Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
181
al., 1997; Eko et al., 1994a; Mader et al., 1997; Panthel et al., 2003). Такие
препараты содержат то, что часто называют «тенями бактерий», и они
получены в результате использования продукта лизирующего гена е
бактериофага рХ174 для лизиса различных грамотрицательных бактерий.
Геном бактериофага <рХ174 кодирует единственный лизирующий
белок - Е-белок внешней мембраны, который содержит 91 аминокислотный
остаток и способен формировать пору диаметром в 40-200 нм в клеточной
стенке бактерий - через нее вытесняются внутриклеточные компоненты (Schon
et al.,1995; Witte et al., 1990; Witte et al., 1992). Общая методика получения
препаратов «призраков» может быть кратко изложена на примере недавнего
исследования, в котором был получен призрак Н. pylori рНРС38 и
протестирован на иммуногенность у мышей (Panthel et al., 2003). Авторы
использовали Е. coli-H. pylori челночную плазмиду рНе12 для
конструирования лизирующей Н. pylori плазмиды рНРС38, которую они
поместили в штамм Н. pylori Р79 с помощью конъюгации или трансформации.
Трансконъюганты или трансформанты Н. pylori, несущие плазмиду, были
отобраны на среде, содержащей хлорамфеникол; чел-ночный вектор содержит
ген хлорамфениколацетилтрансферазы cat, поэтому добавление
хлорамфеникола в среду позволяет отбирать колонии бактерий, которые
содержат челночный вектор, кодирующий ген устойчивости catGC.
Препараты «теней» были далее использованы для вакцинации мышей BALB/c
перорально (начальная доза, а затем 2 вспомогательные дозы с интервалом в
семь дней); контрольные мыши получили PBS. Через три недели после
последней дозы препарата теней Н. pylori вакцинированные и контрольные
мыши получили орально высокие дозы дикого штамма, Н. pylori штамм Р79
(109 КОЕ.). Четыре недели спустя мышей умертвили, и подсчитали
количество возбудителя в желудке. Вакцинирование препаратом призраком
снизило число клеток Н. pylori в желудке примерно в 1000 раз по сравнению с
контролем. Исследование не определило длительность защитного эффекта;
тем не менее, данные говорят о том, что вакцина-призрак может быть
182
эффективным средством по крайней мере для предотвращения начальной
колонизации слизистой желудка бактериями Н. pylori.
Теоретически возможно использовать подобную стратегию для
приготовления бактериальных призраков любых грамотрицательных
бактерий при условии, что кассета Е-лизиса может быть помещена в
реципиента с помощью соответствующего вектора, позволяющего
осуществлять строгий контроль экспрессии гена е (Jalava et al., 2002). На
самом деле тени некоторых видов грамотрицательных бактерий, включая Е.
coli, были приготовлены с использованием опосредованного белоком Е (ВIasi
et al., 1985), Salmonella серотипы Typhimurium и Enteritidis (Szostak et al., 1996),
V. cholerae (Eko et al., 1994a; Eko et al., 2003; Eko et al., 1994b) и Pasteurella
multocida и P. haemolytica (Marchart et al., 2003).
Так как тени сохраняют внешнюю мембрану с иммуностимулирущими
липополисахаридными (ЛПС) эндотоксиновыми структурами совершенно
нетронутой (за исключением пор, образованных Е-белком), они должны
осуществлять защиту, сходную с получаемой при использовании
цельноклеточных, аттенуированных вакцин - но без связанного с
использованием живых бактерий риска (Jalava et al., 2002; White et al., 1990).
Одним примером применения вакцин-призраков в предупреждении
заболевания у сельскохозяйственно важных животных является работа с
вакциной против инфекции свиней, вызванной Actinobacillus
pleuropneumoniae, A. pleuropneumoniae - главный респираторный патоген,
ответственный за высокую заболеваемость и смертность у свиней; хотя
традиционные вакцины против A. pleuropneumoniae доступны в настоящее
время, они снижают смертность, но не эффективны для снижения уровня
заболеваемости. Hensel с коллегами (2000) использовали модель аэрозольного
заражения свиней для изучения защитного потенциала вакцины-призрака на
основе A. pleuropneumoniae (серотип 9, референсный штамм CVI13261).
Свиньи были внутримышечно вакцинированы вакциной- призраком или
препаратами формалин-инактивированных A. pleuropneumoniae. Через две
183
недели вакцинированные свиньи и невакцинированные контроли были
заражены A. pleuropneumoniae (109 КОЕ.) с помощью аэрозольной ингаляции.
Результат был оценен клиническими, бактериологическими, серологическими
методами и с помощью посмертного вскрытия. У свиней контрольной группы
после заражения A. pleuropneumoniae развивалась лихорадка и
плеропневмония; в обоих вакцинированных группах животные были
полностью защищены от клинически выраженного заболевания. Важно, что
вакцина-призрак (но не убитый формалином бактериальный лизат)
предотвратила колонизацию респираторного тракта A. pleuropneumoniae.
Иммунизация двумя вакцинами также значительно увеличила количество
антител IgM, IgA, IgG (Fc') и IgG (H+L), отвечающих на A. pleuropneumoniae.
Интересно, что более высокие титры IgG (Fc') и IgG (H+L) наблюдались у
свиней, получавших убитую формалином вакцину, чем препаратом «теней»; с
другой стороны предупреждение бактерионосительства у свиней,
вакцинированных вакциной-призраком, совпало со значительным
повышением IgA в сыворотке, по сравнению с убитой формалином вакциной.
Более поздняя публикация результатов похожего исследования (Huter et al.,
2000) подтвердила, что иммунизация вакциной с тенями бактерий (а не
инактивированным формалином препаратом) предотвращала колонизацию
легких свиней A pleuropneumoniae.
Отмечено, что вакцины-призраки также предотвращают инфекции,
вызванные К. pneumoniae (приводит к тяжелым инфекциям у различных
важных для сельского хозяйства животных, включая молочных коров,
домашних птиц, страусов и т.д.), Е. coli 078:К80 (вызывает колибациллез у
птиц, септицемию у телят, поросят и ягнят), Р. multocida (вызывает холеру у
птиц и пневмонию у поросят и скота) и другими бактериальными патогенами.
Были опубликованы подробные обзоры бактериальных вакцин-призраков
(Szostak et al., 1990; Szostak et al., 1996; Szostak et al., 1997), включая недавний
обзор о бактериальных тенях как возможных вакцинах для применения в
ветеринарии (Jalava et al., 2002). Значительное число бактериальных ЛПС
184
эндотоксинов в препаратах/вакцинах на основе теней бактерий может
ограничить использование этого типа вакцин. Тем не менее несколько
исследований показали, что эффективные дозы таких вакцин не вызывали
заметных побочных эффектов ни у одного из обследованных животных. Более
того, предположено, что ЛПС - компонент играет решающую роль в иммунной
стимуляции. Например, Szostak и коллеги (1996) отметили значительную
корреляцию между эндотоксической активностью бактериального препаратапризрака, определенной с помощью анализа посредством лизата амебоцитов
Limulus (ЛАЛ - тест), и их способностью стимулировать продукцию белков
PGE2 и TNFa в культурах мышиных макрофагов.
В дополнение показано, что бактериальные тени, приготовленные из
кишечной палочки 026:В6 и Salmonella typhimurium, вызывают дозозависимый
антительный ответ против бактериальных клеток и соответствующих ЛПС у
кроликов при внутривенном введении по стандартному протоколу
иммунизации. Никаких побочных эффектов не было обнаружено ни у одного
из кроликов, получавших вакцину, в дозах <250 нг /кг. Szostak с коллегами
(1996) обнаружили, что эндотоксическая активность бактериальных
препаратов (определенная методом ЛАЛ и использованием 2-кето-Здезоксиоктоната) коррелирует с выходом PGE2 и TNFa в культурах мышиных
макрофагов и эндотоксическими (например, лихорадка) ответами у кроликов,
что говорит о том, что in vitro системы могут быть использованы для
определения силы бактериальных вакцин-призраков (Mader et al., 1997).
В настоящее время трудно предсказать, приобретут ли фаговые
бактериальные лизаты и/или препараты «теней» широкое признание в
ветеринарной медицине. Оба подхода кажутся безопасными, эффективными и
относительно прибыльными. Тем не менее, фаговые лизаты могут иметь
преимущество перед вакцинами-призраками, потому что их проще
приготовить (например, они не требуют использования методов генной
инженерии и оптимальной экспрессии содержащих ген е конструкций для
лизиса бактерий). Сравнительная простота приготовления фаговых лизатов
185
относительно препаратов «теней» может быть особенно важной, когда
необходимо разработать комплексные вакцины; например, вакцины против
нескольких серотипов определенных бактериальных видов, когда вакцина,
основанная на одном серотипе, не обеспечивает должной перекрестной
защиты. Присутствие живых фагов может также служить как дополнительный
фактор, повышающий эффективность фагового лизата посредством их
антибактериального влияния на патогенные клетки-мишени.
В дополнение к <рХ 174-кодируемому белку Е, который был
использован для приготовления вакцин-призраков, другие фаговые ферменты
были использованы для лизиса бактериальных клеток, например L-белок
бактериофага MS2 и белок созревания А2 фага QP (Bernhardt et al., 2001;
Kastelein et al., 1982; Coleman et al., 1983) эндолизин бактериофага В.
amyloliquefaciens. Также некоторые бакте- риолизин-кодирующие гены и их
применение были запатентованы: например, Auerbach и Rosenberg (1987)
запатентовали использование клонированных генов лизиса X как метод
разрушения бактериальной клеточной стенки.
Идея использования фаговых ферментов как антибактериальных
агентов была оценена в нескольких недавних исследованиях.
Одним из примеров является описанное выше применение
полисахариддеполимеразы, кодируемой 0Еа1, для ослабления симптомов
бактериального ожога у груш, зараженных Е. amylovora (Hurtung et al., 1988).
В другом исследовании Loessner с коллегами (1998) клонировали и
секвенировали ген эндолизина plyTW фага Twort S. aureus (ген кодирует 53кДа белок, чей каталитический сайт находится в N-концевом участке).
Клонированный ген экспрессировали в Е. coli, и было показано, что
очищенный рекомбинантный белок быстро разрушает стафилококковый
пептидогликан, таким образом подтверждая, что эндолизин может быть
эффективным антибактериальным агентом йротив S. aureus. Позднее Gaeng с
коллегами (2000) идентифицировали два эндолизина (Ply 118 3 lkDa Ь-аланилВ-глютамат пептидаза, и Р1у511 37kDa N-ацетомурамоил-Е-аланин амидаза),
186
кодируемые фагом Al 18 (Loessner et al., 1995), которые специфично
гидролизуют поперечные пептидные мостики в пептидогликане Listeria; они
создали штамм Lactococcus lactis, который секретировал оба фермента. Этот
штамм элиминировал L. monocytogenes из молочных стартерных культур,
используемых при производстве сыра, что говорит о ценности этого метода в
улучшении хранения молочных продуктов. Кодируемые бактериями
ферменты, способные лизировать бактерий (например, лизостафин и лизоцим)
как потенциальные терапевтические агенты многочисленных животных
моделей и по крайней мере одного пациента человека, изучались с 1960-х
вплоть до 1990-х годов (Schuhardt and Schindler, 1964; Stark et al., 1974; Gunn
and Hengesh, 1969; Oldham and Daley, 1991; Nuzov, 1984; Nakazava et al., 1966).
Тем не менее, идея, что коди-руемые фагом ферменты могут сами быть
использованы в терапевтических целях, не обсуждалась широко до недавнего
времени (Loeffler et al., 2001; Nelson et al., 2001; Schuch et al., 2002; Morita et
al., 2001).
Применение фагов для снижения контаминации пищевыми патогенами
сырых продуктов
Впервые возможность использования бактериофагов в профилактике и
лечении инфекционных заболеваний была продемонстрирована в 1917 г.,
когда среди ученых-микробиологов распространилась сенсационная новость,
что Феликс д’Эрелль открыл вирусы, «пожирающие бактерии», и на их
основе ему удалось разработать препараты для лечения солдат, заразившихся
дизентерией.
Бактериофаги – это вирусы, характеризующиеся специфической
способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, с
последующим лизисом (разрушением) клетки-хозяина (вирулентные фаги)
или образованием лизогенов (умеренные фаги).
Более восьмидесяти лет в бывшем Советском Союзе, а позднее и в
Российской Федерации на филиалах НПО «Микроген» производятся
187
лекарственные средства как на основе отдельных видов бактериофагов, так и
их комбинаций для лечения и профилактики острых кишечных инфекций и
декомпенсированных форм дисбактериоза, а также гнойно-воспалительных
заболеваний бактериального генеза.
Длительное время выпускаются в нашей стране и диагностические тестсистемы на основе бактериофагов, позволяющие идентифицировать
патогенные микроорганизмы вызывающие листериоз, сибирскую язву, чуму,
псевдотуберкулез, холеру и т.д.
Развитие новых представлений в конце ХХ - начале ХХI века как о
молекулярной биологии, так и об экологических взаимоотношениях
бактериофагов и их хозяев, а также все более широкое распространение в
биосфере антибиотикорезистентных микроорганизмов, актуализировали
своего рода второе рождение вирусов бактерий (бактериофагов). Существенно
возросшее количество персистирующих антибиотикорезистентных
патогенных и условно-патогенных микробов, утяжеляющих клиническое
течение патологических состояний и ухудшающих показатели инфекционной
заболеваемости во многих странах мира, связано как с бесконтрольным и
некорректным применением антибиотиков в лечении ряда заболеваний и
профилактики нозокомиальных инфекций, так и с массовым применением
консервантов и бактерицидных препаратов в пищевой промышленности, а
также сельском хозяйстве.
Переход на потребление экологически чистых не обработанных
антибактериальными средствами химической природы продуктов питания
подразумевает поиск новых и возрождение известных ранее форм и методов
консервации пищевой продукции.
В 2006 г. важной вехой в истории использования бактериофагов в
пищевой промышленности была регистрация Управлением по
продовольствию и медикаментам США (US FDA) фагосодержащей пищевой
добавки (технологического вспомогательного средства – processing aid) на
основе поливалентного листериозного коктейля фагов ListShield (Intralytix,
188
США) «Listeria monocytogenes Specific Phage Preparation», включающего 6
различных фагов, к которому чувствительны 170 штаммов L. monocytogenes,
позволяющего производить обработку готового к употреблению мяса
домашних животных и птиц. Позднее были зарегистрированы:
• EcoShield™ – натуральный, не содержащий химических добавок
препарат, состоящий из 3 вирулентных бактериофагов, лизирующих
Escherichia coli O157:H7, производящийся компанией Intralytix Inc. USA
[http://www.intralytix.com/];
• SalmoFresh™ – натуральный, не содержащий химических добавок
препарат литических бактериофагов, активных в отношении Salmonella
enterica, производящийся компанией Intralytix Inc. USA [
http://www.intralytix.com/];
• Listex™ – натуральный препарат, содержащий бактериофаг P100,
активный в отношении Listeria monocytogenes [http://www.micreos.com/];
• SALMONELEX™ – натуральный препарат, содержащий
бактериофаги, активные в отношении ряда серотипов сальмонелл
[http://www.micreos.com/];
• AgriPhage™ – биопестицид, содержащий коктейль вирулентных
фагов, лизирующих Xanthomonas campestris pv. vesicatoria и Pseudomonas
syringae pv. tomato, поражающих плоды томата и перца. Производится
компанией OmniLytics Inc. USA [http://www.omnilytics.com/].
Бактериофаговый биопроцессинг – это применение бактериофагов для
деконтаминации овощей, фруктов, мяса, рыбы и т.д. в процессе их заводской
переработки перед упаковкой готовой к употреблению продукции. За рубежом
для деконтаминации пищевых продуктов используют фагосодержащие
биопрепараты (на основе комплектов вирулентных бактериофагов), которые с
успехом применяются для биодеструкции микробиологического роста, т.е.
сохранения исходной микробиологической чистоты продуктов питания.
Рост числа спорадических случаев и вспышек инфекций, передаваемых
пищевым путем, в начале 2000-х гг., в частности листериоза, стал серьезным
189
вызовом для системы здравоохранения США и ряда стран Западной Европы,
потребовавшим, наряду с все возрастающей борьбой за экологическую
чистоту продуктов питания, создания новых способов борьбы с возможной
контаминацией готовых к употреблению пищевых полуфабрикатов (Readytoeat-(RTE)-product). Так, в 2009 г. Susanne Guenther с соавт. провели
эксперимент по оценке возможности использования двух бактериофагов,
A511 и P100, для элиминации L. monocytogenes в RTE-продуктах, в которых
данный возбудитель встречается достаточно часто. Пищевые образцы были
искусственно контаминированы бактериями в титре 1×103 КОЕ/г,
бактериофаги в титрах 3×106 БОЕ/г и 3×108 БОЕ/г наносили на продукты
спустя 1–2 ч, чтобы дать бактериям адаптироваться, после чего закладывали
образцы на хранение при 6 °C в течение 6 дней. Результаты исследования
показали, что в жидких продуктах, таких как шоколадное молоко и сырный
рассол, благодаря беспрепятственному перемещению фаговых частиц полная
эрадикация бактерий происходила достаточно быстро. В то время как на
твердых пищевых продуктах фаги также снижали уровень бактериальной
обсемененности, но не более чем на 5 логарифмических единиц относительно
контрольных образцов. По мнению исследователей, применение
бактериофагов для деконтаминации RTE-продуктов в высоких концентрациях
(3×108 БОЕ/г) оказывается более эффективным, чем в низких дозах (3×106
БОЕ/г).
Наряду с L. monocytogenes, в США и странах Западной Европы в этот
период возросло число случаев Food-borne infections, вызванных E. coli
O157:H7. В качестве иллюстрации возможного применения бактериофагов в
борьбе с этим пищевым патогеном в 2009 г. Sharma Manan с соавт. провели
исследование, в котором оценили эффективность воздействия коктейля из
трех бактериофагов (ECP-100), активных в отношении E. coli O157:H7, на
контаминированные этим патогеном свежесрезанные листья капусты и куски
дыни. Листья капусты инфицировали E. coli O157:H7 в титре 3,76 lg (КОЕ/см2),
и после подсушивания опытные образцы аэрозольно обрабатывали коктейлем
190
бактериофагов ECP-100 в титре 7,98 lg (БОЕ/см2), а контрольные –
фосфатносолевым буферным раствором. После деконтаминации листья
хранили в течение 2 дней при температуре 4 ºC. Нарезанные кусочки дыни
контаминировали E. coli O157:H7 в титре 4,55 lg (КОЕ/мл), затем контрольные
образцы обрабатывали таким же буферным раствором, а опытные – коктейлем
фагов ECP-100 в титре 6,69 lg (БОЕ/мл). Деконтаминированные кусочки дыни
хранили в течение 7 дней при температурах 4 и 20 ºC. На 0, 2, 5 и 7-й день
образцы дыни гомогенизировали для определения в них уровня E. coli
O157:H7. Количество кишечной палочки на листьях салата, обработанных
бактериофагом на 0, 1 и 2-й день, составляло 0,72, <0,22 и 0,58 lg (КОЕ/см2),
что было существенно ниже, чем на контрольных образцах, обработанных
буферным раствором: 2,64, 1,79 и 2,22 lg (КОЕ/см2) соответственно.
Количество кишечной палочки в обработанных коктейлем фагов образцах
нарезанной дыни, хранившихся при температуре 4 ºC, на 2, 5 и 7-й день
составляло 0,77, 1,28 и 0,96 lg (КОЕ/мл), что было значительно ниже, чем в
контроле: 3,34, 3,23 и 4,09 lg (КОЕ/мл) соответственно. При температуре 20 ºC
существенных различий в обработанных и контрольных образцах не
наблюдалось. В заключение авторы особо подчеркнули следующее
биологическое свойство фагового коктейля: он более выраженно
элиминировал кишечную палочку в продукте при холодильном хранении, чем
при температуре 20 ºC.
Soni в публикациях 2009 и 2010 гг. показал антилистериозную
активность технологического вспомогательного средства Listex на основе
бактериофага P100, эффективно лизирующего L. monocytogenes на
поверхности охлажденного филе лосося. В своих работах он
продемонстрировал возможности фаг-опосредованной контаминации в
зависимости от времени контакта бактериофага с продуктом при различных
температурах хранения охлажденного филе лосося. Образцы филе рыбы
искусственно контаминировали смесью, содержавшей два серотипа
бактериальных клеток L. monocytogenes, с общим титром 4,3 lg (КОЕ/г). Затем
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]