Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
191
на поверхность филе наносили бактериофаг P100 в титре 2×107 БОЕ/мл.
Уровень листериозной нагрузки снижался на 1,4– 2,0 lg (КОЕ/г) при
температуре хранения филе 4 °C, на 1,7–2,1 lg (КОЕ/г) при 10 °C и 1,6–2,3 lg
(КОЕ/г) при комнатной температуре (22 °C). 30-минутная обработка
бактериофагом контаминированного филе снижала листериозную нагрузку
более чем на 1 lg (КОЕ/г), в то время как 15-минутная деконтаминация
уменьшала количество листерий на поверхности филе менее чем на 1 lg
(КОЕ/г). Более высокие концентрации бактериофага 108 БОЕ/г снижали
уровень листериозной нагрузки с 2, 3 и 4,5 до 1,8, 2,5 и 3,5 lg (КОЕ/г) при
температуре хранения образцов 4, 10 и 22 °C соответственно. При обработке
бактериофагом в течение 10 дней при температуре 4 °C бактериофаг P100
элиминировал листерии на поверхности образцов до уровня 0,3 lg (КОЕ/г), в
то время как их количество на необработанных фагом экземплярах достигало
2,6 lg (КОЕ/г). Титр бактериофага на поверхности филе оставался стабильным
в течение 10 дней хранения образцов, лишь незначительно снижаясь на 0,6 lg
(БОЕ/г) от исходного количества фаговых частиц, нанесенных на образцы 8 lg
(БОЕ/г). Проведенные эксперименты показывали высокий листерицидный
эффект бактериофага P100 на поверхности рыбного филе.
В 2011 г. Susanne Guenthera и Martin J. Loessner предложили
использовать бактериофаги для обработки мягких сортов сыра как наиболее
эффективный способ борьбы с пищевыми патогенами, не изменяющий
исходные пищевые свойства продукта. В своем исследовании они применяли
листериозный бактериофаг A511, обладающий широким спектром литической
активности, для эрадикации L. monocytogenes в процессе производства двух
типов мягких сыров: камамбер и лимбургер. Первоначально поверхности
образцов сыра до созревания искусственно контаминировали L.
monocytogenes, штаммами Scott A (серовар 4b) и CNL 103/2005 (серовар 1/2a)
в титре от 101 до 103 КОЕ/см2. Однократная обработка сыра камамбер фагом
A511 в титре 3×108 БОЕ/см2 снижала исходный уровень жизнеспособных
клеток штамма Scott A (103 КОЕ/см2) на конец срока его созревания (21-й день
192
эксперимента) на 2,5 логарифмических порядка. Уровень листерий в конце
созревания обработанного фагом лимбургера (22-й день эксперимента) при
такой же исходной контаминации упал на 3 порядка. При более низкой
первоначальной контаминации листериями (101–102 КОЕ/см2) количество
жизнеспособных бактериальных клеток в конце созревания сыра было ниже
уровня детекции, что более чем на 6 порядков отличалось от
микробиологической загрязненности контрольных образцов.
В 2012 г. Carter C.D. с группой ученых оценивали эффективность
коктейля на основе бактериофагов EcoShield™, активного в отношении E. сoli
O157:H7, при обработке говядины. Большинство продуктов, которые
подвергаются высокому риску контаминации E. coli O157:H7, как правило,
транспортируются и хранятся в охлажденном или замороженном состоянии, в
таких условиях кишечная палочка, как правило, практически не размножается.
Учитывая этот факт, в процессе эксперимента искусственно
контаминированные бифштексы, деконтаминированные EcoShield™, и
контрольные образцы, обработанные PBS буфером, хранили в течение суток
при температуре 4 ºC. Количество жизнеспособных клеток кишечной палочки
определяли на 0, 1, 5 и 7-е сутки. Применение коктейля бактериофагов
приводило к значительному снижению концентрации клеток E. coli O157:H7
(на 94–98%) на обработанном фагом бифштексе в сравнении с контрольными
образцами.
В 2012 г. Susanne Guenther с группой ученых провели опыт по
биоконтролю за Salmonella typhimurium с помощью вирулентного фага FO1E2 на продуктах, готовых к употреблению (RTE). Образцы искусственно
контаминировали сальмонеллой в титре 1×103КОЕ, затем наносили
бактериофаг в титре 3×108 БОЕ/г и инкубировали 6 дней, при температуре 8 и
15 ºC. При температуре хранения 8 ºC жизнеспособные клетки не
обнаруживались после нанесения бактериофага, что свидетельствовало о
снижении уровня контаминации сальмонеллой более чем на 3 порядка. При
температуре хранения 15 ºC уровень S. typhimurium снизился на 5
193
логарифмических единиц на поверхности мяса индейки и молочном шоколаде,
а также снизился на 3 порядка на хот-догах и морепродуктах.
В 2011 г. D. Spricigo с соавт. провели эксперимент, в котором оценивали
эффективность коктейля бактериофагов (UAB_Phi 20, UAB_Phi78 и
UAB_Phi87), активных в отношении сальмонелл, на четырех различных
продуктах питания (свиная кожа, куриная грудка, свежие яйца и запакованные
листья салата). Образцы экспериментально заражали Salmonella enterica,
серовар Enteritidis, и S. enterica, серовар Typhimurium. Образцы свиной кожи
опрыскивали фаговым коктейлем, а затем инкубировали при 33 °C в течение 6
часов, что приводило к значительному снижению бактериальных клеток,
более чем на 4 и 2 log/см2 для S. typhimurium и S. enteritidis, соответственно.
Значительное снижение наблюдалось и на поверхности куриных грудок
(значение S. typhimurium и S. enteritidis снижалось на 2,2 и 0,9 log10 КОЕ/г
соответственно), которые погружали на 5 мин в коктейль бактериофагов, а
затем закладывали на 7 дней в холодильник при температуре 4 °C.
Значительное снижение бактериальной контаминации также можно было
наблюдать у упакованного длиннолистого салата, обработанного
аналогичным образом и хранившимся в течение 60 мин при комнатной
температуре и перемешивании при 100 об/мин. Уровни S. typhimurium и S.
enteritidis на листьях салата снижались на 3,9 и 2,2 log10КОЕ/г,
соответственно. Также снижение бактериальной нагрузки 0,9 log10КОЕ/см2
наблюдалось на свежих яйцах, опрысканных коктейлем бактериофагом, затем
инкубированных при температуре 25 °C в течение 2 ч.
В 2013 г. M. Oliveira с группой ученых исследовали эффективность
бактериофага ListexP100 на ломтиках дыни и соках дыни, груш и яблок.
Применение бактериофагов оказалось более эффективным на поверхности
дыни и груши, но на поверхности яблок никаких изменений не произошло.
Уровень листерий снижался на 1,50 и 1,00 log КОЕ на ломтиках дыни и груши,
соответственно. В соках снижение листерий было явно выражено, так,
количество бактериальных клеток в дынном соке сократилось на 8 log КОЕ/мл,
194
а в грушевом соке – на 2,10 log КОЕ/мл после 8 дней хранения. В яблочном
соке количество листерий не снижалось под действием бактериофага, а само
количество бактериофагов снизилось до неопределяемого уровня, что было
связано с высоким уровнем pH в яблочном соке.
Группа исследователей оценивала эффективность коктейля
бактериофагов EcoShield™ против налидиксово-устойчивой
энтерогеморрагической кишечной палочки O157:H7 RM4407 (EHEC), на
листьях зелени, хранившихся в окружающей среде и в модифицированной
газообразной оболочке (5% О2; 35% СО2; 60% N2). Образцы (~2×2 см2)
зелени (листья салата и шпинат) инокулировали 4,5 log КОЕ/см2 EHEC, после
чего обрабатывали коктейлем EcoShield™ (6,5 log БОЕ/см2) и закладывали на
хранение при 4 и 10 °C в течение 15 сут. Через 30 мин после нанесения
коктейля бактериофагов на листья шпината уровень EHEC снижался на 2,38 и
2,49 logКОЕ/см2 при температуре 4 и 10 °C, соответственно. На поверхности
листьев салата уровень EHEC снижался на 2,49 и 3,28 логарифмических
единиц через 30 мин и 2 ч при температуре хранения 4 °C. Коктейль
бактериофагов значительно уменьшал EHEC за один день на 1,19, 3,21 и 3,25
logКОЕ/см2 на листьях шпината, зеленых листьях и листьях салата ромэн по
сравнению с контрольными образцами, при температуре хранения 4 °C. Во
время хранения в модифицированной упаковке фаги уменьшали популяцию
EHEC на 2,18, 3,50 и 3,13 logКОЕ/см2 на листьях шпината, зеленых листьях и
листьях ромэн при 4 °C. При хранении образцов в окружающей среде при
температуре 10 °С EHEC снижалась на 1,99, 3,90 и 3,99 logКОЕ/см2, в то время
как в газовой модифицированной упаковке количество бактерий сократилось
на 3,08, 3,89 и 4,34 log КОЕ/см2 на шпинате, зеленых листьях и листьях ромэн,
соответственно, по сравнению с контрольной группой.
В 2014 г. Galarce с коллегами провели исследование, в котором
оценивали эффективность коктейля бактериофагов для подавления роста S.
enteritidis на поверхности сырого и копченого лосося. По 25 образцов в каждой
группе были инокулированы S. enteritidis, после чего были обработаны
195
коктейлем бактериофагов, а затем инкубированы в течение 10 дней при
температуре 4 и 18 °C. Значительное снижение количества бактериальных
клеток наблюдалось на 3, 6 и 10-й день в образцах сырого лосося,
инкубированных при 18 °C от 0,75 до 3,19 log КОЕ/г, а при температуре 4 °C
– от 2.82 до 3.12 log КОЕ/г. В образцах копченого лосося наблюдалось более
низкое снижение бактериальных клеток от 1,02 до 1,96 log КОЕ/г при 18 °C,
от 0,50 до 1,16 log КОЕ/г при 4 °C хранения.
В 2014 г. Zinno P. провели исследование, в котором оценивали
эффективность бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica
серовар Typhimurium, на различных продуктах питания: жидкие яйца,
энергетические напитки, цельное и обезжиренное молоко, яблочный сок,
куриная грудка и фарш. Образцы были экспериментально контаминированы
S. typhimurium в титре 104 КОЕ/г, после чего оставляли их на 1 ч при
температуре 4 °C для адаптации бактерий на поверхности. После этого
образцы обрабатывали бактериофагом P22 и оставляли при 4 °C,
эффективность деконтаминации смотрели через 0, 24 и 48 ч. Заметное
снижение бактериальных клеток на 2 логарифмические единицы достигалось
в опытных образцах с твердой поверхностью в сравнении с контрольными
образцами, а в цельном и обезжиренном молоке через 48 ч роста сальмонелл
не наблюдалось.
В 2014 г. M. Li наблюдал предотвращение порчи морской рыбы путем
снижения S. putrefaciens на образцах рыбы после воздействия специфического
бактериофага Spp001, активного против данного возбудителя порчи
продукции. Охлажденное филе, инокулированное S. putrefaciens,
обрабатывали различными концентрациями бактериофага от 104 до 108
БОЕ/мл. Количество бактериальных клеток значительно снижалось на
обработанных бактериофагом образцах, в отличие от контрольной группы.
Органолептические и биохимические параметры показали, что обработка
бактериофагом может продлить срок годности охлажденного филе на 4–14
196
дней. Кроме того, концентрации бактериофага 106 и 108 БОЕ/мл были более
эффективны, чем химический консервант сорбат калия 5 г/л.
В 2015 г. H. Liu с соавт. оценивали эффективность четырех
бактериофагов индивидуально и коктейлем из них для снижения роста E. coli
O157 на поверхности говядины, при температуре хранения 4, 22 и 37 °C.
Образцы 3×3×1 см искусственно контаминировали E. coli O157 в титре 104
КОЕ/см2, давали бактериям адаптироваться на поверхности в течение 10
минут и обрабатывали фагами, индивидуально и коктейлем, с
множественностью инфицирования (MOI) = 1000 и MOI = 10. Полученные
данные свидетельствовали о том, что бактериофаги более эффективно
подавляли рост E. сoli при 37 °C и более высокой MOI.
Пищевые заболевания микробной природы - это серьезная проблема
пищевой безопасности по всему миру. Center for Disease Control and Prevention
(Центр контроля и предотвращения заболеваний) оценивает, что около 76 млн
случаев пищевых заболеваний (из которых 5000 летальные) происходят
ежегодно в США; только на долю бактерий приходится 72% от всех смертей,
вызванных некачественными продуктами (21% паразитарных инфекций и 7%
вирусных) (Mead et al., 1999). Среди случаев пищевых заболеваний главными
причинами смертей служат Listeria, Toxoplasma и Salmonella (которые вместе
ответственны за более чем 75% случаев смертельных пищевых отравлений и
инфекций, вызванных патогенами. Вдобавок шигатоксин-продуцирующие Е.
coli (включая штаммы серовара 0157:Н7) недавно стали главной проблемой в
области пищевой безопасности (в частности, в производстве мяса) и вызвали
несколько серьезных вспышек заболевания с высокой летальностью. Также
некоторые виды Brucella, Yersinia, Shigella и другие бактерии часто являются
причиной пищевых отравлений, виды Campylobacter вызывают самое большое
число случаев в США (С. jejuni вызывает приблизительно 2,4 млн.
заболеваний в год в США) (Mead et. al., 1999).
197
Эпидемиология пищевых отравлений из-за бактериальных патогенов
различается между патогенами, как и пути, которыми различные бактерии
контаминируют продукты.
Некоторые бактерии (например, L. monocytogenes) - это патогены
окружающей среды, которые попадают в продукты на производственных и
упаковочных фабриках.
Другие бактерии (например, сальмонелла или кампилобактер) являются
частью нормальной кишечной флоры многих животных, и они попадают в
продукты во время убоя и разделки туш. Использование бактериофагов для
снижения контаминации продуктов различными бактериальными патогенами
требует глубинного понимания эпидемиологии и экологии бактерий, против
которых будут использованы фаговые препараты, и определения основных
моментов в цикле производства, когда применение фагов будет наиболее
успешным (Stone, 2002). В таком случае могут быть свободно определены три
возможные области применения фаговой технологии: (i) фагов можно
использовать для снижения ко-лонизации кишечника живых
сельскохозяйственных животных, обычно содержащего бактерий,
представляющих риск возникновения пищевых отравлений; (и) фагов можно
применять прямо на сырых продуктах или на производственных поверхностях
для снижения уровня пищевых патогенов в продукции; и (iii) фаги могут быть
нанесены прямо на готовые к употреблению продукты или на
производственные поверхности рабочих установок для снижения уровня
патогеных бактерий в готовых продуктах. Дополнительные области
применения и комбинированные методы (например, когда фаги используются
у живых животных и в процессе производства) тоже могут быть использованы.
В настоящее время ни один из таких практических способов применения не
используется в производстве. Тем не менее, как описано ниже, результаты
некоторых опубликованных исследований говорят о том, что эти методы
имеют свои достоинства.
198
Многие бактериальные патогены, способные вызывать пищевые
заболевания у людей, являются частью нормальной микрофлоры ЖКТ
сельскохозяйственных животных (коров, овец, птиц и т.д.). В ходе убоя и
разделки туш животных существует множество возможностей
контаминировать сырую тушу, что увеличивает риск попадания бактерий в
организм человека и возникновения заболевания. Таким образом, методы,
элиминирующие или снижающие уровни пищевых патогенных бактерий в
продуктах, имеют потенциал для значительного повышения их безопасности.
Использование бактериофагов может обеспечить такую возможность.
Как отмечалось в этой главе ранее, несколько исследователей показали,
что оральное введение фагов снижает количество бактерий-мишеней и
уменьшает их распространение с навозом из кишечника обработанных
животных (Smith and Huggins, 1983; Smith et al., 1987a; Berchieri et al., 1991).
Исследования не были направлены напрямую на изучение безопасности
продуктов, точнее, они были проведены для определения, есть ли при
оральном применении фагов профилактический эффект при бактериальных
заболеваниях у различных видов животных. Тем не менее, получено непрямое
доказательство того, что пероральное введение фагов может быть
действительно эффективным для обеспечения пищевой безопасности. Идея,
что фагопосредованное снижение кишечной колонизации патогенными
бактериями или распространение патогенных бактерий может повысить
пищевую безопасность, была выдвинута сравнительно недавно (Brabban et al.,
2003; Raya et al., 2003; Kudva et al., 1999). Предварительные данные,
полученные в ходе недавних исследований, поддерживают ранние
наблюдения, уже описанные выше, и говорят о том, что метод имеет значение.
Например, недавно было отмечено (Raya et al., 2003), что однократная
оральная доза высококонцентрированного (4x10й БОЕ) специфичного против
Е. coli 0157:Н7 фагового препарата вызвала через два дня после назначения
заметное снижение титров Е. coli 0157:Н7 в кишечнике овец,
экспериментально колонизированных бактериями (1010 БОЕ) за три дня до
199
фагового лечения. По мнению авторов, эти результаты говорят, что защитный
эффект бактериофагов против Е. coli 0157:Н7 может способствовать
значительному снижению степени инфицирования людей, если его
использовать как превентивную меру (Raya et al., 2003).
Хотя начальные наблюдения были обнадеживающими, авторы признали
необходимость проведения дополнительных исследований, направленных на
решение нескольких важных вопросов, не изученных в первых экспериментах.
Один из этих вопросов - практическое применение фагов для
элиминирования или значительного снижения уровня пищевых патогенов в
ЖКТ важных для сельского хозяйства животных. Состав нормальной
кишечной флоры животных очень сложный, и было доказано, что устранить
колонизацию кишечника разными бактериями (в особенности, если бактерия
является частью нормальной ЖКТ флоры) очень трудно. Таким образом,
сомнительно, что фаги могут полностью искоренить бактерий, которые
обычно живут в ЖКТ домашнего скота, и способны быть пищевыми
патогенами людей. Также еще не определена ценность снижения уровней
патогенных пищевых бактерий в ЖКТ домашнего скота. Более того, хотя
фаговая устойчивость, кажется, не является главной проблемой в процессе
краткосрочных исследований фаговой терапии животных и рыб (Smith and
Huggins, 1983; Bull et al., 2002; Berchieri et al., 1991; Park and Nakai, 2003),
длительное использование и продолжительная экспозиция фагов и их
бактерий-мишеней в ЖКТ может предоставить богатую почву для отбора
фагоустойчивых мутантов (см. главу 14). Таким образом, могут быть
преимущества в использовании бактериофагов в «эпидемиологической
конечной точке»; например, когда круговорот патогенов и фагов в
окружающей среде и/или млекопитающем-хозяине не осуществляется или
минимизирован. Интересный метод, основанный на этой идее, был разработан
Taylor с коллегами (1958), которые вводили фагов в фертильные куриные яйца
перед инкубацией. Их гипотеза заключалась в том, что фаги будут лизировать
бактерий в яйцах, и это, в свою очередь, увеличит вылупляемость цыплят - и
200
доказательство такого эффекта было представлено авторами. Например,
уровень вылупляемости цыплят из яиц, экспериментально зараженных
Salmonella chittagong, был 47% против 70% в для обработанных и
необработанных фагом яиц соответственно. Разница в процентах была
похожей и для других серотипов Salmonella (например, выход цыплят из яиц,
зараженных Salmonella pullorum, составил 44 % по сравнению с 77% для яиц,
инфицированных той же бактерией, и обработанных специфичным фаговым
препаратом). Авторы не обсуждали потенциальную выгоду своих наблюдений
для безопасности продуктов, и эффект лечения зараженных яиц фагами был
оценен только путем сравнения уровней вылупления цыплят; никаких строгих
микробиологических анализов яиц и вылупившихся цыплят проведено не
было. Тем не менее, заманчиво предположить, что, если бактериофаги были
эффективны для снижения уровня патогенных сальмонелл в яйцах, этот метод
может иметь ценность в предупреждении человеческих заболеваний,
вызванных пищевыми патогенами. Преимуществом метода является то, что
появление давления отбора на основе чувствительности к фагам невозможно,
так как фаги, инъецированные в яйца, будут главным образом действовать на
бактерий в яйцах. Другие возможные способы производства продуктов,
использующие бактериофагов, которые, вероятно, не приведут к появлению
силы отбора, стимулирующей образование фагоустойчивых бактерий,
описаны ниже.
Микробиологическая безопасность пищи в ХХI в. остается ведущей
проблемой гигиены питания. Появление новых технологий хранения пищевых
полуфабрикатов на холоде, вакуумной упаковки в пленку, минимальной
переработки охлажденного сырья, длительной транспортировки, а также
несоблюдение правил гигиены работниками сферы общественного питания
увеличивают возможность накопления в готовых блюдах возбудителей
пищевых инфекций, таких как Pseudomonas, Vibrio, Flavobacterium, Bacillus,
Clostridium, Micrococcus, Staphylococcus, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia,
Serratia, Edwardsiella, Listeria, Nocardia, Shewanella. Бактериальная
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]