Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
151
отбираются для дальнейшего исследования. Фагоустойчивые мутанты не
отбираются на фабрике, так как процесс ферментации начинается каждый раз
с замороженной стандартной культуры. BIMsтакже могут возникать из-за
мутаций, которые влияют на углеводный состав бактерий, белковый профиль
или концентрацию липотейхоевых кислот, что приводит к изменениям в
клеточной поверхности (FordeandFitzgerald, 1999). Хотя процесс получения
BIMsсравнительно простой, он может иметь значительные затруднения;
например, высокая частота реверсий к чувствительному фенотипу или
изменение физиологии бактерий (сниженная скорость роста). Однако много
BIMsбыло выделено и успешно используется в промышленных
условияхДругой способ создания фагоустойчивого штамма основывается на
использовании иных молекулярных механизмов защиты от фага. Бактерии
обладают естественными системами устойчивости, позволяющими им
противостоять атакам фагов. Например, более 50 естественных систем защиты
L. lactisбыло охарактеризовано и поделено на четыре группы, в зависимости
от времени, когда они вступают в действие в ходе литического цикла
(CoffeeandRoss, 2002). Они включают (i) ингибирование фаговой адсорбции,
(ii) блокирование инъекции ДНК, (iii) системы рестрикции/модификации
(R/M), (iv) механизмы абортирования инфекции (Abi). Гены, кодирующие эти
механизмы защиты, могут содержаться в плазмиде или хромосоме. Одной
полезной особенностью является то, что несколько плазмид могут
переноситься при конъюгации, позволяя создавать фагоустойчивые штаммы,
не затрагивая технологически полезных свойств. Более того, эти природные
антифаговые системы обычно эффективны сразу против нескольких групп
фагов (Moineau, 1999). Антифаговые барьеры имеют важное коммерческое
значение, и многие из них были запатентованы по всему миру.
Четыре вышеописанных механизма фаговой устойчивости были
изучены в разной степени. Вмешательство в фаговую адсорбцию наиболее
вероятно достигается с помощью маскирования бактериальных рецепторов.
Это явление было приписано продукции различных веществ, включая
152
галактозилсодержащую липотейхоевую кислоту, полимер галакторамноновой
или галактоглюкуроновой кислоты, белки клеточной стенки
(CoffeyandRoss,2002). Т ем не менее генетические детерминанты,
ответственные за этот естественный механизм защиты, остаются
неопределенными. Второй защитный механизм (блокирование инъекции
ДНК) до сих пор недостаточно понятен. Он предупреждает транслокацию
фаговой ДНК в клетку, без затрагивания фаговой адсорбции. Генетические
локусы, ответственные за такой бактериальный фенотип, еще не были
определены. R/Mсистемы были идентифицированы в разных бактериальных
группах, включая LAB. Они характеризуются наличием двух типов
ферментов, сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции и метилазы.
Системы рестрикции-модификации уничтожают широкий спектр фагов,
разрезая их геномы. И, наконец, Abi-системы включают все механизмы
устойчивости, которые работают после адсорбции и инъекции нуклеиновых
кислот, и приводят к смерти клетки, вызванной фагом.
Они состоят из защитных механизмов, которые влияют на репликацию
фагового генома, транскрипцию, трансляцию, упаковку или сборку фаговой
частицы. Эти системы более широко распространены, чем обычно считалось;
например, более 20 систем уже были охарактеризованы у лактококков
(CoffeyandRoss, 2002). Каждая система обычно требует экспрессии одного или
двух генов, и были обнаружены некоторые сходства между генами. Тем не
менее мало что известно о точном способе действия белков АЫ.
Потенциал каждого антифагового защитного механизма требуется
тщательно оценивать в экспериментах, потому что не все системы могут
противостоять фаговым атакам в производстве. В идеале эффективность
системной защиты {эффективность посева (ЕОР, efficiencyofplating) - титр
контрольного фагового лизата, определяемый на устойчивом штамме,
содержащем антифаговую систему, деленный на титр на чувствительном
штамме] должна быть проверена для ных групп фагов. Сильный механизм
защиты будет давать ЕОР в районе 10 КЕ9 будет максимальной технически
153
измеримой «силой». Системы, спечивающие ЕОР от 10 4 до 1СИ, считаются
системами средней силы, тогда слабый антифаговый барьер дает ЕОР в районе
от 10 ’до 10'3. В молочной мышленности прибегают к сильным и средним
системам, так как слабые низмы могут не обеспечить достаточной защиты в
ходе ферментативных цессов (Moineau, 1999). Другой путь измерения
эффективности антифаговой мы осуществляется с помощью анализа,
основанного на эффективности ментации молока. Улучшенный штамм
инкубируют в присутствии фага мпературном режиме, копирующем
производственный процесс. Если его фаговая система защищает штамм от
высокой начальной концентрации фагов 106б.о.е./мл), она, вероятно,
эффективна в условиях завода. Интересно, что ктивность антифаговых систем
подвержена температурным воздействиям, рые механизмы менее эффективны
при температуре больше 37°С. Таким ом, тип молочной ферментации, для
которого бактериальный штамм был фицирован, тоже будет влиять на
суммарную оценку барьера устойчивости. Многочисленные естественные
антифаговые защитные механизмы могут ироваться для усиления суммарной
фаговой устойчивости конкретного а. В дополнение было предложено
чередование изогенных производных ;ов, содержащих разные механизмы
устойчивости (SingandKlaenhammer, ). Тем не менее из-за выдающихся
эволюционных способностей (посредством мутаций или обмена модулями с
другими фагами или хозяйской ДНК) могут преодолевать эти защитные
механизмы (BouchardandMoineau, '. Следовательно, необходимы новые
стратегии для обеспечения длительной защиты в штаммах бактерий, важных
для пищевой промышленности.
Использования BIMsили LAB, сохраняющих естественные механизмы й
устойчивости, недостаточно, к настоящему времени стало возможным е новых
антифаговых систем. Например, в последнее десятилетие ые генетические
элементы фагов стали источником защитных свойств , 1999). Одна система
такого типа, названная Per (phage-encodedresis- включает клонирование точек
начала репликации фагов в высококопийной е в бактериальной клетке
154
(Hilletal., 1990; O’Sullivanetal., 1993). Эти репликации мешают размножению
вируса, конкурируя за белковые трансформации фагочувствительного
штамма, обладающего желаемыми ферментативными свойствами, в
фагоустойчивый. И, наконец, фаговая популяция внутри завода способна
меняться со временем; таким образом, меры контроля должны периодически
пересматриваться.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ В ЦЕПИ ПРОИЗВОДСТВА
ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ
Применение фагов для снижения контаминации пищевыми патогенами
домашнего скота и гидробионтов
Со времен открытия бактериофагов в 1915-1917 годах их применяли для
предупреждения и лечения бактериальных инфекций. Хотя фаговая терапия
исторически связана с использованием бактериофагов в медицине человека,
фаги также широко применялись в ветеринарии и разнообразных
сельскохозяйственных производствах. История и различные аспекты фаговой
терапии у людей описаны в 14 главе этой книги. В данной главе мы
рассказываем о прошлом и настоящем использования фагов для
предотвращения и лечения возникающих естественно и экспериментально
вызванных инфекций у животных. Кроме того, мы обсуждаем возможное
использование фаговой терапии в различных сельскохозяйственных областях,
включая потенциальное значение бактериофагов в улучшении сохранности
продуктов, предупреждении пищевых отравлений бактериальной этиологии и
их возможную роль в снижении использования антибиотиков в скотоводстве.
Первое упоминание о терапевтическом использовании фагов в
ветеринарии связано с именем Феликса д’Эрелля, одного из
первооткрывателей бактериофагов. Весной 1919 г. во Франции в регионе
Acris-sur-Aube была отмечена вспышка птичьего тифа у кур. Д'Эрелль
осмотрел несколько мертвых птиц, выделил и определил возбудителя болезни
155
- Salmonella gallinarium. Д'Эрелль также выделил бактериофагов из погибших
кур, и протестировал их эффективность в предупреждении и лечении S.
gallinarium инфекций на шести экспериментально зараженных птицах
(d'Herelle, 1921, 1926). Результаты исследования были многообещающими:
применение фагов предотвратило гибель птиц от бактериальной инфекции,
тогда как две контрольные курицы, не получившие фагов, умерли после
однократного введения возбудителя.
Подающие надежды результаты этого маленького пилотного
исследования подсказали д'Эреллю мысль о немедленном проведении более
масштабных исследований, которые он назвал экспериментами по
иммунизации. Сто кур были инфицированы S. gallinarum и 20 из них
«иммунизированы» специфичным фагом S. gallinarum 20 иммунизированных
птиц выжило, тогда как 60 (75%) не обработанных фагом птиц погибло.
Вдохновленный этими результатами (и результатами подобных исследований
с кроликами и буйволами), д'Эрелль впоследствии использовал других фагов
из своей коллекции для лечения дизентерии у людей (см. главу 14). Также
результаты его исследований по фаговой профилактике и лечению птичьего
тифа подтолкнули других ученых к изучению пользы бактериофагов в
предупреждении и лечении различных естественных или экспериментальных
бактериальных инфекций у животных. Как рассказывается далее, опубликованные результаты этих исследований сильно различались в зависимости
от инфекционного агента, животных, и литической силы бактериофагов.
Первой животной моделью, использованной в нескольких
исследованиях фаговой терапии, был мышиный сальмонеллез - системное
заболевание, вызываемое у чувствительных мышей несколькими видами
Salmonella, включая S. typhimurium, S. enteritidis, S. dublin, S. choleraesuis и S.
abortus. Например, Топли с коллегами (1925) использовали штамм S.
typhimurium для измерения эффективности фагового лечения
экспериментально зараженных мышей. После заражения бактериями мыши
получили фага per os, далее фиксировались уровень смертности и
156
распространение бактерий у мышей, получавших и не получавших фага. В
отличие от д'Эрелля, авторы обнаружили, что фаговые инъекции не снизили
уровень смертности или бактериального распространения.
Более того, исследования Топли с коллегами (1925) выявили, что
интраперитонеальные (i.p.) инъекции их фага снизили распространение S.
typhimurium инфекции среди мышей незначительно. Несколько факторов
могли способствовать провалу фагового лечения в этих двух исследованиях,
включая использование фагов, которые не были высоко эффективны против
инфекционного штамма S. typhimurium, на самом деле фаг, очевидно, не мог
полностью лизировать тот штамм in vitro (Topley and Wilson, 1925). Инъекция
антитифоидного фага с хорошей активностью in vitro против гамма
возбудителя мышам перед заражением бациллами тифа дала отличную
защиту, как сообщил Fisk (1938). Мыши, инъецированные фагом, были
защищены в течение 24 часов; фаговая терапия, начатая спустя 4 часа после
заражения, также защитила мышей. Защита не наблюдалась, если фаг был
инактивирован нагреванием (70°С, 50 мин), таким образом показывая, что для
эффективности препарата необходимы активные «живые» фаги.
В некоторых ранних исследованиях (Arnold and Weiss, 1926; Asheshov et
al., 937) авторы одновременно давали животным бактерий и фагов - подход,
который может не быть значимым в ситуациях реальной жизни, и может
давать Заманчивые результаты. В таком случае взаимоотношения фаг - хозяин
проявлялся очень быстро. Обычно фаговый лизис занимает 20-40 минут, а
прикрепление фага к бактериальной мембране (и последующая инъекция ДНК
фага) может осуществляться в течение нескольких секунд или минут. Таким
образом, смешивание бактерий и фагов перед введением животным смеси
может давать результаты, скорее отображающие взаимодействия бактерий и
их вирусов in vitro, чем результаты, относящиеся к эффективности фагов в
предупреждении или лечении бактериальных инфекций in vivo.
Ранние попытки фагового лечения экспериментально вызванных
стафилококковых и стрептококковых септицемий у кроликов и мышей были
157
признаны неудачными несколькими исследователями (Clark and Clark,1927;
Krueger et al., 1932), включая Георгия Элиаву (1930), из Института
исследования бактериофагов в Тбилиси, Грузинская ССР (см. главу 14). Также
много попыток лечения экспериментальной чумы у кроликов, морских свинок,
крыс и мышей не повлияли на курс течения болезни (Naidu and Avari, 1932;
Compton, 1930; 1928; Colvir 1932). Более того, в отличие от ранних
экспериментов д’Эрелля, Pyle (1926) доложил о безрезультативности фагового
лечения птичьего тифа, хотя он использовал фаги с высокой активностью in
vitro против возбудителя. С другой стороны введение фагов в сонную артерию
значительно снизило смертность кроликов npi экспериментальном
стрептококковом менингите (Kolmer and Rule, 1933). Также, цистит,
вызванный Е. coli, у кроликов и морских свинок (Marcuse, 1924; Larkum 1926),
был вылечен или значительно ослаблен применением фагов. Более того
превосходные результаты были отмечены Dubos и коллегами (1943), которые
использовали интраперитонеальное введение защитного фага для лечения
экспериментальной интрацеребральной инфекции мышей Salmonella
dysenteriae.
Сальмонелльные инфекции
После ранних работ д'Эрелля (1921; 1926) и других исследователей
(Topley and Wilson, 1925; Fisk, 1938) инфицированные сальмонеллой
животные стали одной из самых широко используемых моделей для изучения
профилактического и терапевтического значения бактериофагов in vivo.
Например, Berchieri и коллеги (1991) изолировали несколько вирулентных для
S. typhimurium бактериофагов из кур, куриного корма и сточных вод Англии,
протестировали их эффективность в лечении экспериментальных инфекций,
вызванных S. typhimurium у кур. Штамм возбудителя вызывал смертность
примерно 53% необработанных фагом кур, и введение некоторых их штаммов
привело к статистически значительному снижению гибели птиц. Один из
наиболее эффективных фагов, (р2.2, сильно снижал (i) смертность, вызванную
двумя другими вирулентными штаммами S. typhimurium и (ii) титры бактерий-
158
возбудителей в пищеварительном тракте кур. Например, после его
применения происходило снижение титров патогенных бактерий в зобе,
тонком кишечнике и слепой кишке на порядок спустя 12 часов после
заражения, и такое же снижение титров возбудителя в печени через 24 и 48
часов после инфицирования.
Авторы предположили, что этот уровень может быть клинически
значимым из-за сравнительно небольшой ЛД50 штамма возбудителя,
составляющей всего 103 к.о.е. Несколько фагоустойчивых колоний бактерий
были выделены из содержимого слепой кишки кур; однако они оказались
ослабленными с точки зрения патогенного потенциала (например, были
авирулентными или менее вирулентными). Также никаких антител,
нейтрализующих фага, не было обнаружено в сыворотке забитых на 32 день
после инфицирования кур. Результат указывает на то, что инокулированный
фаг, который был вирулентным in vitro, сохранялся в кишечнике, пока титр
Salmonella оставался высоким. Во всех случаях для получения
положительного терапевтического эффекта требовалось введение препаратов
с высоким титром фага.
Время фагового лечения было также важно: например, применение
фагов вскоре после инфекции было значительно более эффективным, чем при
задержке лечения. В то время механизм этой временной зависимости был
неясен. Так как Salmonella - это внутриклеточный возбудитель, одним из
возможных объяснений этого результата могло быть то, что раннее
применение фагов убивает большинство сальмонелл в кишечнике, прежде чем
они проникнут в клетки, и, таким образом, будут защищены от фагового
лизиса.
Новые исследования этой проблемы, возможно, позволят прояснить эту
проблему и дадут информацию, необходимую для формирования концепций,
оптимального создания и осуществления фаговой профилактики и терапии
сальмонеллезов у разных важных для сельского хозяйства животных.
Эшерихиозы
159
Исследования Смита и Хаггинса
Е. coli может вызывать несколько типов неинвазивных энтеритов и
септицемий у различных видов животных. Поэтому начальные исследования
возможного терапевтического значения фагов у животных сфокусировались
на инфекциях, вызываемых кишечной палочкой, как, например, работа по
фаговой терапии циститов у кроликов и морских свинок (Larkum, 1926). После
длительного отсутствия интереса к фаговой терапии инфицированные
кишечной палочкой животные снова появились в научной литературе как
важная модельная система для измерения эффективности фагов. Возможно,
самыми известными исследованиями в области фаговой терапии в
ветеринарии являются работы лаборатории Герберта Уильямса Смита с
коллегами в институте исследования заболеваний животных (Institute for
Animal Disease Research in Houghton, Cambridgeshire, Great Britain). Их ранняя
работа была направлена на септицемию у мышей, вызванную штаммом Е. coli
018:К1:Н7 ColV+, выделенным от ребенка с менингитом (Smith and Huggins,
1982). Некоторые из фагов, использованные в ходе этого исследования, были
специфичны к поверхностному антигену К1 - главному фактору
вирулентности их хозяйского штамма Е. coli. Однократное внутримышечное
введение одного К1-специфичного фага было более эффективно, чем
многократные внутримышечные инъекции различных антибиотиков
(тетрациклина, ампициллина, хлорамфеникола или триметоприма с
сульфафуразолом) для защиты мышей от потенциально смертельной дозы
возбудителя, введенной внутримышечноили интрацеребрально. Показано, что
фаговое лечение было также эффективно, как и множественные инъекции
стрептомицина внутримышечно. Эксперименты по определению титров фагов
и бактерий в различных тканях животных выявили, что фаги сохраняются в
крови 24 часа, и такой же высокий фаговый титр (106 б.о.е./г ткани) отмечался
несколько дней в селезенке. В ходе исследования удалось идентифицировать
несколько фагоустойчивых мутантов бактерий, однако они обладали
фенотипом К', поэтому были менее вирулентны, чем штаммы дикого типа К+.
160
Прием фагов за 3-5 дней до инфицирования кишечной палочкой также
защищал мышей от экспериментально вызванной инфекции, хотя защитный
эффект фагов, выращенных на разных бактериальных штаммах, заметно
различался.
Впечатляющие результаты, полученные в ходе начальных
исследований, побудили авторов распространить исследования на другие
виды животных.
В процессе второго исследования Смит и Хаггис (1983) обнаружили
терапевтическую и профилактическую эффективность Е. co/z'-специфичных
препаратов бактериофагов при неонатальных энтеритах у телят, поросят и
ягнят. В экспериментах на телятах 71 теленок был заражен орально Зх 10? КОЕ
энтеротоксичного штамма Е. coli О9:К30.99. 57 из 71 теленка кормились
молозивом; они были подвержены поносу, но устойчивы к септицемии. Телята
были разделены на 6 групп, 4 из которых были обработаны смесью двух
разных фагов. Ни один из девяти телят, леченных фаговой смесью (10п БОЕ 8
часов спустя, не заболел. В дополнение к этому только 2 животных погибли в
группе из 13 лишенных молочного питания телят, которые получили фагов i
момент начала диареи.
Для сравнения: уровень смертности в контрольной группе телят, не
получавших фагов, был 93% - из тех, что питались молозивом, и 100% среди
лишении молозива. Если назначение фагового лечения откладывалось до н;
чала поноса, заболевание не предотвращалось; тем не менее, как тяжесть боле
ни, так и смертность была значительно снижена. Фаг не смог полностью
уничтожить штамм патогенной Е. coli в кишечнике, но снизил его
численность, уровня ниже того, который необходим для развития заболевания.
Фаг оставал в кишечнике до тех пор, пока количество клеток хозяйского
штамма coxpaнялось высоким, и затем исчезал. Похожие процедуры с другими
специфически препаратами фагов были эффективны для защиты поросят и
ягнят от заражев их энтеротоксичными штаммами Е. coli 020:К101.987Р и Е.
coli 08:К85.99 ответственно. Никаких фагоустойчивых мутантов у ягнят не
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]