Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
51
суперинфекции лизогенной клетки, несущей фаг дикого типа Е. coli (А+),
присутствующий в избытке репрессор подавляет внедрившийся мутант Ас],
чем объясняется транс-рецессивный фенотип Aci в сравнении с А+-фагами.
Профаг А способен подвергаться индукции, т. е. при некоторых
внешних воздействиях может вступать в литический цикл развития.
Индукцию вызывают повреждающие ДНК агенты, такие как УФ-излучение
либо канцерогенные и мутагенные вещества. Подобные воздействия приводят
к возникновению разрывов ДНК и активируют протеазы хозяина, связанные с
SOS-pe- парацией. Эти протеазы гидролизуют связанные с ДНК белки, в том
числе белок CI, и таким образом вызывают индукцию профага. Ранние,
задержанно-ранние и поздние белки с литическими функциями фага А
экспрессируются в основном с двух промоторов - PL (левый) и Рд (правый), с
которых транскрипция происходит в противоположных направлениях (рис.
26.18, Б). Гидролитическое расщепление CI приводит к дерепрессии
операторов Ощ2,з и О/пдд. Кроме воздействий на ДНК, индукцию вызывает
скрещивание лизогенного Hfr-донора с нелизогенным реципиентом, в клетках
которого соответственно отсутствует CI. Этот процесс, называемый зиготной
индукцией, обычно приводит к гибели клеток- реципиентов.
Литический путь развития фагов связан с временной экспрессией очень
крупных оперонов. Транскрипции их должны препятствовать сигналы
преждевременного внутриоперонного терминатора (Ti), предназначенные в
норме для целей временной и модульной экспрессии этих генов.
Следовательно, для транскрипции соответствующих цистронов требуется
участие механизмов антитерминации. Один такой механизм основан на
действии фагоспецифичных PH К-полимер аз, не распознающих Тд
Лямбдоидные фаги обладают иными механизмами. У этих фагов оба оперона, Рд и Рд, содержат несколько терминаторов.
52
Рисунок 12 - Три механизма развития фага Л. A. В лизогенной клетке-
хозяине фаг Л экспрессирует на низком уровне репрессор CI,
обеспечивающий подавление всех остальных фаговых генов и иммунность
клетки к суперинфекции Л- или лямбдоидными фагами.Б. Если вследствие
повреждения ДНК происходит расщепление белка CI (индукция), начинается
транскрипция фаговых генов одновременно с левостороннего промотора Рд и
правостороннего промотора Рд. Вначале синтезируются немедленно-ранние
белки N и Сго и с их помощью задержанно-ранние белки (по ходу
транскрипции до Xis и Q). Это вызывает исключение профага из хромосомы
и индуцирует синтез всех поздних белков, участвующих в сборке фага, и
лизис клетки. B. Немедленно-ранние и задержанно-ранние белки
синтезируются сразу после инфицирования клетки и в начале периода
выбора пути развития после индукции высоком значении m.o.i (> 5,0) и в
голодающих клетках (с высоким уровнем сАМР) синтезируется активатор
СП, вызывающий вначале интенсивный синтез репрессора CI и затем
интеграцию ДНК фага в хромосому с помощью интегразы Int. Впоследствии
СИ инактивируется в результате того, что О подавляет его дальнейший
синтез, и уровень CI падает до уровня поддержания; профаг сохраняется в
клетке как стабильно интегрированный в ее геном. При нормальном уровне
питательных веществ в среде внутриклеточная концентрация сАМР низкая,
содержание СП никогда не повышается вследствие присущей этому белку
нестабильности и как доминантный синтезируется белок Сго, а не О; в
результате этого развитие фага идет по литическому пути. Пунктирными
стрелками показана репрессия (@) или активация (©); промоторы,
выделенные полужирным, активны во время специфической фазы; важные
регуляторные гены отмечены серым.
53
Дополнительные объяснения см. в тексте. При (Тд/Тд), расположенных
в разных сайтах. Кодируемый фагом белок N, продукт первого цистрона,
транскрибированного с Рд, способствует преодолению РНК-полимеразой
хозяина влияния терминаторов Тдх и Тдх/Тд2 в обоих оперонах и
распространению транскрипции на ни- жерасположенные гены. Поскольку в
отсутствие белка N транскрипция останавливается на Ты и Тдх, этот
антитерминатор выполняет основную роль во временной регуляции
экспрессии фаговых генов. Известно об участии в этом процессе дисактивного сайта nut, белков клетки-хозяина NusA, NusB и RpsJ (синоним S10
или NusE) и антитерминатора Rho (NusD).
Наиболее ранние гены N и его транскрибируются с промоторов Рд и Рд
соответственно, как и задержанно-ранние гены. Белок Сго можно
рассматривать как анти-(С1)-репрессор. Как и CI (см. разд. 18.6), он
связывается с операторами Од и Од, но с противоположным сродством, т. е.
наибольшим в отношении Одз (Одз) и наименьшим к Од1 (Оы). Таким
образом, белок Сго, особенно в высокой концентрации, непосредственно
препятствует связыванию присутствующих в индуцированной клетке молекул
репрессора CI с промоторами Од и Од и косвенно - положительной,
осуществляемой CI ауторегуляции транскрипции гена CI с Рдм-
Преодолевая с помощью белка N влияние Тдх, РНК-полимераза
транскрибирует в левом направлении полицистронную мРНК, включающую
транскрипт гена int. Поскольку транскрипция с Рд нечувствительна к
нормальным сигналам терминации, она продолжается до области,
обозначаемой sib. Однако синтеза белка Int не происходит, так как участок sib
в Рд-мРНК является сайтом расщепления РНКазой III. В результате
расщепления З'-конец мРНК int становится подверженным деградации
другими РНК-азами. Поскольку экспрессию int регулирует сайт,
расположенный ниже, этот процесс называют ретрорегуляцией. Задержанноранний продукт Xis, однако, стимулирует исключение профага.
54
Преодолевая с участием белка N влияние Тдх и Тд2, РНК-полимераза
транскрибирует в правом направлении гены О, Р и Q. Это активирует точку
начала репликации фага Л (оп), с которой связываются белки О и Р плюс белки
хозяина, участвующие также в нормальной репликации; с этой точки
начинается медленная двунаправленная репликация ДНК. После синтеза
нескольких копий фагового генома репликация переключается (посредством
катализируемых белком Red процессов рекомбинации) на быструю
однонаправленную репликацию по механизму катящегося кольца с
образованием необходимой для упаковки конкатемерной ДНК. Фаг Л
обладает только одним поздним промотором, с которого транскрибируется
весь набор из 28 поздних генов. Вначале, однако, транскрипция
останавливается на терминаторе Тдз. Преодолению действия Тдз и всех
последующих сигналов терминации во всем позднем опероне способствует
второй антитерми- наторный белок - Q (задержанно-ранний продукт оперона
Рд). Вместе с NusA белок Q действует посредством связывания с ДНК-сайтом
gut и путем прямой модификации РНК-полимеразы. Поздние белки SR
образуют эндолизин, участвующий в контролируемом лизисе клетки-хозяина
в конце латентной фазы; гены A - J кодируют белки капсида фага и сборку
(морфопоэз) зрелых фаговых частиц.
Генетическая регуляция включения хромосомы фага А в хромосому
клетки-хозяина. Немедленно после инфицирования хромосома фага А
образует ковалентно замкнутое кольцо и начинается транскрипция наиболее
ранних генов N и его с использованием РНК-полимеразы хозяина. Белок N
устраняет влияние терминаторов Тдх и TL1, обеспечивая возможность
транскрипции задержанно-раннего гена сШ (с промотора Рд) и генов сЯ, О, Р
и Q (с промотора Рд). На этом этапе происходит выбор между лизогенным и
литическим путями развития (то же обнаружено в случае индуцированных
профагов). Механизм переключения, обеспечивающий этот выбор, включает
участие всех упомянутых молекул, кроме CI, Int и Xis. Поскольку успех или
неудача размножения фага непосредственным образом зависит от
55
обеспечения энергией клетки-хозяина, это переключение предположительно
связано с физиологическим состоянием клетки посредством хозяинспецифичных факторов и тем самым с внешними условиями. По существу,
механизм переключения работает, позволяя образоваться CI в случае
лизогении, когда не синтезируются Сго и Xis, и позволяя синтезироваться Сго
(и Xis) в случае литического пути, когда «выключено» образование CI (рис.
26.18, В). При высокой m.o.i. и голодании (т. е. при высоком уровне с АМР)
развитие происходит по пути лизогении. Пере ключение пути развития
обусловлено сбалансированным взаимодействием между активирующими и
репрессирующими регуляторными белками; а также взаимовлиянием фагоспецифичных и хозяин(среда)-специфичных факторов. В фазе выбора важную
роль выполняют несколько белков (СП, СШ, а также факторы IHF и НА
клетки-хозяина) и промоторы Рj (for integration, для интеграции) и РRE (for
repressor establishment, для синтеза репрессора). Белок СП активирует Р RE И
транскрипцию до терминатора, расположенного непосредственно ниже
локуса с/. Это способствует быстрому синтезу CI и, соответственно, репрессии
промоторов PI/PR С последующим синтезом РНК —продукта гена его. Это
антисмысловая РНК, способствующая (через CI) репрессии промотора Рд и в
результате синтезу литических белков Сго, О, Р и Q и всех поздних белков.
Активатор СП, как лабильный белок, быстро разрушается протеазами хозяина
с участием фактора НАА (от high frequency of lisogenization by phage Л высокая частота лизогенизации фагом А). Комплекс СП и СШ, по-видимому,
устойчив к HflA-зависимой деградации и, кроме того, уровень СП
стабилизируется при высокой внутриклеточной концентрации с АМР
(имеющей место, например, в условиях углеродного голодания). Поскольку
PRE представляет собой высокоэффективный промотор (в семь раз более
эффективный, чем РRM)I концентрация CI быстро повышается в присутствии
СП, что вызывает усиление репрессии синтеза Сго, СП и СШ. Белок СП как
лабильный постепенно исчезает, и промотор Рде инактивируется. Тем
временем, однако, концентрация CI становится достаточно высокой, чтобы
56
активировать Р RM - промотор для поддержания репрессора (рис. 26.18, А). В
процессе этого с участием CI активируется Р/. Поскольку Р/ перекрывается с
геном xis, белок Xis не синтезируется с соответствующей мРНК. Транскрипт
Р/ заканчивается на терминаторе t/ и не содержит сайта расщепления РНКазой
III, характерного для транскрипта Рд (см. разд. 26.4.4). Таким образом, с
транскрипта Р/ эффективно, но недолго синтезируется белок Int,
способствующий интеграции профага в хромосому хозяина с помощью
другого белка хозяина, IHF (от integration host factor - фактор интеграции
хозяина).
Фаги служат важным инструментом генетических исследований
Фаги способны переносить гены своих хозяев
Большинство фагов способно переносить чужеродную ДНК от одного
хозяина другому. Как описано выше, фаги упаковывают свою
синтезированную в виде длинных конкатенатов ДНК, начиная с
фагоспецифичной последовательности рас. Если геном хозяина содержит
аналогичные или идентичные последовательности, упаковка иногда может
ошибочно начаться с одной из этих последовательностей и тогда в фаговую
частицу оказывается заключенным фрагмент ДНК хозяина. Такое событие
происходит довольно редко, и обычно только несколько фагов в популяции
несут ДНК хозяина. Эти фаги называют трансдуцирующими, поскольку они
переносят ДНК от своего прежнего хозяина в другую клетку. Подробно
изучена способность умеренных фагов Р22 и Р1 переносить почти любой
фрагмент ДНК от Salmonella typhimurium и Escherichia coli соответственно
(общая трансдукция). Вирулентные фаги, такие как Т1 и Т4, в благоприятных
селективных условиях также способны к общей трансдукции. Фаг А служит
типичным примером специализированных трансдуцирующих фагов,
поскольку может нести участок ДНК, находившийся в непосредственной
близости от сайта интеграции attB (специализированная трансдукция).
Присутствуя в клетке-хозяине в форме профага, фаг А при индукции способен
исключаться из хромосомы. Процесс вырезания протекает не всегда точно и
57
иногда ДНК может быть разрезана далеко от сайта интеграции. По причине
того, что капсид фага не может вместить ДНК больше, чем в количестве,
эквивалентном одному фаговому геному, неверное разрезание вызывает
равноценную потерю фаговой ДНК и генов на другом конце генома. Этим
объясняется тот факт, что трансдуцирующие фаги Л обычно дефицитны и им
требуется хелперный фаг (фаг-помощник) для размножения в следующей
инфицируемой клетке. Нормальный сайт интеграции фага А локализован
вблизи генов gal Е. coli, и большинство транс- дуцирующих фагов А несет
часть или все гены gal. Это свойство делает фаг А специализированным
трансдуцирующим фагом. Однако в случае мутации нормального сайта
включения attB (например, делеции) фаг А может интегрироваться в сайтах
включения «второго выбора» и при этом образуются трансдуцирующие фаги,
специализированные в отношении других генов.
Трансдукцию легко обнаружить с помощью генетических маркеров,
переносимых из донорной клетки в клетку-реципиент, где они становятся
стабильно включенными в геном в результате гомологичной рекомбинации.
Фаги способствуют возникновению новых генотипов вследствие
генетической рекомбинации
Обмен генетическим материалом между хромосомами организмов
одних и тех же или, иногда, даже различных видов - горизонтальный перенос
генов - относится к распространенным природным феноменам. Для изучения
различных механизмов генетической рекомбинации используются
разнообразные экспериментальные системы. Бактериофаги как легко
воспроизводимые в эксперименте объекты позволяют исследовать
генетическую рекомбинацию на всех уровнях.
Обмен генетическим материалом может происходить между
интактными гомологичными хромосомами, между их участками или между
более длинными (>200 п.н.) гомологичными последовательностями в составе
одной и той же хромосомы. Эти события называют внутримолекулярной или
межмолекулярной гомологичной рекомбинацией либо общей рекомбинацией.
58
Последнее название было выбрано, чтобы отличать эти события от сайтспецифической рекомбинации (описанной в этой главе для фага А),
ограниченной определенными короткими последовательностями или
участками локализации. Эти последовательности также имеют короткие
области гомологии, что отличает их от сайтов незаконной рекомбинации и
транспозиции.
Два последних события могут вовлекать участки, не имеющие
гомологии, и, таким образом, происходить практически в любом сайте в
пределах хромосомы, как описано для фага Ми.
Многие фаги обладают одной или несколькими из этих систем
рекомбинации. У некоторых фагов, например Т4 и А (в состоянии профага),
размножение даже зависит от стадий рекомбинации как этапов нормального
цикла развития. В то же время у других фагов, например фага Ми, обнаружены
высокоспециализированные сайт-специфичные системы рекомбинации,
которые не требуются для нормального роста (их мутации не влияют на
размножение фага).
На противоположных концах гипотетической шкалы, отражающей
различия между фагами по механизму рекомбинации, находятся фаги,
самостоятельно продуцирующие все необходимые для рекомбинации
ферменты, и фаги, не образующие ферментов для рекомбинации и полностью
зависящие от доступных им систем рекомбинации хозяина. Исходя из
здравого смысла, можно ожидать, что крупные фаги, геномы которых
способны вмещать гены «роскоши», обладают более сложными механизмами
рекомбинации по сравнению с мелкими фагами. Действительно, фаг Т4 (165
т.п.н.) обладает полной системой гомологичной рекомбинации. В
эффективном обмене ДНК, необходимом для развития фага Т4, участвуют
белки UvsX (Rec-A-подобный переносящий цепи белок), UvsY (фактор,
вспомогательный по отношению к UvsX), gp32 (белок, связывающий
одноцепочечную ДНК), gp46 и gp47 (регуляторы активности экзонуклеазы),
gp30 (ДНК-лигаза), gp43 (ДНК-полимераза), gp49 (резольваза структур
59
Холлидея) и ряд других белков. Быстрая репликация фага Т4 основана на
своевременном и непрерывном образовании дополнительных стартовых
сайтов, называемых вторичными точками начала репликации. Его
обеспечивает рекомбинация между гомологичными последовательностями.
Перенос цепи белком UvsX с участием вспомогательных белков позволяет
осуществлять синтез ДНК, начиная с З'-ОН-концов в смещенных петлях.
Непрерывно продолжающиеся циклы рекомбинации и репликации ДНК
приводят к образованию высокоразветвленных, конкатенированных
промежуточных продуктов репликации, которые служат материалом для
упаковки ДНК в капсиды по механизму заполненной головки после удаления
всех боковых ветвей.
Фаг Л (50 т.п.н.) кодирует две системы рекомбинации: 1) Int-систему для
рекомбинации при интеграции/исключении (ее компоненты описаны в разд.
26.4.3) и 2) геосистему для гомологичной рекомбинации, в которую входят
белки gpGam (белки защиты от RecDCD-экзонуклеазы Е. coli), gpExo (5'—>3'дцЦНК-специфичная экзонуклеаза) и gpb (фактор ренатурации
комплементарной опДНК и связывания с gpExo). Обе эти системы
рекомбинации зависят также от дополнительных белков хозяина.
Фаг Т7 (40 т.п.н.) обладает почти полным набором белков, участвующих
в общей рекомбинации. Однако в отличие от того, что известно для фага Т4,
они не служат важными компонентами в механизме ранней репликации. Тем
не менее эта система необходима для обеспечения полной репликации и
упаковки, поскольку обеспечивает образование конкатенированной ДНК.
Данная система рекомбинации включает эндонуклеолитическую активность,
обеспечивающую разрешение структур Холлидея (белок gp3), и ATPзависимую 5'-специфичную дпДНК-эндо- нуклеазу (белок gp6). Белок переносчик цепи в этом случае не выявлен, и фаг Т7 в данном отношении
полностью зависит от белка RecA из Е. coli.
Фаг Ми (37 т.п.н.) имеет сайт-специфичную систему инверсии и еще два
механизма для интеграционной рекомбинации по типу незаконной
60
рекомбинации. Они позволяют геному фага Ми либо включаться без
репликации в любой участок генома хозяина, либо реплицироваться как
транспозон, распространяясь путем копирования с оригинала, который
остается в сайте интеграции.
Система инверсии фага Ми зависит от кодируемого фагом фермента Gin
и служит для инверсии участка ДНК, локализованного перед промотором,
контролирующим экспрессию белка отростка. Инверсия происходит точным
образом, без потери или приобретения нуклеотидов. Информация для синтеза
белка считывается в прямом или обратном направлении с промотора,
расположенного вне инвертируемого сегмента. Каждый белок, образованный
таким образом, детерминирует специфический круг хозяев. Аналогичная
система инверсии обнаружена также у фага Р1. Здесь инверсия зависит от
кодируемого Р1 белка gpCin. Для максимальной активности инверсии
требуются также белки HU и Fis из Е. coli. При оптимальных условиях
переключение в процессе развития фага может привести к образованию в
одном потомстве популяций, в которых примерно 50% фагов специфично к
одному кругу хозяев и 50% - к другому.
Фаги М13 и с/Х174, содержащие геном всего из нескольких тысяч пар
нуклеотидов и лишь небольшое число генов, не экспрессируют каких- либо
белков для рекомбинации и полностью зависят от рекомбинационных
функций клетки-хозяина.
Фаги служат мощным инструментом генных технологий. Подробное
изучение развития фагов позволило не только выяснить разнообразные
молекулярные механизмы биологических процессов, но также разработать
новые эффективные методы генной инженерии. Открытие феноменов
рестрикции и модификации, например, было сделано У. Арбером (Arber) при
изучении фагов Р1 и Л. Это стало началом обнаружения сотен ферментов
рестрикции, которые сегодня широко используются как инструменты в
экспериментальной молекулярной биологии и генной инженерии, в основном
для разрезания ДНК на определенные фрагменты. С их помощью, кроме того,
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]