Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
101
расположенные рядом основания, включающие в себя энхансерные
последовательности, которые могут быть комплементарны другим участкам
16SрРНК; последовательности, связывающие трансляцию с таковой
вышележащих генов в случаях, когда стоп- и старт-кодоны перекрываются
или разделенны несколькими основаниями; последовательность второго
старт-кодона в таких случаях чаще всего бывает ААА или GCU. В состав этого
участка также может входить последовательность, выключающая
транскрипцию путем закрытия инициирующего участка специфичными
вторичными структурами мРНК.
В случае трех цистронов РНК фагов Q|3 и £2 (капсидного белка, РНКрепликазы и А-белка) синтез соответствующих белков идет в соотношении
20:5:1. Различия отражают вариации вторичной структуры мРНК в сайтах
инициации для каждого цистрона. РНК-структура также играет заметную роль
в механизме временного контроля экспрессии генов. Рибосомальный протеин
S1 подавляет экспрессию главного белка капсида и является одновременно
субъединицей f2- репликазы. Связь между репликазой и S1 снимает
отрицательный контроль, и начинается полная экспрессия капсидного белка.
И вторичная структура РНК, и белковые репрессоры могут влиять на
трансляционную эффективность многих РНК фага Т4, как это описано в
обзоре Milleretal. (1994, 2003). Например, некоторые гены, включая лизоцим,
транскрибируются и с ранних, и со средних промоторов, но их ранние
транскрипты формируют петлеобразные ветвящиеся структуры, которые
физически экранируют участки инициации трансляции. Поздний промотор
находится в середине этой петли, так что поздний транскрипт транслируется с
высокой эффективностью. Небольшое количество синтезируемого на ранней
стадии лизоцима также имеет функциональный смысл: если что-либо истощит
энергетический потенциал клеточной мембраны до ожидаемого конца
фаговой инфекции, действие лизоцима вызовет лизис бактерии и
высвобождение всех уже собранных фаговых потомков. Вот почему
хлороформ лизирует инфицированные фагом клетки, но убивает без
102
нарушения оболочки клетки, свободные от инфекции. Три белка фага Т4
контролируют свою собственную трансляцию: ДНК-полимераза, белок,
связывающийся с однонитевой ДНК (ssb) и RegA, который также регулирует
синтез большого количества других белков на уровне трансляции. Каждый из
этих белков способен связываться со специфической структурой на мРНК и
подавлять трансляцию. Структуры РНК во всех трех случаях сильно различны.
В случае гена 32 в последовательности от -67 и до -40 формируется
сложная псевдоузловая структура, за которой следует неструктурированный
участок, с которым способны связываться до 9 молекул gp32; это связывание
конкурирует с однонитевой ДНК, которая связывается с gp32 несколько более
сильно и, таким образом, может контролировать уровень доступного gp32 в
широком диапазоне, обеспечивая защиту всей образующийся в клетке
однонитевой ДНК.
ИНТРОНЫ-РИБОЗИМЫ
В большом количестве случаев РНК сворачивается в структуры,
обладающие сложной ферментативной активностью, ранее признаваемой
только за белками. В митохондриях и грибах впервые было отмечено, что
РНК-эндонуклеазы, входящие в состав интронов мРНК самосплайсинговой
группы I, вырезают длинные сегменты транскрибированной РНК для создания
финальной кодирующей белок последовательности. Как описано в работе
Shubс коллегами (1988), первый интрон, найденный в бактериальном царстве,
был обнаружен в тимидилатсинтазном гене фага Т4 в 1984 году, в то время как
сам белок был к тому времени хорошо описан с точки зрения биохимии. Скоро
нашли другие интроны у Т4 и большого количества других бактериофагов, но
в бактериях интронов не обнаружили. Все интроны содержали
последовательности, сходные с таковыми у грибов, и проходили процесс
сплайсинга, в котором З'-ОН группа ГТФ атакует 5'-сайт сплайсинга.
Различные рибозимы - РНК АТФазы - играют ключевую роль в упаковке фага
Р22.
Несмотря на способность к самораспространению интроны очень
103
неравномерно распределены между фагами (Edgelletal., 2000; Landthaler, Shub,
1999). Адаптированность кодируемых в интронах Т4 эндонуклеаз к частотам
использования кодонов их хозяина (Edgelletal., 2000), а также совершенная
система регуляции их экспрессии (Gottetal., 1988) позволяет предположить,
что они были резидентами фагового генома в течение очень долгого времени,
в то время как у родственников Т4 они отсутствуют (Quirketal., 1989), что
говорит о барьере в распространении. Хоминговые эндонуклеазы, кодируемые
многими из этих интронов, могут поддерживать частичный или полный запрет
на коинфекцию фагами, способствуя исключению маркеров, путем индукции
конверсии генов вокруг их хоминговых сайтов (Belleetal., 2002; Liuetal., 2003);
одна пара таких эндонуклеаз даже предпочитает гетерологичную ДНК
(Goodrich-BlairandShub, 1996).
СДВИГ РАМКИ ПРИ ТРАНСЛЯЦИИ
Большое количество фагов использует программированное
переключение рамки путем повторного прохождения или пропуска одного или
двух нуклеотидов, происходящее с некоторой вероятностью на отдельных
сайтах, как способ генерации альтернативных версий отдельных белков.
Например, фаг Т7 использует -1 сдвиг рамки считывания для продукции
gplOB, варианта главного капсидного белка, который в таком варианте
становится минорным капсидным белком (Molineux, 2005). Удивительный
механизм был найден у Т4 при трансляции гена 60, в котором 50нуклеотидный участок в середине кодирующего региона не транслируется.
Этот механизм зависит от цис-действующего сигнала на мРНК
рибосомального белка L9, пары GGAкодонов, разделенных 47 основаниями, и
особенностей структуры глициновой тРНК. Когда соответсвующий участок
вводили в другие гены, он генерировал схожие альтернативные продукты
трансляции с пропуском 50 нуклеотидов со 100% эффективностью, как это
наблюдается в gp60 (Herretal., 1999).
РЕГУЛЯТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ОСНОВАННЫЕ НА РНК:
АПТАМЕРЫ И SELEX
104
Принцип аптамеров - фрагментов однонитевой ДНК или РНК, которые
формируют высокоспецифичные связыващие агенты - впервые возник в ходе
исследований системы Т4; развитие этой технологии, в свою очередь, помогло
открыть ключ к новым регуляторным механизмам, которые охватывают самые
разнообразные биологические системы. Поэтому мы решили рассмотреть этот
механизм.
Связывание ДНК-полимеразы со специфической петлей на ее мРНК
непосредственно перед сайтом инициации трансляции подавляет
трансляционный процесс. Tuerkи Gold (1990) рандомизировали 8 нуклеотидов
в участке, кодирующем эту петлю, транскрибировали конструкцию с
помощью Т7 РНК-полимеразы и изучили специфичность связывания Т4 ДНКполимеразы с членами этого большого набора РНК - расчетный объем
которого составил 65536 вариантов. Они обнаружили, что РНК, содержащая
дикий тип последовательности Т4, связывается отлично, также как и
отличающаяся от нее на 4 нуклеотида, но другие последовательности делают
это гораздо хуже или не делают вообще. Это привело к кампании по
исследованию систематической эволюции лигандов путем экспоненциального
обогащения (SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment - SELEX) и
разнообразным случаям успешного применения, которое позволило
обнаружить, пожалуй, больше интересного, чем использование
одноцепочечных антител. Случайные регионы РНК или ДНК, теперь
используемые для селекции, обладают размером около 40 нуклеотидов между
праймерами с константными последовательностями, которые используются
для амплификации всех выбранных последовательностей путем ПЦР - около
1015 возможных вариантов. Использование этого подхода сделало возможным
создать короткую однонитевую ДНК или РНК, связывающуюся с активным
сайтом любого фермента и обладающую свойствами сильного ингибитора или
активатора. Молекулы могут быть не только отобраны из большого
количества доступных вариантов, но, однажды выделенные, они могут быть
многократно амплифицированы с помощью ПЦР до очень высоких
105
концентраций. Подобным образом последовательности могут быть прочитаны
и среди них амплифицированы такие, которые способны распознавать
отдельный низкомолекулярный лиганд и могут быть клонированы в
контрольный регион любого гена, предоставляя возможность лиганду
включать и выключать данный ген. Открытие данного феномена привело к
идентификации механизмов, контролирующих в природе общий клеточный
ответ на такие лиганды как S-аденозилметионин, гуанин, аденин,
тиаминпирофосфат, флавинмо- нонуклеотид и витамин В12в большом
разнообразии микроорганизмов (KoizumiandBreaker, 2000; Soukupetal., 2000;
Mandaletal., 2003; MandalandBreaker, 2004; Nahvietal., 2004). Shuи Guo (2003)
показали, что РНК, кодируемая фагом 029, избирательно связывает АТФ и
является критической для процесса упаковки ДНК, который описан в разделе
7. Полученные результаты свидетельствуют том, что АТФ-связывающие
аптамеры, выбранные SELEX, являются схожими с центральной частью 029
пакующей РНК (пРНК).
МОРФОГЕНЕЗ ФАГОВЫХ ЧАСТИЦ И УПАКОВКА ДНК
Долгое время фаги были модельным объектом для изучения сборки
молекулярных компонентов в сложные функциональные структуры.
Для исследований применяли генетические, биохимические,
электронномикроскопические и криоскопические, а также
рентгенокристаллографические и ядерно-магнитно-резонансные подходы.
Крупные фаги-миовирусы - это самые сложные из известных вирусных
частиц, внешне чем-то напоминающие космические станции. У наиболее
изученного фага Т4 40% генетической информации отвечает за синтез и
сборку его вытянутой икосаэдрической головки, хвоста с сократимым чехлом
и шести хвостовых фибрилл. Двадцать пять белков вовлечены в процесс
морфогенеза головки, двадцать два - хвоста и семь - фибрилл. Пять из этих 54
белков являются катализаторами сборки, не входящими в состав
получающегося вириона. Некоторые другие крупные миовирусы сходны по
сложности строения. Более 40 белков было обнаружено в очищенных
106
препаратах фага Pseudomonas aeruginosa 0KZ, чей 280-kbгеном недавно
полностью секвенирован (Mesyanzhinovetal., 2002). 53 белка обнаружены с
помощью PAGEчастиц фага В. subtilisSP01, морфогенетические свойства
которого до сих пор полностью не исследованы. Только несколько фагов
изучены детально; наиболее полная информация имеется о фагах Т4 и Р22. Мы
описываем здесь общие морфогенетические принципы и некоторые их
вариации. Детали хода сборки фага Т4 рассмотрены во многих главах Кагат
(1994) и в Milleretal. (2003b), различных других фагов в книгах Webster(1999)
и Calendar(2005).
ФОРМИРОВАНИЕ ГОЛОВКИ
Для хвостатых фагов морфогенез головки является сложным
многостадийным процессом, который до сих пор не полностью воспроизведен
invitro.Первая обнаруживаемая в ходе инфекции головкоподобная структура толстостенная проголовка, формирующаяся вокруг сердцевины скаффолда.
Стадия созревания капсида обычно сопровождается протеолизом белка
скаффолда и протеолитическим процессингом других белков проголовки.
Голова заполняется ДНК перед тем, как к ней присоединяется хвостовая
структура, и формируется инфекционная частица фага. Упаковка ДНК часто
начинается с длинного линейного конка- темера и завершается на
определенной последовательности или, у некоторых фагов, по заполнении
головки фага. Последний механизм может приводить к формированию
трансдуцирующих фагов, несущих в том числе и хозяйскую ДНК. Для таких
фагов, как SPP1, Р22, ТЗ, Т7, X и Т4, удалось получить препараты головок в
состоянии, восприимчивом для упаковки фаговой или чужеродной ДНК.
Созданные системы упаковки invitroпозволяют затем присоединить к
головкам хвосты с получением жизнеспособных частиц. Создание этих систем
оказалось возможным путем использования мутантов фага, дефективных на
разных стадиях сборки и заполнения головки. Это помогло различить
истинные промежуточные стадии формирования головки от абортивных
комплексов, а также дало возможность использования результатов для
107
разнообразных технических целей.
Сборка проголовки обычно начинается с формирования инициаторного
портального белкового комплекса (portalproteininitiatorcomplex), на котором
собираются скаффолд-белки и основной(ые) белок(ки) капсида. У некоторых
фагов, таких как Т4, сборка проголовок происходит на поверхности мембраны,
присоединение к которой идет через определенный фаговый или хозяйский
белок (у Т4 - gp40 - Ред). Портальный комплекс занимает одну из 12 вершин
икосаэдричес- кой головки. Он служит впоследствии сайтом присоединения
для ферментного комплекса, упаковывающего ДНК, каналом через который
ДНК входит в и покидает еее в процессе инфекции, а также сайтом
присоединения фагового хвоста. Белки скаффолда не образуют
икосаэдрическую сердцевину, но взаимодейству- юя с основными белками
капсида в метастабильном комплексе, позволяет всем субъединицам стенки
головки фага приянть правильное положение и конформацию,
соответствующую их позициям в икосаэдрической решетке законченного
капсида. Головки фага Р22 собираются в свободном состоянии в цитоплазме.
Белок скаффолда необходим для включения с состав проголовок портального
белкового комплекса, также как других минорных капсидных белков.
Существуют непрямые доказательства взаимодействия скаффолда и
портального комплекса в процессе инициации сборки, прямых биохимических
доказательств этого взаимодействия не найдено (Moore, Prevelige, 2002).
Головочный белок Р22 необычен тем, что способен сам соединяться в
нормально выглядящую икосаэдрическую структуру, даже без портального
комплекса. Правда, в отсутствие скаффолда капсидный белок Р22 часто
собирается в структуры аберрантной формы и пустые многогранники.
У некоторых фагов, например у Р22,скаффолд-белок способен
разбираться и участвовать в сборке других головок; в других случаях,
например у Т4,он подвергается протеолитическому расщеплению. Для
некоторых хорошо изученных фагов портальный комплекс - это кольцо из 12
портальных белковых молекул, занимающих место одного из пентамеров
108
покровного белка, который обычно завершает каждую вершину.
RogerHendrix(1978) предположил, что это нарушение симметрии (через
вершину икосаэдра проходит ось симметрии 5-го порядка) может позволять
вращение портальной структуры во время упаковки ДНК.
У большинства фагов разнообразные структурные белки подвергаются
протеолитическому процессингу при созревании проголовки. Затем
проголовка расширяется и переходит в более стабильную финальную
структуру, при этом ее объем увеличивается почти вдвое; это происходит
перед или в связи с упаковкой ДНК. Схожие процессы были обнаружены у
герпесвирусов и аденовирусов. Helgstrandс коллегами (2003) определили
кристаллическую структуру оболочки головки лямбдоподобного фага НК97 первого хвостатого фага, структура капсида которого исследована с атомным
разрешением. Оболочка НК97 интересна особенным взаимодействием
соседних субъединиц белка gp5, основного головочного протеина, ковалентно
соединенных в петамерные и гексамерные кольца (Duda, 1998). Кольца также
соединены с кольцами соседних пента- и гексамеров, образуя своеобразную
белковую кольчугу. Ковалентные связи также были обнаружены у других
хвостатых фагов, например у фага Pseudomonas D3. Интересно, что другие
фаги, не образующие ковалентных связей между белками, могут, однако,
образовывать «кольчужные» соединения субъединиц.
УПАКОВКА ДНК
Одним из наиболее экстраординарных аспектов сборки вирусов
является упаковка очень длинной молекулы ДНК в проголовку, причем она же
и обеспечивает очень быстрое выведение ДНК, без запутывания, в момент
начала инфекционного процесса. Jardineи Anderson (2005) рассмотрели
данные о процессе, известные к тому времени, сфокусировавшись на
структуре и механизме движения и природе химическо-механического
преобразования энергии.
Субстратом для упаковки всегда является линейная молекула ДНК,
которая упаковывается последовательно. Некоторые фаги, например 029 и Р2,
109
продуцируют хромосому единичной длины перед ее инкапсуляцией, но
большинство известных ДНК-содержащих фагов во время репликации
синтезируют конкатамеры из нескольких копий генома, соединенных по
принципу голова - хвост, которые разрезаются во время упаковки. В случае
фагов Т7 и лямбда уникальные концы создаются отрезанием по
специфическим сайтам упаковки (cosсайты). В некоторых случаях образуются
липкие взаимокомплементарные однонитевые концы, позволяют геному
рециркулизоваться после входа в клетку. В других случаях, как у Р22, Р1 и Т4,
упаковка продолжается до полного заполнения головки ДНК, причем объем
головки несколько превышает размер единичного генома. Это создает
значительную терминальную избыточность и приводит к набору циклично
пермутированных молекул ДНК среди фаговых частиц. Некоторые такие
фаги, например Р22, начинают процесс упаковки с уникального сайта рас и
продуцируют относительно мало фагов с каждой конкатемерной молекулы - у
этих вирусов кольцевые перестановки затрагивают лишь часть генома.
Другие, подобно Т4, могут начинать упаковку с любого свободного конца
генома и также подлежат активной рекомбинации, генерируя разветвленные,
а не линейные структуры ДНК, эквивалентные 50 геномам во время
нормальной фаговой инфекции, и многим сотням, если процесс сборки фагов
выключен путем соответствующей мутации.
У Т4 и других фагов с подобной стратегией упаковки кольцевые
пермутации захватывают всю последовательность генома. Иными словами, у
отдельной частицы физический левый конец ДНК отдельной вирусной
частицы может располагаться в любой точке последовательности генома, что
приводит к образованию кольцевой генетической карты, несмотря на то, что
ДНК фага Т4 - линейная. По мере упаковки ДНК белок gp49 отрезает все
ветви,после чего восстанавливаются все надрывы и бреши в ДНК. В случае
фага Ми фаговая ДНК упаковывается, будучи все еще частью хозяйского
генома. Хозяйская молекула разрезается в нескольких десятках оснований до
начала генома фага и упаковывается вместе с несколькими сотнями оснований
110
после конца генома Ми, где ее отрезает фермент - терминаза. Это делает фаг
Ми способным к общей трансдукции.
Терминазы АТФазы преобразуют химическую энергию в
механическую. Аппарат для упаковки устроен по общему образцу, но обладает
индивидуальными особенностями. Симметричный кольцевой портальный
комплекс с центральным туннелем занимает одну из вершин проголовки.
Молекулы фаговой терминазы-АТФазы (обычно гексамеры. - Ред.) соединены
с этим коннектором и с ДНК. Терминаза распознает и разрезает
конкатамерный двунитевой ДНК-субстрат, соединяет ДНК с головой и
начинает АТФ-зависимую упаковку ДНК. Второе нук- леазное расщепление
позволяет завершить процесс. В общем распознавание и связывание
терминазы с ДНК производится через малую субъединицу, в то время как
эндонуклеазная и АТФная активности присущи большой субъединице. Обе
они являются высоко консервативными белками. У большинства, хотя не у
всех фагов завершающий разрыв используется для упаковки следующей
проголовки, и так до конца конкатемерной молекулы.
У фагов семейства о29уникальная 120-нуклеотидная РНК, называемая
упаковочной РНК, входит в состав упаковочного комплекса и функционирует
как АТФаза. РНК формирует шпилечную структуру с «головочной петлей» на
вершине и петлями, выступающими на правой стороне рядом с вершиной и на
левой, на пути к низу. Только во время упаковки ДНК гексамер скрученной
таким образом РНК связывается с головочно-хвостовым коннектором через
«головочную петлю» - участок, сходный с последовательностью АТФсвязывающих ап- тамеров, найденных методом SELEX. Каждый из 029подобных фагов, изученных к настоящему времени, обладает своей, несколько
отличной упаковочной РНК, и эти разновидности не взаимозаменяемы. Если
даже одна из шести РНК будет заменена на неактивную, то процесс упаковки
полностью остановится, замена даже одного основания может привести к
полному ингибированию упаковки. Invitroупаковка с использованием
очищенных компонентов идет очень активно и дает возможность изучения
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]