Бактериофаги. Учебно-методическое пособие

также короткоживущими, строго в оптимальный момент после фаговой инфекции, чтобы максимально увеличить детекцию репортерного гена, экспрессируемого с фагового генома.

течение 4-6 часов, поскольку время, нужное для корректного фолдинга и окисления полипептида GFPс образованием функционального флюорофора, лимитирует скорость. Однако преимущество этого репортера состоит в том, что, будучи раз синтезирован, белок GFPвесьма стабилен, и сигнал получается «долгоиграющим». Кроме того, белок, освобождаемый из клеток при лизисе, дает даже лучшее свечение, чем находящийся внутри клеток.

Создание технологии фагового дисплея (Smith, 1985) произвело революцию в методах поиска пептидов, способных связываться с заданными субстратами. В этой системе библиотеки случайных пептидов (часто получаемые с помощью мутагенизирующего варианта ПЦР) клонируются в геном нитчатого фага (например, М13) в виде фьюза (слитого гена) с геном белка оболочки. Клонированные таким образом пептиды экспонируются на поверхность вирионов. Размер экспонируемых пептидов ограничивается требованием сохранения нормальной структуры и жизнеспособности рекомбинантного фага. Ключевым свойством этой системы, определившим успех метода, является легкость скрининга фаговых библиотек пептидов, поскольку ген, кодирующий отобранный пептид, оказывается сразу же доступным для анализа (SmithandPetrenko, 1997). В частности, клоны, экспонирующие пептиды с необходимой аффинностью, могут быть отобраны в эксперименте биопаннинга путем связывания фаговых частиц с твердой поверхностью, покрытой необходимым лигандом (например, в иммунологическом планшете).Фаги, которые не связываются с лигандом достаточно прочно, удаляются при промывке, и остающаяся на твердой поверхности фракция исходной библиотеки обогащается нужными клонами фага. Повторные раунды наращивания - биопаннинга приводят к быстрой идентификации пептида, обладающего наибольшей аффинностью к выбранному лиганду (HayhurstandGeorgiou, 2009).

Также был предложен метод пептид-опосредованного магнитного разделения (Stratmannetal., 2002), в котором использовались идентифицированные с помощью фагового дисплея пептиды, специфически связывающиеся с клетками Mycobacteriumaviumподвида paratuberculosis.Этими пептидами были покрыты парамагнитные микросферы, которые применяли для захвата и концентрирования клеток данного микроорганизма из образцов молока перед проведением его ПЦР­идентификации.

Однако вместо того, чтобы очищать пептиды и метить их детектируемыми маркерами, такими как щелочная фосфатаза, флуоресцентный белок или краситель, было предложено также использовать сами рекомбинантные фаговые частицы в качестве скаффолда, стабилизирующего активный пептид. В этих случаях к поверхности фагов можно пришить красители, такие, как Су5 или Alexa, или использовать флуоресцентно-меченные моноклональные антитела против фаговых поверхностных белков. В идеале, если пептид экспонируется в виде фьюза с главным белком оболочки фага fd, pVIII, до 4000 молекул, связывающих целевой лиганд, будут представлены на поверхности каждой частицы. Анализ с прямым использованием рекомбинантных фаговых частиц оказался способным детектировать стафилококковый энтеротоксин В с эффективностью, сопоставимой со стандартным методом ИФА (Goldmanetal.,

инкубируют для связывания с антигеном. Антитела могут одновременно связываться с несколькими мишенями, и в результате два различных фага оказываются физически связанными друг с другом. После этого к образцу добавляют клетки хозяина фагов и затем высевают их на среду с двумя антибиотиками. Так как используется низкая множественность инфекции, вероятность случайной коинфекции клетки двумя разными фагами очень мала. Поэтому появление многочисленных устойчивых вобоим антибиотикам колоний бактерий сигнализирует, что соответствующие фаговые частицы были физически объединены за счет связывания антител на их поверхности с одной частицей антигена. Таким образом, двойная инфекция служит детектором связывания антитела и антигена.

отражает в этих названиях тот факт, что начальное событие - инфицирование клетки патогена - развивается до образования бляшки, обеспечивая усиление детектируемого сигнала (рис. 9.4). Анализ начинают с добавления к анализируемому образцу фага, специфичного к интересующему микробу. Инкубация образца проводится в течение времени, необходимого для адсорбции фага на клетках патогена и вхождения в эклипс-фазу. На этом этапе добавляется вирицидный агент, разрушающий неадсорбированных фагов, но не действующий на инфицированные клетки. Множество различных вирицидных субстанций было предложено ранее, среди них: уксусная кислота, железоаммонийные квасцы, различные растительные экстракты и эфирные масла. После короткого периода инкубации, достаточного для разрушения всего несвязавшегося фага, вирицидный агент нейтрализуют. Образец смешивают с суспензией клеток индикаторного штамма и высевают на чашку Петри стандартным двуслойным методом. Цикл репликации фага может быть теперь закончен с образованием одной бляшки из каждой инфицированной клетки, присутствовавшей в образце. Таким образом, каждая бляшка

но может сформировать газон за всего 12-48 ч. Что касается обнаружения патогенов в образцах продуктов питания, наибольшее затруднение здесь представляет ингибирующий фаговую инфекцию эффект самого продукта. Аналогичная проблема возникает при анализе мокроты. Однако предложены усовершенствования метода, преодолевающие это затруднение, и в работе Parkс коллегами (2003) сообщается, что с помощью новой модификации метода авторам удалось детектировать менее 100 жизнеспособных клеток М.