
гены бактериальной хемилюминесценции (lux). Экспрессия этих генов с
модифицированного генома фага лямбда могла быть быстро и с высокой
чувствительностью обнаружена с помощью люминометра (рис. 9.1). Исходно
авторы использовали фаговый клонирующий вектор, содержащий полный luxоперон, чтобы продемонстрировать, что всего лишь 10 клеток Е.
coliдостаточно для получения детектируемого сигнала после фаговой
инфекции (UlitzurandKuhn, 1989). Далее эта группа перешла к созданию
репортерных фагов за счет случайного встраивания в их геномы транспозона
Tn10:\luxABс последующим отбором luxAB+ фагов из люминесцирующих
бляшек.
Эти простые конструкции, названные Люциферазными Репортерными
Фагами (LRP), успешно использовались для обнаружения энтеробактерий в
129
мясе (Kodikaraetal., 1991) и бактерий рода Salmonellaв яйцах (ChenandGriffiths,
1996).
Более научно обоснованный подход к конструированию LRPбыл
предложен Лёсснером с коллегами(1996).В своей работе авторы основывались
на ранее пре веденном генетическом анализе вирулентного фага ListeriaА511
(Loessneretal., 1994), который позволил установить поздний регион фага,
кодирующий главный белок капсида и белки фагового хвоста
(LoessnerandScherer, 1995). Так как этот конструкт предназначался для
экспрессии в грамположительном хозяине, были использованы слитые гены
luxABVibrioharveyi (Hilletal., 1991), которые ввели при рекомбинации в кластер
структурных генов фага без нарушения существующих в нем генетических
структур.
Хотя такая процедура обеспечивает удешевление и сокращение времени
анализа, во многих странах использование рекомбинантных фагов встречает
сопротивление общественности, поскольку эти /мх-фаги попадают под
определение генетически модифицированных организмов (ГМО). И это
несмотря на то, что использование вирулентных фагов эффективно
предотвращает выживание инфицированных клеток и снижает до минимума
шансы дальнейшей репликации кодируемых фагом репортерных генов в
бактериях, что является одним из главных опасений по поводу использования
ГМО. Несмотря на то, что эти тесты рассчитаны на использование только в
лаборатории, что легко позволяет избежать распространения
модифицированного фага, стоимость сертификации лабораторий для работы с
ГМО во многих странах препятствует их распространению.
Хотя lux-фаги были разработаны и для листерий, и для сальмонелл,
эффективность их использования не была серьезно исследована. В отличие от
них рекомбинантный фаг, разработанный для детекции
Mycobacteriumtuberculosis,вызвал более пристальное внимание. Причиной
этому служит то, что использование такого фага предотвращает
необходимость культивирования медленно растущего организма, что
130
сокращает время анализа с недель до дней. В то же время использование ГМО
для медицинских анализов вызывает меньше возражений. Тем не менее ни
одна тест-система, основанная на LRP, не была пока не поставлена на
коммерческую основу.
LRP, созданные для обнаружения микобактерий, несут репортерный ген
лю- циферазы светлячка (1ис или Fflux) (Jacobsetal., 1993).Исходно для этого
теста использовали фага ТМ4, однако из-за слишком быстрого инфекционного
цикла этого вируса лишь небольшие количества люциферазы вырабатывались
в каждой инфицированной клетке, что ограничивало чувствительность метода
порогом около 104 клеток (Jacobsetal., 1993).
Когда те же авторы сконструировали репортерного фага на основе
умеренного фага L5, длительная экспрессия и аккумуляция люциферазы была
достигнута за счет ассоциации гена lис с конститутивным промотором на
хромосоме хозяина при интеграции фага в геном бактерии. Такое усиление
сигнала позволило понизить порог чувствительности до 102 клеток при 40 ч
инкубации или до 103 клеток при инкубации в течение 20 ч (Sarkisetal., 1995).
Однако ограниченный спектр хозяев фага L5 не позволял использовать эту
систему на практике. Дальнейшая работа была предпринята для улучшения
качеств LRPна основе фага ТМ4 с помощью выделения различных
спонтанных мутантов родительского фага и варьирования места интеграции
репортерного гена в его геном, а также промотора, с которого экспрессируется
данный ген. В последнем из основанных на ТМ4 репортерных фагов, phAE142,
для достижения сильной экспрессии 1ис генов использован промотор P
Uft
из
фага L5, но этот фаг генетически нестабилен: при его выращивании на штамме
М. smegmatisдикого типа происходит быстрая потеря репортерных генов.
Поэтому для выращивания фага phAE142 необходим специальный штамм,
конститутивно экспрессирующий белок gp71 фага L5, являющегося
репрессором промотора P
Left
. Как было показано ранее, этот промотор
обеспечивает экспрессию гена lucдо такого уровня, когда этот белок
становится токсичным для микобактерий (Brownetal., 1997), что эффективно
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]