Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
201
контаминация охлажденных продуктов приводит, наряду с другими
факторами, вызывающими порчу, к сокращению установленных в
нормативной документации сроков годности на данную категорию
полуфабрикатов. Применение химических и физических методов консервации
в пищевой отрасли не решает эту проблему, снижая уровень экологической
чистоты продукции и провоцируя появление новой категории патогенов –
штаммов условно-патогенных бактерий, резистентных к антибиотикам.
В Америке, Канаде и странах Евросоюза с конца 1990-х годов рост числа
спорадических случаев и вспышек инфекций, передающихся пищевым путем,
послужил поводом для развития нового класса технологических
вспомогательных средств, регистрируемых с 2006 г. US FDA (Управлением
по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов
США) в форме Processing Aid, действующим началом которых являются
бактериофаги. Несколько позднее все фагосодержащие продукты,
регистрируемые этим ведомством, были отнесены этим ведомством к
категории GRAS (Generally Recognised as Safe) – в целом безопасный.
Таким образом, представленный обзор научной литературы
подтверждает необходимость разработки новых методов деконтаминации для
продления сроков годности пищевых полуфабрикатов, сохраняющих
исходное качество и экологическую чистоту продуктов питания, при этом
щадящие процедуры переработки полуфабрикатов. Так как все большее
распространение в мировой торговой сети приобретают готовые к
употреблению продукты питания, не требующие длительной термической
обработки, которые увеличивают риск возникновения спорадических случаев
и вспышек инфекций, передаваемых пищевым путем.
В Российской Федерации, невзирая на принятое еще в июне 2011 г.
Ученым Советом Роспотребнадзора решение о разработке новых средств на
основе бактериофагов, активных в отношении пищевых патогенов, с
возможностью их дальнейшего использования на перерабатывающих
предприятиях, фагосодержащие технологические вспомогательные средства в
202
качестве антимикробных веществ в ТР ТС 029/2012 «Требования безопасности
пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных
средств» до сих пор отсутствуют. В связи с этим целью настоящего
исследования стало создание безопасного и эффективного средства
деконтаминации на основе поливалентного коктейля бактериофагов,
активного в отношении бактериальных патогенов, вызывающих как порчу
охлажденной пищевой продукции, так и пищевые инфекции у человека.
Отсутствие в Российской Федерации прецедента по созданию,
регистрации и применению технологического вспомогательного средства на
основе бактериофагов поставило перед нами проблему по формированию
собственного алгоритма его разработки:
- от выделения и селекции вирулентных штаммов бактериофагов,
- отработки технологии получения высокоактивных стерильных
очищенных от токсинов фаголизатов, подтверждения их безопасности на
молекулярногенетическом уровне и
- до сборки готовой формы фагового коктейля, не токсичного в
испытаниях на лабораторных животных и эффективно элиминирующего в
лабораторных и промышленных условиях бактерии, вызывающие ускоренную
порчу охлажденной пищевой продукции и, инфекции, передающие пищевым
путем. Перечисленные этапы создания фагосодержащего продукта для
деконтаминации и продления срока годности охлажденной рыбы послужили
задачами настоящего исследования.
Анализ литературных данных, собственные исследования по оценке
микробиологической чистоты пищевого сырья и продуктов питания,
представленной в розничной торговой сети, определили спектр видов
бактерий, которые тестировались нами на возможность вызывать
преждевременную порчу охлажденных полуфабрикатов в условиях,
соответствующих их нормативному хранению по ТУ.
Мы остановились на следующих 7 видах: Listeria monocytogenes,
Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida,
203
Yersinia enterocolitica, Proteus spp., Enterobacter spp. Необходимость борьбы с
этими видами бактерий не ограничивается только порчей пищевых
полуфабрикатов, по данным литературы, употребление в пищу
контаминированной данными видами микроорганизмов без соответствующей
кулинарной обработки может привести к развитию тяжелых случаев острых
кишечных и пищевых токсикоинфекций, заканчивающихся длительной
госпитализацией или даже смертью (листериоз).
Штаммы отобранных выше бактерий, прошедшие проверку на
отсутствие умеренных бактериофагов, интегрированных в клетку, с помощью
тестов с митомицином С и УФО легли в основу банка культур-хозяев для
изолирования из окружающей среды бактериофагов. Общее количество
бактериальных штаммов составило 211 шт. Из различных объектов санитарноэпидемического надзора (образцов сточных вод, почвы, воды из водоема,
используемого для разведения рыбы и т.д.) было выделено 36 фагов, активных
в отношении штаммов Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa,
Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Yersinia enterocolitica, Proteus
spp., Enterobacter spp. На следующем этапе нами были исследованы
биологические свойства фагов-кандидатов: определяли спектр литической
активности бактериофагов на сформированном банке бактериальных
штаммов, проверяли их устойчивость к агрессивным факторам внешней
среды, оценивали урожайность на жидких и плотных питательных средах,
определяли морфологическую структуру бактериофагов и их возможное
таксономическое положение с помощью электронной микроскопии нативных
фаговых частиц, а также изучали параметры инфекционного процесса в
системе фаг–клеткахозяин (время адсорбции, латентный период и выход
фаговых частиц из одной бактериальной клетки). По результатам проведенных
экспериментов было отобрано 7 производственно-перспективных фагов: Lm
1, Ah 1, УГСХА-P.a. №4, FPr - 13 УГСХА, E4, Ye3-f2, Ars25- УГСХА,
характеризующихся широким суммарным спектром литической активности
на сформированном банке бактериальных штаммов – 82%, титром фаговых
204
частиц в фаголизате не ниже 1011 БОЕ/мл, устойчивых к хлороформу и
температурным скачкам в пределах от -10 до +75 ºC.
Далее бактериофаги, отобранные на основании их биологических
свойств, подвергались молекулярно-генетическому и биоинформатическому
анализу для исключения из состава будущего фагосодержащего
технологического вспомогательного средства умеренных и содержащих в
своем ДНК нежелательные гены фагов. Для получения полногеномных
последовательностей ДНК бактериофагов использовали
высокопроизводительное секвенирование второго поколения Ion Torrent
Sequencing. Данные каждого раунда секвенирования были проанализированы
методами биоинформатического анализа. Собранные полногеномные
последовательности сравнивали с известными ДНК бактериофагов,
депонированных в базе данных GenBank NCBI, а потенциальные продукты
генов анализировались при помощи программного обеспечения PHACTS,
позволяющего предсказать тип жизненного цикла бактериофага (умеренный
или вирулентный). В результате проведенных экспериментов в геномах
выделенных и селектированных бактериофагов, перспективных в отношении
обработки пищевых продуктов, локусов патогенности выявлено не было.
Таким образом, в качестве действующих веществ в готовую форму
технологического вспомогательного средства объемом 100 мл были включены
фаголизаты 7 перечисленных выше бактериофагов в титре не ниже 1010
БОЕ/мл каждого, вспомогательным компонентом продукта выбран
уравновешивающий буферследующего состава – 20 mM Hepes, 150 mM NaCl,
0,1 mM CaCl2, pH 7,5, обеспечивающий как техническую возможность очистки
коктейля бактериофагов от бактериальных токсинов методом аффинной
хроматографии на колонке EndoTrap HD (Hyglos, Germany), так и
стабильность титра фаговых частиц при хранении в течение 6 месяцев при
температуре от 2 до 8 °С.
Качество готовой формы технологического вспомогательного средства
обеспечивалось разработанной пилотной технологией его получения,
205
включавшей несколько стадий: от подготовки исходного сырья и материалов
через наработку лиофилизированного посевного материала стартерных
культур пары фагхозяин, получения отдельных фаголизатов, их сведения в
коктейль и последующей стерилизующей фильтрации и очистки
полуфабриката от токсинов до фасовки готовой формы во флаконы и укупорки
в промаркированную потребительскую тару. Контрольные мероприятия, в том
числе оценка микробиологической чистоты и специфической активности
фагосодержащего продукта, осуществлялись на каждой из основных
технологических стадий. Необходимо отметить отработку
модифицированного способа получения высокоактивного фаголизата на
плотной питательной среде, существенно сокращающего длительность этого
технологического этапа относительно описанного в патенте на изобретение
РФ №2525141, на 14 ч.
При проверке стабильности основного показателя качества
разработанного технологического вспомогательного средства – его
специфической антибактериальной активности, при температуре хранения от
2 до 8 °С в течение 6 месяцев титр фаговых частиц по Грациа на штаммаххозяевах падал не болеечем на 1%.
На следующем этапе исследования нами была проведена оценка
безопасности технологического вспомогательного средства в опытах по
изучению острой и хронической (подострой) токсичности на лабораторных
животных. В результате проведенных экспериментов было показано, что при
однократном введении максимальной дозы исследуемого фагосодержащего
продукта признаков интоксикации у мышей не наблюдалось. Поведенческие
реакции, внешний вид и привес мышей в экспериментальной и контрольной
группах при длительном пероральном приеме технологического
вспомогательного средства также не отличались. Для исключения вероятности
возникновения побочных эффектов по влиянию бактериофагов на
нормальную микрофлору кишечника in vivo (на модели беспородных белых
мышей) дополнительно определяли изменение количества основных
206
представителей микробиоценоза толстого кишечника на фоне 10-дневного
внутрижелудочного введения фагового коктейля. Разработанная рецептура не
влияет на нормальную микрофлору кишечника мышей.
Эффективность разработанного состава исходно оценивали по уровню
его бактерицидного действия в модельных экспериментах на искусственно
обсемененных микроорганизмами фрагментах охлажденной пищевой
продукции. Образцы, стерилизованные 70 % спиртом, контаминировали
суспензиями, содержащими штаммы Listeria monocytogenes, Pseudomonas
aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Yersinia
enterocolitica, Proteus spp., Enterobacter spp. в различных сочетаниях
(использовали как моно-, так и микстконтаминацию) в титре от 106 до 109
КОЕ/мл, а затем обрабатывали бактериофагом (или гомологичным
заражающим культурам коктейлем бактериофагов) с титром от 109 до 1011
БОЕ/мл и проводили постоянный микробиологический мониторинг
загрязненных поверхностей. Элиминация 99 % микроорганизмов с
поверхности образцов подтверждалась при условии множественности
инфицирования фаг–бактерия-хозяин не менее 100:1 (100 фаговых частиц на
1 бактерию или, например, L. monocytogenes 106 КОЕ/мл – бактериофаг Lm 1
109 БОЕ/мл) и времени деконтаминации не менее 2 ч, при этом температурный
режим мог варьировать от 2 до 25 °С.
Таким образом, в процессе исследования определены виды
бактериальной микрофлоры пищевого сырья, вносящие существенный вклад
в ускорение порчи охлажденной рыбы, выделены бактериофаги, обладающие
широким спектром литической активности в отношении обозначенных
бактерий-мишеней и являющиеся основным действующим веществом
безопасного и эффективного технологического вспомогательного средства,
применение которого на сложной поверхности пищевого полуфабриката в
экспериментально подобранном нами титре.
Элиминация Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas
hydrophila, Aeromonas salmonicida, Yersinia enterocolitica, Proteus spp.,
207
Enterobacter spp. с поверхности полуфабрикатов методом фагопосредованного биопроцессинга снижает риск возникновения
спорадических случаев и вспышек инфекций, передающихся пищевым путем.
Применение фагов для снижения контаминации пищевыми патогенами
готовых к употреблению продуктов
Основной причиной потерь растительного сырья при хранении является
микробиальная порча. Современные способы обработки сырья при хранении
такие, как обработка химическими препаратами, искусственное охлаждение,
озонирование, электромагнитное излучение и другие, предотвращают
микробиальную порчу, но, в тоже время, уничтожают биологический барьер,
препятствующий проникновению патогенных микроорганизмов, снижая
естественный иммунитет растительного сырья.
Перспективным направлением в хранении растительного сырья является
применение биологических средств защиты, на основе активных штаммов
антагонистов патогенной микрофлоры. Биопрепараты используют для борьбы
с фитопатогенными организмами в послеуборочный период и при длительном
холодильном хранении. При этом не создается угрозы нарушения
экологического равновесия в биосфере, так как микроорганизмы,
применяемые в качестве биопрепаратов, являются естественной микрофлорой
окружающей среды.
Биоиндустрия в современном мире развивается высокими темпами.
Мировой рынок биотехнологий в 2025 году может достигнуть уровня в 2 трил.
долларов США, темпы роста по отдельным сегментам рынка колеблются от 57 до 30% ежегодно.
В России биотехнология в сельском хозяйстве развивается в рамках
программы: «Государственная программа развития сельского хозяйства и
регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и
продовольствия». На сегодняшний день доля России на рынке биотехнологий
составляет менее 0,1%. Долгосрочной целью реализации Программы является
208
выход в 2020 году на объем биоэкономики в России в размере около 1% ВВП
и в 2030 году - не менее 3% ВВП.
Одним из направлений развития биотехнологий является производство
биопрепаратов для использования в сельском хозяйстве, в том числе и в
практике хранения продукции растениеводства. Применение биопрепаратов
является наиболее эффективным, экологически безопасным и экономически
выгодным способом хранения растительного сырья.
Наиболее приемлемой защитой растений с точки зрения её экологизации
является биологический контроль с помощью микробных препаратов.
Использование биопрепаратов на основе бактериофагов в качестве
профилактического и терапевтического средства борьбы с болезнями
представляется более целесообразным, поскольку фаги обладают рядом
преимуществ:
1.Вирусы бактерий обладают высокой специфичностью в отношении
бактерий, что позволяет избежать неблагоприятных последствий по
отношению к окружающей среде и организму хозяина.
2.Устойчивость к бактериофагам у бактерий вырабатывается гораздо
реже, чем к антибиотикам. При использовании на практике комплексных
препаратов из нескольких штаммов фагов устойчивости у бактерий может не
вырабатываться.
3.Благодаря наличию в составе бактериофагов литических ферментов,
фаги могут разрушать экзополисахаридный матрикс бактериальных
биопленок и воздействовать на клетки. Образование биопленок бактериями
создает большие трудности для применения антибиотиков или пестицидов,
поскольку в таком состоянии клетки обладают повышенной устойчивостью к
действию химических агентов.
4.Бактериофаги в сравнении с химическими средствами оказывают
меньшее токсическое воздействие, не вызывают аллергических реакций у
человека и животных, не воздействуют на растения.
209
Расширением вышеописанного метода является нанесение
специфичных фагов на различные готовые продукты с целью удаления или
снижения на них количества специфичных бактериальных патогенов.
Загрязнение готовых продуктов пищевыми патогенами - потенциально более
серьезная проблема, чем контаминация сырых продуктов, которые обычно
перед употреблением готовятся, что может сильно снижать уровень
жизнеспособных патогенов в них. Напротив, продукты, готовые к
употреблению, зачастую едят без дополнительной обработки; таким образом,
если они контаминированы патогенами, риск заражения человека высок.
Обзор современных технологий хранения плодоовощной продукции
Современный человек нуждается в потреблении свежих фруктов и
овощей высокого качества круглый год.
По результатам мероприятий государственной программы развития
сельского хозяйства, в 2016 году были достигнуты рекордные показатели
сбора основных сельскохозяйственных культур.
Так, валовой сбор овощей составил 16,3 млн. т, что на 0,9% выше 2015
года и на 6,2% - среднегодового производства за предыдущие 5 лет.
Валовой сбор фруктов и ягод составил 3,3 млн. т - на 14,6% больше, чем
в 2015 году, и на 20,9% - среднегодового производства в 2011-2015 годах.
Не менее 40 % собранных фруктов и овощей подлежит длительному
хранению, так как не могут быть переработаны и потреблены в течение 2-3
месяца после сбора урожая.
Несмотря на то, что емкость современных хранилищ
сельскохозяйственной продукции в России увеличилась на 2125 тыс. т.
единовременного хранения, несовершенство существующей системы
хранения, как в плане ее организации и размещения хранилищ по регионам,
так и в техническом и технологическом их оснащении, приводит к
значительным потерям сельскохозяйственной продукции растительного
происхождения.
210
Одна из причин такого положения - потери продукции на всех этапах ее
продвижения к потребителю. Только при хранении потери достигают 35-40%.
Проблема эффективного хранения выращенного урожая имеет комплексный
характер и требует решения целого ряда вопросов, начиная от селекции,
предпосевной подготовки семян, соблюдения севооборотов и всех приемов
агротехники и до своевременной уборки с последующей закладкой на
хранение здорового материала. Кроме того, функционирует лишь 70% от
необходимого количества хранилищ, из них только 30% имеет искусственное
охлаждение, недостаточно используются газовые методы хранения, пункты
предварительного охлаждения и холодильники в зонах производства плодов и
овощей, не налажен выпуск современного оборудования и приборов по
контролю микроклимата, а также средств механизации погрузочноразгрузочных работ. Основными причинами потерь, являются во-первых,
убыль массы в процессе дыхания, испарения и прорастания, с потерями воды
и сухих веществ (10 до 35% общей убыли массы). Причем потеря воды предельная величина, различная для каждого вида сырья (например, 3-4% она
составляет у яблок, винограда, шпината, салата, брокколи, моркови в пучках с
листьями, 5-6 - у груш, вишни, персиков, земляники, малины, смородины,
свеклы, гороха, огурцов, фасоли (в бобах), 7-8 - у моркови, свеклы, капусты
белокочанной, картофеля, перца, томатов, 10% - у лука репчатого). Если
максимальный уровень превышен, продукт становиться не пригодным для
продажи.
Во-вторых, потери, связанные с болезнями; их объем трудно поддается
прогнозам, но в случае массового распространения может достигать 100%.
Серьезные последствия могут вызвать и механические повреждения
(третья группа потерь), особенно на заключительном этапе хранения, когда в
результате созревания происходит размягчение мякоти плодов и овощей и
снижается их прочность. Этот фактор оказывает преобладающее влияние во
время транспортирования (особенно на дальние расстояния). Ухудшение
качественных показателей обусловлено как естественными причинами
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]