Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
41
Фаговые хромосомы переносятся к плазматической мембране, где gp5
удаляется с поверхности частицы и заменяется белком оболочки gp8, до этого
соединенным с мембраной посредством своего гидрофобного домена. Это
происходит одновременно с выталкиванием фаговых частиц из клетки. Белки
gp3 и gp6 локализованы на противоположном конце зрелой частицы.
Рисунок 11 - Сборка нитевидного фага М13 на поверхности клетки
Морфопоэз (сборка) фаговых частиц происходит на позднем этапе
цикла. На поздней стадии жизненного цикла фагов происходит в основном
сборка фаговых частиц. Они образуются непрерывно, пока их продукцию не
прекратит лизис. У фагов известно два различных механизма сборки.
1. Для РНК-содержащих и нитевидных оцДНК- содержащих фагов
описан процесс, называемый «одеванием хромосомы». Новообразованная
фаговая ДНК, еще покрытая ДНК-связывающими белками, окутывается
белками оболочки в процессе переноса вири- она через клеточную стенку
наружу. Это обменный процесс, в котором белок, связанный с
одноцепочечной ДНК, замещается белком оболочки, до этого хранящимся в
42
клеточной мембране. Освобожденный белок подвергается рециклизации и
вновь используется для защиты синтезируемой ДНК фага. Наиболее полно
этот процесс изучен у фага М13.
2. Крупные дцДНК-содержащие фаги и опДНК- содержащие фаги с
икосаэдрическими капсидами осуществляют процесс сборки, включающий
взаимодействие не полностью собранных капсидов (прокапсидов) с ДНК.
Основные компоненты фаговой частицы, а именно головка (капсид,
заполненный ДНК), отросток и нити отростка, собираются в несколько
генетически контролируемых этапов независимыми путями.
Дефект в любом из генов сборки вызывает прекращение продукции фага
и накопление незрелых предшественников фаговых частиц. Синтезированная
фаговая ДНК активно упаковывается в предварительно образованный
белковый контейнер (капсид), в котором нет избыточного пространства, и в
связи с этим необходима плотная упаковка хромосомы в
высококонденсированном состоянии («заполненная головка»). Полностью
сформированные элементы на конечном этапе сборки соединяются с
помощью дополнительных белков, образуя жизнеспособные фаги, которые
остаются внутри клетки до ее лизиса. Этот тип сборки наиболее изучен у фагов
Т4 и Л. В случае фага Т4 примерно 40% генов обеспечивает морфологические
функции. Механизмы сборки были раскрыты Эпстайном (R. Epstein) с
сотрудниками путем детального изучения фенотипов фагов, несущих мутации
в генах созревания.
Сборка капсида и упаковка ДНК у фага Т4
Сборка фаговых капсидов происходит независимо от того, присутствует
ДНК для упаковки или нет. Однако упаковка ДНК служит необходимым
условием соединения отростка с головкой. В отсутствие ДНК в клетке
накапливаются пустые капсиды («тени»). У фага Т4 в инициации упаковки
ДНК участвуют белки gpl6 и gpl7, тогда как продолжение процесса упаковки
в большой степени зависит от белка gp49.
43
Процессинг капсида и созревание ДНК иллюстрирует рис. 26.14 (см. цв.
вклейку). Упаковка ДНК начинается, когда белки gpl6 и gpl7 опосредуют
прикрепление подготовленной ДНК к компетентным капсидам. После
заполнения головка стабилизируется и скрепляется добавлением белков gpHoc
и gpSoc к капсиду и белков воротничка gpl3 и gpl4 к основанию головки. В
таком виде заполненная головка готова для спонтанного соединения с
отдельно собранным отростком. Капсид формируется как прикрепленная к
внутренней мембране клетки структура, образуемая двумя основными
белками-предшественниками (gp23 и gp24), которые наслаиваются на своего
рода каркас, состоящий из нескольких основных и минорных белков (gp21,
gp22, gp67, gp68, IPI, IPII, IPIII и gpAlt).
После протеолитического отщепления капсида от мембраны его
структура готова к приему ДНК, подготовленной к упаковке в результате
репликации в виде крупных конкатенатов (200Б-ДНК; S —константа
седиментации), образуемых сцепленными молекулами ДНК (для сравнения,
одиночная ДНК фага Т4 имеет размеры 63S). Упаковка происходит с затратой
АТР, с участием процессированных капсидов и белков gpl6 и gpl7. ДНК
вводится в капсид до его заполнения, и при этом ДНК в головке оказывается
примерно на 5% больше величины фагового генома. Только тогда хромосома
отщепляется от цепи-предшественника, освободившийся конец которой
используется далее в качестве нового участка инициации упаковки при
заполнении следующего капсида. Этим объясняется, почему генетическая
карта фага Т4 циклически пер- мутирована и характеризуется концевой
избыточностью в 5%, хотя отдельная хромосома обнаруживает физическую
линейность.
В процессе заполнения капсид увеличивается в объеме и к его белковой
решетке добавляются белки gpNoc и gpSoc. Сформированная таким образом
головка компетентна для вступления в следующую важную стадию сборки
фага - этап присоединения отростка. Мутации в генах 16, 17 или 49 нарушают
упаковку ДНК и созревание головок. Инициирующие белки gpl6 и gpl7
44
необходимы для прикрепления конца молекулы ДНК к процессированнму
капсиду и инициации процесса его заполнения. Дефект в любом из этих генов
вызывает накопление большей частью пустых капсидов и неупакованной
ДНК-предшественника. Белок gp49 - это эндонуклеаза, ответственная за
удаление ответвлений и других структурных нарушений в
новореплицированной ДНК, способных стерически препятствовать упаковке.
К таким структурным нарушениям относятся трех- и четырехходовые
ветвления, ошибки спаривания, гэпы, одноцепочечные разрывы,
одноцепочечные выступающие концы и петли. Эндонуклеаза gp49
функционирует как защитная система, проверяющая ДНК, отмечающая
структурные ошибки одноцепочечными разрывами и таким образом
готовящая их к дальнейшей репарации. У мутантов с дефектным геном 49
возможна инициация упаковки ДНК, но завершения упаковки не происходит
и процесс заполнения заканчивается преждевременно. Вследствие этого в
клетках, инфицированных такими мутантами, присутствуют частично
заполненные головки и в высокой степени разветвленные неупакованные
ДНК-предшест- венники.
Упаковка ДНК фага Л - пример упаковки по механизму заполненной
головки
Двухцепочечная ДНК хромосомы фага Л содержит 48 502 п.н. и имеет
5'-концевые одноцепочечные липкие концы (сайты cos) из 12 нуклеотидов.
После инфицирования клеток концы хромосомы фага ковалентно
связываются, и происходит репликация по механизму катящегося кольца, т. е.
образование множества копий в составе длинной непрерывной молекулы
(конкатената). Упаковка ДНК в капсид происходит в одном направлении:
начиная с левого конца генетической карты в направлении правого конца. В
этом процессе участвуют кодируемая фагом терминала gpA, клеточный
фактор интеграции IHF и два сайта cos, которые фланкируют отрезок ДНК,
предназначенный для упаковки. Сайт cos содержит сайт одноцепочечного
разрыва во фрагменте длиной 16 п.н., включающем липкий конец длиной 12
45
п.н., и, кроме того, сайты связывания белков gpA и IHF, расположенные в
пределах фрагментов из 200 п.н. по обеим сторонам сайта cos. Упаковка ДНК
может быть инициирована с любого cos-сайта в конкатенате ДНК. При этом
терминала связывается одновременно с ДНК в сайте cos и с соединяющим
белком gpNul, который в свою очередь связывается с основанием капсида. Эта
многослойная конструкция приводит пустой капсид в близкое соседство с
сайтом, инициирующим упаковку. Далее протекает процесс укладки ДНК в
капсид, требующий затраты АТР. Укладка заканчивается на следующем сайте
cos с участием вновь белка gpA, который создает липкие концы путем
введения двух ступенчатых одноцепочечных разрывов на расстоянии 12 п.н.
один от другого. Конец, упакованный последним, остается вблизи основания
капсида и входит в полость внутри отростка после его присоединения. При
последующем инфицировании клетки- хозяина этот конец ДНК
впрыскивается первым.
Количество упакованной ДНК определяется как расстоянием между
двумя сайтами cos, так и объемом капсида. При естественных условиях это
количество точно соответствует одному геному фага Л. Отрезок ДНК между
двумя сайтами cos не обязательно должен происходить из фага А, но может
быть любого происхождения, не превышая лишь существенно по размерам
емкость капсида. Упаковка ДНК по механизму заполненной головки
обнаружена также и у других икосаэдрических фагов
Лизогения - альтернативный способ существования умеренных фагов
Умеренные бактериофаги способны интегрировать геном в хромосому
клетки-хозяина, не вступая в литический цикл развития. Некоторые
бактериофаги, например A, Р22, Р1, Р2 и Ми, обладают возможностью выбора
между двумя путями развития - по литическому циклу с лизированием клеткихозяина и выходом дочерних фаговых частиц, описанному выше, либо по пути
лизогении, при котором они на время как бы исчезают в клетке, подобно
безбилетному пассажиру на судне. В таком состоянии фаг называют
профагом. Кажущееся исчезновение фага с переходом в состояние профага
46
может быть обусловлено одним из двух молекулярных механизмов: 1) в
случае некоторых фагов (например, А), обладающих необходимыми
высокоспециализированными механизмами, ДНК включается в хромосому
хозяина, где она пассивно копируется в каждом цикле репликации хромосомы,
сохраняясь в клетках-хозяевах в течение неопределенно долгого периода
времени без образования вирионов и оставаясь незамеченной защитными
системами хозяина; 2) в случае других фагов (например, фага PI Е. coli)
фаговый геном превращается в низкокопийную плазмиду, которая
реплицируется с умеренной скоростью и остается под строгим контролем
клетки- хозяина. Поскольку и в том, и в другом из этих лизогенных состояний
данные фаги не повреждают клетки, их назвали умеренными фагами в отличие
от вирулентных фагов, которые неизбежно уничтожают клетку-хозяина.
Состояние лизогении относительно стабильно в клеточной культуре, так
как оно передается от лизогенных клеток их потомкам. Иногда, однако,
лизогенный путь развития прекращается и фаг переходит к развитию по
литическому пути. Тогда образуются дочерние фаговые частицы и клеткахозяин погибает в результате лизиса, при котором высвобождаются вирионыпотомки.
Пример второго типа лизогенизации Е. coli демонстрирует фаг Р1. Этот
фаг превращается в однокопийную плазмиду (одна копия на хромосому),
которая реплицируется синхронно с
хромосомой хозяина. После попадания в клетку линейная хромосома
фага Р1 замыкается в кольцо с помощью кодируемого фагом белка gpCre. Этот
фермент обычно обеспечивает сайт- специфичную рекомбинацию между
двумя сайтами 1охР, один из которых локализован среди генов линейной
карты и другой - в области концевой избыточности. Аналогичной /от-сгезависимой рекомбинацией обусловлен также распад плазмиды- конкатената
на мономерные геномы незадолго перед делением клетки-хозяина. В редких
случаях lox-cre-рекомбинация у фага Р1 служит для того, чтобы интегрировать
его геном в геном хозяина. Между сайтом фага 1охР и сайтом хозяина 1охВ,
47
имеющими сходные последовательности, происходит сайт-специфическая
рекомбинация.
Фаг Ми необычен тем, что соответствует транспозирующемуся
генетическому элементу, ДНК которого интегрируется практически в любой
участок хромосомы хозяина, используя независимый от гомологии механизм
транспозиции («незаконная рекомбинация»). Отсутствие селективности по
отношению к последовательности вызывает частую интеграцию в интактные
гены, которые таким образом инактивируются. Эта способность дала фагу его
название Ми (от mutator - вызывающий мутагенез).
Бактериофаг А как типичный пример умеренного фага
Впервые лизогения была описана в современных терминах А. Львовым,
работавшим в Институте Пастера в Париже, в конце 1940-х гг. Молекулярная
природа ее была раскрыта в работах, проведенных на фаге А и опероне lac Е.
coli. Эти исследования показали, что фенотипическое проявление шрансрецессивных мутаций генов с/, ell и сШ фага А (образование прозрачных
бляшек, отличающихся от мутных бляшек умеренного фага дикого типа)
связано с недостатком трех регуляторных белков. Напротив, цис-доминантные
мутации, свойственные фагу Avir (от virulent - вирулентный, т. е. неизменно
лизирующий клетки-хозяев с образованием прозрачных бляшек) были
интерпретированы как мутации промотора/оператора. Фаг Л и сейчас остается
широко используемой модельной системой для анализа процессов
дифференцировки, таких как необратимое переключение между литическим и
лизогенным вариантами развития. Кроме того, фаг Л используется как вектор
в генной инженерии.
В состав фага Л входит приблизительно равное количество белка и ДНК.
Одна линейная двухцепочечная молекула ДНК (48 502 п.н.) заключена в
икосаэдрическую головку, соединенную с длинным отростком (рис. 26.5, А).
Концы хромосомы у фага Л имеют специфическую форму, заканчиваясь
одноцепочечными З'-выступами длиной 12 нуклеотидов, которые называются
«липкими», поскольку могут прилипать друг к другу с образованием
48
замкнутого конца. Липкие концы образуются на поздних этапах цикла во
время упаковки, когда терминаза вырезает ДНК из конкатенатов путем
введения двух ступенчатых одноцепочечных разрезов на расстоянии 12
нуклеотидов один от другого. Эти липкие, или связующие (cohesive), концы
(cos-концы) важны для замыкания хромосомы в кольцо (циркуляризации)
вскоре после впрыскивания ДНК фага в клетку. Замыкание хромосомы в
кольцо имеет значение как для образования профага, так и для репликации
вегетативного фага при литическом цикле.
Генетическую карту фага Л можно изобразить тремя способами: в виде
линейной ДНК, ограниченной двумя последовательностями cos (в таком виде
она находится в фаговой головке); в виде кольцевой молекулы, ковалентно
замкнутой лигазой на сайтах cos в вегетативном фаге, и в линейной форме
интегрированного профага. Как и в случае других плазмид и фагов,
наблюдается отчетливая кластеризация генетических функций; она
соответствует этапам жизненного цикла фага (ранние и поздние функции).
Ранние функции включают активность регуляторных генов, важных для
противодействия защитным механизмам хозяина и выбора между литическим
и лизогенным путями развития, а также генов, участвующих в рекомбинации
(интеграция/исключение) и в репликации ДНК. Типичная точка начала
репликации расположена в пределах гена О. Она используется сначала для
медленной двунаправленной репликации
(0-механизм), но позднее переключается с помощью белков О и Р на
быструю репликацию по механизму катящегося кольца (сг-механизм), в
результате которой образуется конка- темерная ДНК, необходимая для
упаковки. Поздние функции связаны с генами SR (клеточный лизис) и A - J
(синтез белков головки, отростка и сборки фаговых частиц). Хотя поздние
гены выглядят на линейной карте разделенными на сайтах cos (и в таком виде
они находятся в головке), в сссДНК они непрерывны и совместно
транскрибируются с образованием единственной полицистронной мРНК с
промотора Рд. В геноме фага генов намного больше, чем представлено на рис.
49
26.16. Например, локус red соответствует трем генам, участвующим в
рекомбинации, локус Q - девяти генам. Поскольку многие из этих генов
факультативные, т. е. требуются в клетках только некоторых хозяев, здесь они
не рассматриваются. Другие области, называемые «молчащими», повидимому, не содержат никаких генов и, возможно, нужны только для того,
чтобы обеспечить заполнение головки во время упаковки. Молчащую ДНК
можно заменять искусственно другими генами, получая тем самым
разнообразные векторы для генной инженерии.
Интеграция генома бактериофага Л в бактериальную хромосому и его
исключение. При лизогении ДНК фага Л интегрирована в хромосому Е. coli.
Включение в геном клетки происходит с участием белка интеграции gplnt,
мономерного белка 40 кДа, и кодируемого клеткой-хозяином фактора
интеграции IHF - гетеродимера из субъединиц примерно одинаковых
размеров. Рекомбинация происходит между фаговым сайтом присоединения
attP и бактериальным сайтом присоединения attB. Эти сайты присоединения
различны по длине - 240 п.н. у Л и 23 п.н. у Е. coli, но содержат гомологичную
внутреннюю последовательность длиной 15 п.н. После связывания нескольких
копий gplnt и IHF в определенных участках в пределах сайтов attP и attB
образуется инта- сома - структура более высокого порядка, которая
обеспечивает точное выравнивание двух сайтов присоединения. Спаривание,
обмен и сшива ние четырех цепей опосредует белок gplnt внутри интасомы.
Небольшой белок IHF отвечает за связывание ДНК при образовании
интасомы. Интеграция протекает как двустадийный процесс, требующий
образования ступенчатых одноцепочечных разрезов в срединной области
сайтов присоединения на расстоянии 7 нуклеотидов друг от друга. Обмен
цепей начинается в левой точке разреза и продолжается через правую точку
разреза. Образующиеся рекомбинантные сайты присоединения названы attR и
attL соответственно.
Исключение генома фага из хромосомы хозяина после индукции
профага - это не просто процесс, обратный интеграции, поскольку
50
рекомбинантные сайты присоединения attR и attL в значительной степени
отличаются от первоначальных сайтов attP и attB (см. рис. 26.17, Б, В). Помимо
белков gplnt и IHF, участвующих и в интеграции, исключение фага зависит от
специального белка gpXis (8,6 кДа), кодируемого фагом. При субоптимальных
концентрациях gpXis вспомогательным белком может служить белок FIS Е.
coli.
При интеграции и исключении профага осуществляется особый тип
рекомбинации - локализованная рекомбинация, или рекомбинация по
Кэмпбеллу, названная так в честь исследователя A. Campbell, первым
описавшего ее точный механизм.
Лизогенные клетки-хозяева иммунны и могут быть индуцированы с
участием сложных регуляторных цепей
Интеграция хромосомы фага Л в клеточную хромосому обеспечивает
пассивную репликацию генома фага в каждом цикле деления клетки. При этом
экспрессируется (с использованием РНК-полимеразы хозяина) только один
фаговый ген, а именно с/, который кодирует репрессор gpCI, или CI.
Транскрипция происходит с единственного промотора РRM (от promoter
repressor maintenance - промотор поддержания репрессора) и останавливается
на терминаторе (t), расположенном ниже оперона с/. Белок CI выполняет
двойную роль - репрессирует два основных промотора, Рд И РД, фага Л и
активирует промотор РRM в ауторегуляторном процессе, т. е., следовательно,
свой собственный синтез (см. рис. 18.10 и 26.18, А). В лизогенной клетке
имеется примерно 200 молекул репрессора CI. Если в такую клетку проникает
другой фаг Л (суперинфекция), он немедленно репрессируется свободным
белком CI. Это состояние называют иммунностью (или, точнее,
гомоиммунностью) лизогенных клеток. Подобная иммунность
распространяется и на A-подобные, или лямбдоидные, фаги, в том случае если
они чувствительны к белку CI фага А («гетероиммунность»). Мутантные фаги
А, лишенные CI, не способны к лизогении и образуют не мутные бляшки, а
прозрачные, как вирулентные фаги (отсюда — Ад, от clear - прозрачный). При
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]