Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
данного процесса.
111
112
БАКТЕРИОФАГИ И ВИРУЛЕНТНОСТЬ БАКТЕРИЙ
В большинстве случаев различие в степени патогенности между
бактериями разных видов и между различными бактериальными штаммами
внутри одного вида кроется в наличии и экспрессии «генов вирулентности»,
то есть генов, которые кодируют факторы вирулентности в патогенных
штаммах, или их отсутствии в родственных непатогенных штаммах. Многие
гены, кодирующие факторы вирулентности у факультативно патогенных
микроорганизмов, таких как Escherichiacoli, Listeria monocytogenes,
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus spp., Staphylococcus aureus и Vibrio
cholera,присутствуют в различных мобильных элементах, таких как
транспозоны, плазмиды, бактериофаги и островки патогенности. В этой связи
становится очевидным, что бактериофаги, как группа мобильных
генетических элементов, способных к существованию вне клетки, играют
важную роль в эволюции и появлении патогенных бактерий. В процессе
фаговой конверсии гены вирулентности, кодируемые бактериофагами, могут
преобразовать бактерию-хозяина из непатогенного в вирулентный штамм, или
уже вирулентный штамм превратить в еще более вирулентный путем
предоставления ему дополнительных механизмов для инвазии в ткани хозяина
или избегания иммунной защиты макроорганизма. Конечно, утрата этого
бактериофага может превратить бактериальный штамм в непатогенный.
Однако большинство бактериофагов, имеющих гены вирулентности, являются
умеренными фагами, которые образуют устойчивые лизогены. Таким образом,
лизогенная конверсия не приводит к лизису бактерий, а, напротив,
обеспечивает как вертикальный, так и горизонтальный перенос генов, что, в
свою очередь, обеспечивает бактерии- хозяину некоторые преимущества и
может привести к клональной экспансии отдельного штамма. Эта гипотеза
подтверждается недавним распространением эпидемии холеры от Азии до
Южной Америки после почти столетнего перерыва. Гены ctxAB,кодирующие
холерный токсин (СТ), находятся в геноме нитчатого бактериофага СТХи
113
(WaldorandMekalanos, 1996). Таким образом, лизогенная конверсия холерного
вибриона с помощью СТХи позволяет бактерии производить холерный
токсин, являющийся основной причиной секреторной диареи, столь
характерной для холеры. В результате возбудитель заражает новых хозяев и
усиливает свое распространение, вплоть до пандемии.
Локализация внутри фагового генома многочисленных генов,
кодирующих факторы вирулентности, также предполагает наличие
эволюционных преимуществ для бактериофага за счет повышения
выживаемости лизогена. Таким образом, экологический успех лизогенных
бактерий способствует распространению генов бактериофагов. Данный
феномен служит также хорошей иллюстрацией коэволюции бактерий и
бактериофагов. В этой главе обсуждаются различные классы факторов
вирулентности, кодируемых бактериофагами, эволюционное распределение и
разнообразие бактериофагов среди патогенных бактериальных изолятов. Гены
вирулентности классифицируются на основе той роли, которую играют их
продукты на различных стадиях патогенеза, таких как прикрепление и
колонизация, избегание атаки со стороны иммунной системы хозяина,
проникновение внутрь клетки, внеклеточное выживание и продукция токсина.
Распространенность и эволюционное распределение бактериофагов и генов
вирулентности рассматриваются с точки зрения их появления в пределах вида.
Изучение разнообразия бактериофагов, кодирующих факторы
вирулентности, показало, что они морфологически весьма разнообразны и
относятся к различным семействам вирусов, геном некоторых из них имеет
мозаичную организацию, сочетая характеристики, свойственные более чем
для одного вирусного семейства (Canchayaetal., 2003). Также рассматриваются
три возможных механизма, с помощью которых бактериофаги приобретают
гены вирулентности: во-первых, путем неточного вырезания профага из
генома хозяина, во-вторых, с помощью переноса мобильных модулей в геном
бактериофага или, в-третьих, эти гены могут быть неотъемлемой частью
генома бактериофага (табл. 8.2). Также мы проанализируем косвенную и
114
прямую роль, которую бактериофаги играют в проявлении вирулентности
бактерий, - например, роль пассивных векторов для переноса генов
вирулентности или роль активных компонентов в регуляции бактериального
патогенеза. Кроме того, было рассмотрено, какую роль в проявлении
патогенности бактерий играют взаимодействия «фаг - фаг», включая
необходимость в фаге-помощнике (хелпере) при мобилизации и
функционировании другого бактериофага. И, наконец, мы обсудим общие
черты и взаимосвязь бактериофагов и островков патогенности бактерий.
ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ, КОДИРУЕМЫЕ БАКТЕРИОФАГАМИ
В данном разделе обсуждается несколько факторов вирулентности,
кодируемых бактериофагами. Эти бактериофаги относятся к семействам
lnoviridae(нитчатые фаги), Myoviridae(фаги с сократимым хвостом),
Podovirdae(фаги с коротким хвостом) и Siphoviridae(фаги с длинным
нескоратимым хвостом).
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ТОКСИНЫ
Среди кодируемых бактериофагами факторов вирулентности
наилучшим образом охарактеризованы внеклеточные токсины, производимые
различными грамотрицатёльными и грамположительными бактериями.
Токсины, кодирумые бактериофагами, имеют большое функциональное
разннобразие. К ним относятся некоторые из наиболее мощных известных
бактериальных токсинов, такие как столбнячный токсин, ботулинический
токсин, дифтерийный токсин, кодируемые профагами, скрывающимися в
соответствующих бактериях - Clostridiumtetani, С. botulinumи
Corynebacteriumdiphtheriae.Токсины, кодируемые бактериофагами, могут
обладать цитотоксическим, энтеротоксическим или нейроток- сическим
эффектом и способствуют возникновению множества разнообразных
бактериальных заболеваний - от легких желудочно-кишечных расстройств до
угрожающих жизни септических или токсикоинфекций. Другая
примечательная особенность этих токсинов заключается в том, что все они,
будучи приобретены путем латерального переноса генов из неизвестных нам
115
источников, тем не менее, полностью контролируются хромосомными
факторами регуляции бактерий-хозяев, что предполагает наличие некоторого
общего предка у вида-источника и вида-получателя гена.
БЕЛКИ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В ПРОЦЕСС ПРИКРЕПЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ И
КОЛОНИЗАЦИИ
Еще одним пунктом в списке факторов вирулентности, кодируемых
бактериофагами, являются белки, участвующие в присоединении бактерий к
клеткам-хозяевам. Такое присоединение является важным шагом в развитии
бактериальной инфекции. У холерного вибриона токсин, регулируемый
совместно с пилями (TCP), играет существенную роль в колонизации
кишечника человека (Tayloretal., 1987). Таким образом, предположение, что
гены TCPкодируются фагом (Karaolisetal., 1999), имеет большое значение и
очень интересно (Lee, 1999; DavisandWaldor, 2003; Miller, 2003; Faruqueetal.,
2003). Первоначально генный кластер tcp,кодирующий TCP, был определен
как часть островка патогенности (PAI) или как островок патогенности рода
Vibrio(VPI) (Karaolisetal., 1998). VPI - это частный случай PAI, который тоже
является большим хромосомным регионом (39,5 т.п.н.), несущим несколько
кластеров генов вирулентности и интеграз, похожих на фаговые.
VPIпомещается рядом с tRNA-подобными генами (ssrA), а содержание
GCотличается от такового в хромосоме бактерии-хозяина (рис. 8.4).
Впоследствии Karaolisс коллегами (Karaolisetal., 1999) обнаружили, что
TCPкодируется нитчатым фагом VPI0, и что белок ТсрА, являющийся
мономером, из которого состоят TCPпили, также является белком капсида
фага VPI0. Сам этот нитчатый фаг сильно отличается по нуклеотидной
последовательности от других нитчатых фагов. Однако авторы не смогли
показать передачу фага VPN0среди изолятов V. choleraeсерогруппы 01. Кроме
того, Faruqueс коллегами (2003а) не смогли подтвердить существование фага
VP10 при проверке коллекции ТСР-содержащих, VPI-положительных
клинических и природных изолятов V. choleraeв тех условиях, что описывает
Karaolis, включая обработку митомицином С и УФ индукцию (1999).
116
Несмотря на то, что различные результаты обоих исследований можно
объяснить минимальными различиями между штаммами и условиями роста,
исследование Faruque(2003а), наряду с отсутствием потверждения
доказательств существования VPI0, предполагает необходимось
дополнительных исследований для подтверждения или опровержения
существования VPIи понимания его роли в патогенности холерного вибриона.
БЕЛКИ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ИЗБЕГАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
ХОЗЯИНА
Как только патоген попадает в организм человека, он встречается с
первой линией обороны от бактериальной инфекции - с врожденным
неспецифическим иммуннитетом. Некоторые гены лизогенной конверсии
кодируют белки, которые изменяют распознание бактерий иммунной
системой хозяина или сообщают бактерии устойчивость к сыворотке крови.
К этой категории принадлежат гены модификации О-антигенов, белки
которых меняют антигенную структуру поверхности клеток, способствуя тем
самым избеганию воздействия иммунной системы хозяина. Гены
модификации О-антигена включают такие гены Е. coliиShigellaspp., как rfb,
оас и gtp,которые кодируют липополисахарид-О-антиген-гликозилирующие,
ацетилирующие и трансферазные ферменты соответственно. Эти гены
находятся в геномах нескольких морфологически отличающихся
бактериофагов, принадлежащим к разным семействам, Podoviridae,
Siphoviridae, Afyoviridae и Inoviridae. Генетически эти бактериофаги
объединяют несколько общих свойств, таких как расположение генов
модификации О-антигена, сразу же после attP-сайта присоединения
бактериофага, которому предшествуют гены интегразы (int) и фермента
эксцизии (xis). Это характерно для бактериофагов Е. coliSfV, SfX, Sfllи Sf6 и
для фага S. entericaР22 (Allisonand Verma, 2000; VanderBylandKropinski, 2000).
Интегразы фагов SfV, SfX, Sfllи Sf6 очень похожи с соответствующим белком
фага Р22 и attP, сайт присоединения SfV, SfXи Sfllидентичен таковому у фага
Р22. Гены упаковки ДНК фага SfVи гены головочных белков организованы,
117
как у типичного лямбдоидного сифовируса, однако хвостовые гены
напоминают таковые у мю-подобного миовируса (Allisonetal., 2002).
Морфологически SfVявляется миовирусом, таким образом, химеры между
принадлежащими к различным классам бактериофагам могут быть
носителями генов лизогенной конверсии.
МЕХАНИЗМЫ ПРИОБРЕТЕНИЯ ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ
БАКТЕРИОФАГАМИ
В даном разделе обсуждаются три возможных сценария приобретения
генов вирулентности бактериофагами. Как было ранее замечено в данной
главе, гены, кодирующие факторы вирулентности, могут быть продуктами
неточного вырезания профагов из геномов предыдущих бактерий-хозяев,
могут переноситься модулями ДНК, с собственными промоторами и
терминаторами, или интегральными компонентами геномов бактериофагов.
Большинство фаговых генов, кодирующих бактериальные факторы
вирулентности, не важны для репликации фагового генома, морфогенеза или
сборки вирусных частиц. Кроме того, поскольку многие гены вирулентности
демонстрируют независимую от остального генома бактериофагов эволюцию
и находятся недалеко от сайта attPбактериофага, весьма вероятно, что
бактериофаг приобрел их в результате неточного вырезания профага из генома
бактерии-хозяина. Неточное вырезание профага с захватом генов токсинов
было продемонстрировано у S. pyogenes; в частности, гены, кодирующие
экзотоксины SpeAи SpeC, находящиеся с составе генома бактериофагов
T12HCS112 соответственно (Zabriskie, 1964; GoshomandSchlievert, 1989),
расположены в непосредственной близости к attPсайту, имеют собственный
промотор, отдельный от остальной системы контроля транскрипции
бактериофага. Действительно, все последовательности профагов S.
pyogenesобладают генами лизогенной конверсии, расположенными в
специфическом участке, между генами фаговых лизинов и правым attсайтом
присоединения бактериофага. Похожая ситуация наблюдается у изолятов S.
aureus,где гены лизогенной конверсии находятся между генами лизина и
118
правым attсайтом бактериофага (Desiereetal., 2001; Ferrettietal., 2001;
Smootetal., 2002).
Дальнейшие доказательства в поддержку этой модели независимого
проиобретения генов вирулентности путем неточного вырезания профага
можно почерпнуть из исследования (Nakayamaetal., 1999) 0CTX, бактериофага
Р.aeruginosa- конвертирующего бактериофага, кодирующего цитотоксин. Ген
токсина ctxлокализован около правого attсайта бактериофага, и содержание в
нем GC-napотличается от содержания GCв остальном геноме бактериофага.
Возможным вариантом механизма приобретения генов вирулентности за счет
неточного вырезания является неточная репликация профагов. В геноме фага
CTX0гены ctxAB,которые кодируют СТ, расположены недалеко от сайта
attRSи имеют отличное от прочего генома процентное содержание
GCнуклеотидов. Поскольку при образовании вирионов СТХ не происходит
вырезания профага СТХ из хромосомы (DavisandWaldor, 2000), наиболее
вероятно, что геном пре-CTXбыл интегрирован в прилегающие к ctxABгенам
области, и фаг СТХи, обладающий генами ctxAB,мог бы быть получен в
результате неточной репликации профага. Предшественник фага СТХи (преСТХи) был обнаружен в нетоксигенных изолятах V. choleraeи не содержал ни
генов ctxAB, ни расположенного выше контрольного региона с
ctxABпромотором, в норме находящегося с 5-стороны от ctxAB(Boydetal.,
2000a). Каждый пре-СТХи профаг порождает СТХи в форме репликативной
плазмиды, чья организация генома идентична таковой у собственно СТХи, за
исключением отсутствия генов ctxAB,имеющихся у последнего (Boydetal.,
2000а). Существование одновременно как пре-СТХи, так и СТХи в популяции
V. choleraeставит вопрос, не сообщают ли другие гены СТХи, отличные от СТ,
какого-либо селективного преимущества лизогенным клеткам. То есть,
например, не может ли роль токсинов Асе и Zotв энтеротоксичности быть
выше, чем предполагалось?
В противоположность описанным выше генам, кодирующим токсины,
предполагаемые гены вирулентности у профагов Е. coliи Salmonellaне
119
сосредоточенны исключительно около attсайтов, то есть их можно
обнаружить внутри генома бактериофага. Тем не менее, их местоположение
неслучайно, и большинство из них находится ниже по ходу транскрипции от
(1) гомологов антитерминаторов бактериофага лямбда Nили Q, либо (2) от
кассеты лизиса, расположенной в центре карты генома лямбдаподобного
профага, либо (3) от генов, кодирующих фибриллы хвоста и вовлеченных в
распознавание хозяина, и которые часто являются мишенью для различных
рекомбинаций, либо (4) от генов протеазы фагового капсида. Эти гены
вирулентности часто представляют собой отдельные транскрипционные
единицы, фланкированные собственными промотором и терминатором,
которые предотвращают транскрипцию тех частей генома профага, для
которых важно сохранять транскрипционное молчание с целью поддержания
состояния профага. Поскольку эти гены вирулентности несут больше
генетического материала, нежели найдено у похожих бактериофагов, то для
названия дополнительной ДНК был предложен термин морон (Hendrixetal.,
1999).
Анализ последовательностей ДНК генома фага Н-19В
(NeelyandFriedman, 1998b) выявил, что гены stxABнаходятся дальше по ходу
транскрипции и направление их транскрипции такое же, как у гомолога A.Q,
который является активатором транскрипции позднего промотора Р'рпоздних
генов фага. Гены stxпредставляют собой жестко контролируемые
транскрипционные единицы, регулируемые сигналами, связанными с
питанием (низкая концентрация железа, контакт с эукариотической клеткойхозяином и т.д) или экспрессирующиеся при индукции профага. Напрмер,
шига-токсин не несет сигналов транспорта через мембрану и нуждается для
экспорта в лизисе хозяина, который происходит после индукции профага в
небольшом количестве лизогенных клеток (WagnerandWaldor, 2002). Таким
образом, местоположение генов stxмежду антитерминатором Qи кассетой
генов лизиса имеет определенный биологический смысл.
Ранее мы начинали разговор о том, что многие гены бактериофагов,
120
которые кодируют факторы бактериальной вирулентности, кажутся
последствиями контактов с геномом клеток-хозяев, и они не требуются для
регуляции генома бактериофага и его морфогенеза. Интересным исключением
является структурные белки фага, которые также участвуют в прикреплении
S. mitisк тромбоцитам человека, то есть могут служить примером белков,
несущих двойные функции (Bensingetal., 2001а; Bensingetal., 2001b).
Аналогично у Vcholeraeпродукты генов фага СТХи асеи zotпринимают
участие в сборке и морфогенезе фагов (WaldorandMekalanos, 1996), а также
являются токсинами (Fasanoetal., 1991; Trucksisetal., 1993).
РОЛЬ БАКТЕРИОФАГОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
ИНФЕКЦИЙ
Бактериофагов, которые кодируют гены вирулентности, обычно
рассматривают как пассивные векторы для распространения этих генов в
бактериальной популяции, и они участвуют в распространении факторов
вирулентности и появлении новых патогенных штаммов как у
грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий. Например,
CTX0отвечает за горизонтальный перенос генов ctxABмежду изолятами
холерного вибриона и является ключевым фактором для проявления новых
токсигенных штаммов. Действительно, на сегодняшний день
идентифицировано по крайней мере пять бактериофагов V.
cholerae,способствующих латеральному переносу генов факторов
вирулентности между штаммами. Кроме того, гены stxABв большинстве
изолятов Е. coliSTECнаходятся в геномах лямбдоидных профагов, что,
возможно, объясняет широкое распространение stxABу более, чем 60
серотипов Е. coli.Также возможно, что некоторые из этих штаммов возникли
через переключение антигенов, в этом случае обычные патогенные штаммы
приобретали новый серотип. Также гены шига-токсина штаммов
Shigelladysenteriae,клонально происходящего от Е. coli(то есть
филогенетически группирующихся со штаммами Е. coli,кодируются
лямбдоидным фагом. Кроме того, присутствие многочисленных генов,
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]