Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
141
бактерий.
Аналогичный подход был применен Neufeldс коллегами (2003), которые
использовали бактериофага в качестве специфического литического агента
для детекции цитоплазматического маркерного белка (в данном случае уЗгалактозидазы) в сочетании с амперометрической детекцией. Этот метод
является собственно кондуктометрическим анализом, но использует
специальный биосенсор для детекции конечного продукта энзиматического
превращения искусственного субстрата уЗ-галактозидазы р-аминофенил уЗгалактопиранозида (PAPG) в р-аминофенол (PAP). С помощью этого метода
они могли детектировать присутствие 1 КОЕ Е. coli/100 мл в течение менее
чем 8 ч. Еще один вариант этой идеи был использован Takikawaс коллегами
(2002). В этой работе за отсутствием подходящего природного
внутриклеточного маркера клетки Enterobactercloacaeтрансформировали
репортерной конструкцией с геном хитиназы. Выделение фермента из
фагочувствительных клеток обнаруживалось в течение 30 минут с помощью
спектрофотометрического мониторинга гидролиза хитиназой 4метилумбеллиферона. Этот метод был предложен для прослеживания судьбы
клеток, освобождаемых в окружающую среду в ходе экспериментов по
экологии бактерий.
ПРИМЕНЕНИЕ ФАГОВ И ИХ КОМПОНЕНТОВ КАК СПЕЦИФИЧЕСКИ
СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ РЕАГЕНТОВ
По мере развития знаний о структуре и функциях бактериофагов
предлагается все большее число вариантов использования фаговых частиц и
белков фагов для детекции патогенов. В процессе эволюции фаги выработали
способность специфически распознавать и связываться с различными
структурами на поверхности бактериальной клетки, и эти взаимодействия
могут быть использованы для создания новых реагентов с требуемыми
характеристиками связывания. В простейшем варианте этого подхода фаг
SalmonellaFelix01 (также известный как фаг Sapphire) был использован в
качестве биосорбента для селективного отделения клеток его хозяина от
142
других родственных ему микроорганизмов, присутствовавших в суспензии
(Bennettetal., 1997). Фаг Felix01 был иммобилизован за счет пассивной
адсорбции на полистироловых поверхностях (тест-полосок или
иммунологических микропланшетов). Полученные таким образом
биосорбенты погружали в культуры Salmonellaи после отмывания
неспецифически связанных клеток присутствие клеток Salmonellaна
поверхности обнаруживали либо прямой флуоресцентной микроскопией, либо
косвенно, с помощью ПЦР. В обоих случаях наблюдалось специфическое
связывание клеток сальмонелл, и в варианте с иммунологическим планшетом
сальмонелл можно было селективно концентрировать в присутствии такого же
количества конкурирующих клеток других энтеробактерий. Штаммы
Salmonella,нечувствительные к данному фагу, не связывались с биосорбентом.
Один из таких штаммов синтезирует неполные молекулы ЛПС; это
косвенно подтверждает заключение, что специфичность данного анализа
связана с взаимодействием фага и бактерий и что ЛПС составляет важную
часть рецептора фага Felix01. С накоплением детальных знаний о механизмах
взаимодействия фагов и молекул на поверхности бактериальных клеток
появляется возможность использовать рекомбинантные белки бактериофагов
для создания связывающихся белков или белковых комплексов с
необходимыми свойствами. Один из таких белков - фрагмент хвостовой
фибриллы фага Т4 - используется в коммерчески доступном продукте
(ЕпёоТгар).Этот белок специфически связывается с высококонсервативным
компонентом ЛПС грамотрицательных бактерий. Хроматографические
колонки с ковалентно иммобилизованным на агарозе белком фибрилл фага Т4
успешно применяются для удаления эндотоксинов из различных
биологических и медицинских препаратов^ Новые возможности,
предоставляемые специфически связывающимися белками, были также
обнаружены в ходе исследований фаговых эндолизинов. Эндо- лизины,
которые разрушают клеточную стенку бактерий в конце цикла размножения
фага. Помимо энзиматически активного участка эти белки содержат домены,
143
специфически связывающиеся с определенными сайтами на бактериальной
клеточной стенке. Эти связывающиеся с клеточной стенкой домены
(cellwallbindingdomains; CBD) опосредуют прочное (но нековаленое) и
чрезвычайно специфическое связывание этих ферментов с их субстратом
(Loessneretal., 2002). Необыкновенная специфичность и высокая аффинность
этих полипептидов делают их отличными инструментами для декорирования
соответствующих клеток флуоресцентно-меченными молекулами CBD
(Loessneretal., 2002) и могут также быть использованы для их (клеток)
иммобилизации. Парамагнитные частицы, покрытые антилистерийными
молекулами CBD, оказались очень эффективным средством для выделения и
концентрирования клеток листерий из образцов пищевых продуктов; в
модельных опытах их выход достигал 90% даже из разбавленных суспензий в
присутствии посторонней бактериальной флоры
(JanKretzerandMartinLoessner, неопубликованные данные).
144
КОНТРОЛЬ НАД БАКТЕРИОФАГАМИ В ПИЩЕВОЙ
ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Неспорулирующие, грамположительные микроорганизмы, известные
как молочнокислые бактерии (LAB), используются в производстве йогуртов и
различных сыров. LABвключают представителей различных бактериальных
родов и видов; например, Lactococcuslactis, Lactobacillussp., Leukonostocsp.и
Streptococcusthermophilus.Масштабная ферментация молока обычно
начинается после добавления тщательно отобранных культур, содержащих
смесь из нескольких LABштаммов в концентрации 107 клеток на мл молока
(Moineauetal., 2002). Эти промышленные процессы могут быть нарушены
вирулентными бактериофагами, вездесущими на молочных производствах;
они лизируют LAB, задерживая процесс образования молочной кислоты или
вовсе прекращая брожение.
Обычно проблемы с ферментацией молока возникают, когда титр фагов
превышает критическую отметку в 104 б.о.е./мл. Если титр выше 105-106 б.о.е./
мл, сбой ферментации - наиболее вероятный результат. Молоко с
добавленным стартером не свернется, и желаемые свойства продукта будут
изменены или полностью потеряны. В этом случае производственная линия
должна быть остановлена и тщательно очищена, чтобы уничтожить фага.
Следует отметить, что в других биотехнологических производствах
допустимые уровни контаминации фагом из-за возможного нарушения
процесса и изменения свойств продукта не устанавливаются (G. Bogosian,
неопубликованные данные). Молочные вирулентные фаги могут
распространяться очень быстро (они имеют латентный период около 30 минут
и выход фага 100 частиц на клетку) в производственной среде молочного
предприятия. Их экспоненциальный рост служит причиной еще большего
беспокойства на таких производствах, как сыроварение, где бактерии должны
размножаться в течение нескольких поколений. Исходя из опыта авторов, от
0,1% до 10% ферментаций на любом молочном заводе может быть подвержено
145
отрицательному действию фагов.
Вирулентные фаги могут размножаться очень быстро; поэтому при
осуществлении любого производственного процесса, зависящего от бактерий,
необходим постоянный мониторинг. Присутствие вирулентных фагов в
молочных образцах обычно обнаруживается традиционным
микробиологическим методом анализа образования бляшек. Даже если
стартовые культуры представляют собой смеси штаммов, этот анализ должен
производиться раздельно, с использованием чистых культур, когда это
возможно. Наличие бляшек в посевах различных разведений образцов
подтверждает присутствие фага. Тем не менее, необходимо помнить, что
бляшки некоторых фагов трудно обнаружить на бактериальном газоне. В
таких случаях увеличение или уменьшение инкубационной температуры,
изменение множественности инфекции, добавление ко-факторов (например,
Са2+или Mg2+) или добавление повреждающих бактериальную стенку агентов*
(например, 0,25% глицин) может увеличить размер бляшки (Lillehaug, 1997).
Если надежный метод бляшкообразования по каким-то причинам
оказывается неприменим, можно использовать тесты, оценивающие
метаболическую активность бактерий. Одним из самых распространенных
анализов является тест молочной активности. В две пробирки, содержащие по
10 мл молока, вносят аликвоты (1 мл) стартовых культур. В одну пробирку
также добавляется (2% от общего объема) пропущенный через фильтр с
диметром пор 0,45 щп образец, исследуемый на присутствие фагов. После
инкубации (температура и время зависят от стартера и процесса) измеряется
pH молока. Если pH молока в тестовой пробирке на 0,2 единицы выше, чем в
контрольной (что отражает сниженную продукцию молочной кислоты),
вероятно инфицирование фагами. Чтобы избежать прямого измерения pH, в
молоко можно добавить индикатор, например бромкрезоловый синий (100
pg/ml). Если pH молока падает ниже 5,4, цвет индикатора меняется на желтый.
Таким образом, если во время инкубации цвет не меняется, это означает
присутствие агента (например, фага), который влияет на продукцию молочной
146
кислоты в зараженном молоке. Если за день необходимо исследовать много
образцов, использование pH-индикатора особенно полезно для упрощенного
анализа, позволяющего одновременно тестировать множество образцов,
например в 96-луночной плашке.
Другой подход для детекции бактериофагов в молочных продуктах - это
применение иммунохимического анализа, например ELISA. Метод
ELISAиспользует антитела к специфичным фаговым структурным белкам и
обычно довольно специфичен; таким образом, хотя этот тип анализа возможен
для детекции специфичных фагов, он может не обнаружить фагов, имеющих
иные структурные белки. Кроме того, чувствительность ELISAчасто
недостаточна для обнаружения фагов в молочном производстве
(ChibaniAzaiezet. al., 1998; Moineauetal., 1993). Доступность полных геномных
последовательностей фагов позволила более активно применять
молекулярные методы, например ПЦР и ДНК-гибридизацию, для быстрого
обнаружения фагов (LabrieandMoineau, 2000; Moineauetal., 1992). Таким
образом, выбор метода детекции фагов зависит от нескольких факторов,
включая возможности лаборатории и необходимую чувствительность
определения. Несмотря на ограниченный интерес исследователей к изучению
бактериофагов на большинстве производств, дополнительная информация об
обнаруженных фагах может быть получена электронно-микроскопическими
исследованиями, определением спектра хозяев, белковых профилей и
рестрикционным анализом генома.
После подтверждения присутствия фага необходимо определить
источник заражения. Это естественная биологическая угроза может быть
эндогенной (например, профаг) или экзогенной (фаги, присутствующие в
субстрате или в окружающей среде). Использование лизогенных штаммов
редко допускается в любых отраслях, так как профаг может быть индуцирован
производственными условиями. Более того, последовательное пассирование
лизогенного штамма может привести к возникновению вирулентного мутанта
фага (BruttinandBrus- sow, 1996). Соответственно, для того чтобы исключить
147
штаммы, содержащие индуцибельные профаги, программы выбора
бактериальных штаммов должны включать анализ на лизогению. В работах по
секвенированию генома обнаружено, что профаги присутствуют в избытке во
многих бактериальных видах (Canchayaetal., 2003). Хотя присутствие
профагов может быть, по крайней мере в теории, выгодным для защиты
бактерий от близкородственных фагов или для осуществления их
периодического лизиса (например, при созревании сыра), польза от этого
иммунитета к суперинфекции ограничена естественным разнообразием
фаговых популяций.
В молочной промышленности наиболее вероятными источниками
вирулентных фагов являются сырье и производственное оборудование
(McIntyreetal., 1991). На самом деле большинство процессов молочнокислого
брожения подвержено фаговой инфекции из-за того, что сырое молоко
естественно содержит литических фагов, хотя и в низких титрах (между 10' и
104 б.о.е/мл).
Различают два основных типа экологических ситуаций в промышленном
молочном производстве: условия на сыроваренном и йогуртовом
производствах. Молоко для производства йогуртов проходит обработку при
90°С, которая обычно убивает всех бактериофагов (Quiberonietal., 1999); в
сырном производстве используется сырое и пастеризованное молоко, в
котором многие фаги сохраняют жизнеспособность (Chopin, 1980). Кроме
того, если производство йогуртов - это сравнительно асептический процесс и
готовый продукт минимально выдерживается в заводских условиях, сырные
заводы ежедневно переживают аэрозольную контаминацию в процессе
отделения сыворотки в открытых чанах (Budde-Niekieletal., 1985). Тем не
менее, хотя присутствие фагов не всегда обнаруживается в ходе йогуртового
производства, этого достаточно, чтобы сделать фагов главным источником
проблем ферментации в этом процессе. Проблема обычно обнаруживается
сама, в виде задержки брожения или изменения продукта, или порой в полной
потере продукта. Напротив, потенциальные проблемы, которые могут
148
возникнуть в процессах ферментации на сырных заводах, случаются из-за
постоянного присутствия фагов в молоке. Разнообразие фагов в молоке,
используемом при производстве кисломолочных продуктов, вероятно,
появляется из-за того, что молоко является смесью, полученной с разных
ферм, каждая со своими порядками в ведении сельского хозяйства. Более того,
жидкая природа молока и побочных продуктов ферментации (например,
сыворотка) обеспечивает хорошее рассеивание фагов в субстрате. Для
сравнения: в сыре фаги обычно ограничены в перемещении и локализованы.
Также если продолжительно используются одни и те же стартерные культуры,
они могут служить хозяевами для накопления фагов (Boucherand Moineau,
2001). Поэтому источник фаговой контаминации будет определять
подходящие стратегии контроля фагов.
Стратегии контроля фагов
Фаги вездесущи в молочном производстве; таким образом, в течение
нескольких последних десятилетий были предприняты значительные попытки
создания методов скорее для контроля фаговой пролиферации, чем для ее
искоренения (Moineau, 1999). Успех контроля над пролиферацией фагов
зависит от разработки и исполнения различных практических приемов как на
уровне производства, так и на уровне лаборатории.
Доступные методы контроля фагов в производственных зданиях зависят
главным образом от степени риска и возможных источников фагового
заражения, а также от используемого производственного процесса, как это
было описано выше для йогуртовой и сырной промышленности. Эти стратегии
включают в себя соответствующую гигиену на заводе, адаптированный план
завода, регулярную очистку и дезинфекцию оборудования и одежды и
соответствующую вентиляцию. Необходимо избегать перекрестной
контаминации между средой ферментации, побочными продуктами
производства и заводским оборудованием. Гипохлорит натрия и перуксусная
кислота должны использоваться при очистке и дезинфекции, потому что они
быстро элиминируют фаговые частицы (BinettiandReinheimer, 2000).
149
Фаги также обычно чувствительны к кислым (pH 4 и ниже) и щелочным
(pH11 и выше) условиям (Adams, 1959). Воздух должен фильтроваться, и
эффективность воздушных фильтров должна регулярно проверяться, потому
что фаговая инфекция может распространяться аэрогенным путем. Фаги были
обнаружены в воздухе (105 б.о.е./м3) молочных заводов (Neveetal., 1994).
Таким образом, чтобы предупредить контаминацию фагами из окружающей
среды, пусковые бактериальные культуры должны быть приготовлены в
комнатах с положительным давлением. Вдобавок персонал должен быть
осведомлен о важности процедур по предотвращению фаговой инфекции и
обучен их применению. Другие меры по контролю фагов допустимы на уровне
завода, и они будут различаться согласно типу и размерам производственных
возможностей (например, возможности йогуртовой промышленности обычно
меньше, чем таковые в сырной). Эти и другие методы были описаны
Champagneи Moineau(1998).
Использование эффективных бактериальных стартерных культур важно
для получения качественных продуктов. Выбор штамма - это длительный и
дорогостоящий процесс, основанный на микробиологических, биохимических
и технических критериях (Moineau, 1999). Природа этих критериев будет
зависеть главным образом от продукта. Всегда, когда возможно, смесь двух
или трех хорошо охарактеризованных бактериальных штаммов должна быть
использована для предотвращения возможной фаговой инфекции всей
стартерной культуры и срывов ферментации. В данных обстоятельствах одна
из успешных стратегий, которая широко применяется сыроварами, включает
чередование бактериальных штаммов. Основной операцией является
определение профилей чувствительности к фагам штаммов из коллекции
потенциальных стартерных бактерий. Это знание позволяет затем создать
рациональную схему чередования пусковых культур. Влияние фагов на
процесс ферментации может быть ограничено, если стартерный штамм с
паттерном чувствительности к фагам А сменяется штаммом, имеющим
неперекрывающийся паттерн В. Эта стратегия обычно поддерживает фаговые
150
титры на уровнях, которые не мешают ферментативному процессу. Тем не
менее чередование основано на доступности достаточного числа активных
штаммов. Среди проблем, связанных со схемами чередования, можно назвать
трудность подбора нечувствительных к некоторым фагам штаммов и в
изменениях ферментативных процессов из-за штаммовых различий
метаболических свойств стартерных культур (Moineau,1999).Bто же время с
эволюционной точки зрения использование разных штаммов может
способствовать появлению гетерогенных фаговых популяций, что усиливает
возможности генетической рекомбинации в пуле фаговых генов. Таким
образом, если возможно, стоило бы чередовать вид ферментированных
молочных продуктов, производимых в тех же условиях. Например, за
производством сыра Чеддер (с помощью мезофильных бактерий) может
следовать производство Моцареллы, которое использует термофильных
бактерий. Если популяция специфичных мезофильных фагов увеличилась во
время создания сыра Чеддер, то после производства Моцареллы она будет
существенно сокращена.
Когда обнаруживается, что промышленный бактериальный штамм
чувствителен к фагу, первым шагом является замена его фагоустойчивым
штаммом, сохраняющим те же функциональные характеристики в ходе
ферментации. Если такой штамм недоступен, вся процедура выбора штамма
должна быть повторена. Эта процедура затратна по времени и стоимости;
таким образом, предпочтительным решением может быть создание или выбор
фагоустойчивых бактериальных мутантов. Создание вирус-нечувствительных
мутантов (BIMs) - это обычно первый способ, используемый для превращения
фагочувствительного штамма в устойчивого мутанта. В настоящее время
BIMsполучаются в лабораториях по протоколу, очень похожему на
классический phagechallengeэксперимент Delbruck-Luria(1943). После
длительного воздействия вирулентных фагов несколько колоний выживших
клеток, которые потеряли способность адсорбировать фаг, чаще всего из-за
спонтанной мутации в. хромосомном гене, кодирующем фаговый рецептор,
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]