Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Бактериофаги. Учебно-методическое пособие
.pdf
91
коньюгативные плазмиды группы несовместимости IncP.Фаг использует
продукты плазмидных генов конъюгативного переноса, а точнее, белки
формирующего конъюгационные пары фагового рецепторного комплекса Mpf
(maitingpairformation), который соединяет цитоплазматическую и внешнюю
мембраны и принадлежит к IV типу систем секреции. Фаг может
адсорбироваться с помощью шипиков на углах своего капсида. Его адсорбция
зависит от внутриклеточного уровня АТФ. Во время инфекции фаговая
внутренняя мембрана формирует трубкообразную структуру, которая
пересекает клеточную стенку и сливается с внутренней мембраной. Около 10
из 20 ее структурных белков PRD1 внедрены в мембрану; с использованием
различных мутантов фага удалось уточнить роль отдельных белков на
различных стадиях ифекционного процесса.
Механизм инфекции PRD1 очень отличается от такового у РМ2, фага из
семейства Corticoviridae,который поражает морские виды Pseudoalteromonas.
РМ2 также обладает внутренней липидной двуслойной мембраной и
адсорбируется на клеточной стенке, но особенности его инфекционного
механизма пока не описаны.
РЕПЛИКАЦИЯ ФАГОВОЙ ДНК ПРОЦЕСС РЕПЛИКАЦИИ
Точный процесс репликации своего генетического материала является
одной из самых важных задач, стоящих перед любым организмом. Громадное
разно- образие молекулярных механизмов, которые фаги используют для
репликации, рекомбинации и репарации, предоставило нам большой объем
знаний о фундаментальных процессах синтеза ДНК: о том, как фаги
адаптируют хозяйские механизмы, и о том, как они используют собственные
репликативные аппараты. Большая часть умеренных фагов полностью или в
большой степени зависит от хозяйской репликативной системы как на своей
литической стадии, так и при репликации в виде профага. Обычно они
используют рекомбинацию или комплементарное слипание липких концов
ДНК для циркуляризации генома сразу после инфекции - необходимый шаг
для интеграции в хозяйскую хромосому путем рекомбинации, если они
92
собираются идти лизогенным путем; в ходе своего литического цикла они
также используют стандартный бактериальный 0-тип реплика- I кольцевой
ДНК, по меньшей мере на начальных этапах. Некоторые позднее нерируют
длинный линейный конкатамер для упаковки, переходя к репликации
механизму катящегося кольца (сг-тип репликации). Напротив, большая часть
литических фагов кодируют свои собственные ДНК-полимеразы и
реплицируются как линейные молекулы, решая проблемы репликации концов
благодаряя рекомбинации и созданию последовательного соединения многих
геномов, них при упаковке отрезаются фрагменты, соответствующие емкости
полно заполненной головки (headfiil-механизм), обычно несколько более
длинные, уникальная последовательность генома.
Начало репликации ДНК обычно происходит в точке - ориджине
репликации (originofreplication). Особые свойства таких oriучастков включают
в себя связывающие сайты для специфических белков-праймеров и
примыкающие к ним АТ-богатые последовательности, которые помогают
раскручивать ДНК. Некоторые фаги содержат уникальный ori (phageX), в то
время как остальные обладают несколькими ориджинами репликации, на
которых могут работать различные механизмы инициации репликации и
которые могут использоваться фагом в различных условиях (фаги Т4, Т7 и Р4).
На участке ориджина синтезируется короткий РНК-праймер, для чего
возможно использование специальной прай- мазы, или РНК-полимеразы, или
Rep-белки могут генерировать ДНК-праймер благодаря внесению
однонитевого разрыва. Если синтез праймера производит праймаза,
инициаторные белки стимулируют сборку препраймосомы на сайте oriили на
предсуществующей разветвленной матрице, которая, например, создается во
время рекомбинации при обмене гомологичными цепями. Если используется
РНК-полимераза, механизм инициации репликации может быть быстро
заблокирован, так как многие фаги вызывают модификации РНК-полимеразы
хозяина на ранних этапах инфекции. Например, Т4 переключается на
использование рекомбинационных промежуточных продуктов, формируя
93
большой, сильно разветвленный репликационный комплекс. Загрузка ДНКполимеразы на праймер требует гидролиза АТФ и часто опосредована
специальным белком - загрузчиком и «скользящим зажимом»
(slidingclampprotein); к тому же во время инициации процесса топоизомеразы
участвуют в раскручивании ДНК.
ДНК-полимеразы могут только добавлять нуклеотиды на свободную
гидроксил-группу соответствующего полинуклеотида или белкового
праймера, расположенного на матрице. Это необходимо, потому что
комплементарное спаривание оснований, на котором основано удвоение ДНК,
зависит от точного позиционирования и расположения каждого нуклеотида.
Далее: ДНК-репликация всегда происходит от 5’- к 3’- концу с
использованием 5’-дезоксирибонуклеотидтри-фосфатов (dNTPs), таким
образом, энергия поступает на входящем субстрате, ане из растущей цепи; это
означает, что для синтеза цепи в другом направлении необходим специальный
механизм - отстающая цепь. Этот механизм состоит из прерывающегося
синтеза фрагментов Оказаки, которые затем соединяются. Процесс синтеза
ДНК сопровождается постоянным исправлением случайных ошибок,
необходимым для поддержания уровня спонтанных мутаций в приемлемом
диапазоне, несмотря на то, что каждый вставляемый нуклеотид проверяется
на соответствие матрице. Поэтому большинство ДНК-полимераз обладают
корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, которая позволяет
удалить неправильно вставленный нуклеотид.
Процесс репликации должен быть интенсивным, а синтез ведущей цепи
должен дойти до завершения без какой-либо остановки и повторного старта.
В случае фагов, чьи геномные ДНК часто организованы в цепь (конкатемер),
это может означать процессивность вдоль всей молекулы, длина которой во
много раз превышает длину единичного генома (обычно в 6-8 раз.), в то время
как отстающая цепь, использующая ту же полимеразу, прерывается примерно
каждые тысячу нуклеотидов.
Для уточнения полученных данных о механизмах репликации ДНК был
94
проведен ряд экспериментов, использующих комбинации генетических,
биохимических и биофизических методов применительно к бактериофагу Т4,
в реплисоме которого ферменты, синтезирующие ведущую и отстающую цепи
физически в единый белковый комплекс (сходная организация характерна и
для реплисом бактерий). На нем было показано, что только полимераза и
белок, стабилизирующий ее ассоциацию с ДНК (скользящий зажим),
требуются для высокопроцессивного синтеза ведущей цепи. Белок-зажим
должен быть прикреплен заново для начала синтеза каждого фрагмента
Оказаки (Trakselisetal., 2001; Pietronietal., 2001). Для синтеза отстающей цепи
требуются вдобавок белок, связывающийся с однонитевой ДНК, хеликаза для
раскручивания ДНК (она необходима и для синтеза лидирующей цепи на
исходно дву- нитевой матрице), праймаза для инициации синтеза фрагментов
Оказаки, 5’-3’экзонуклеаза для удаления праймеров (или RnaseH, или
хозяйский фермент, подобный Е. coli DNA-полимераза I [polI]), а также ДНКлигаза для сшивания фрагментов Оказаки.
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы найдены к настоящему времени в
шести надсемействах или классах белков, с очень сложной филогенией и
паттернами распределения по царствам (Fileeetal., 2002). Шесть различных
типов ДНК-полимераз столь различны по размеру, форме и
последовательности, что это позволяет предполагать, что полимеразы
возникали более чем единожды в процессе перехода от мира РНК к миру ДНК.
Возможно, сначала они давали защитные модификации вирусной РНК
(Koonin, 2003), тем не менее многократный горизонтальный обмен между
ними имел место в течение всего периода эволюции. Все известные фаговые
ДНК-полимеразы попадают в классы А и В, в то время как семейство
PolIIIбактериальных репликационных ферментов попадают в класс С.
Семейства А-, В- и С-полимераз обладают различающимися доменами для
полимеризации и 3'-5' экзонуклеазной активности, которая определяет
правильность репликации и уровень спонтанных мутаций; семейство А
обладает, кроме того, третьим доменом с 5-3' экзонуклеазной активностью. Е.
95
coli PolI, наиболее изученный представитель семейства А, в основном отвечает
за репарацию ДНК и удаление праймеров, но ее гомологи катализируют
репликацию у многих фагов. Семейство В или а чаще всего является основной
репликативной полимеразой эукариот, их вирусов и архей, но также включает
некоторые необычные репарационные ферменты гамма-протеобактерий.
Интересно, что и Е. coliPolII и Т4 ДНК-полимераза принадлежат к этому
классу, но фермент Т4 больше похож на В-подобные полимеразы
галофильных архей Halobacteriumи их вирусов HF1 и HF2, чем на ферменты
Е. coli (Fileeetal., 2002).
РЕПАРАЦИЯ ДНК, РЕКОМБИНАЦИЯ И МУТАГЕНЕЗ
Основной механизм деградации свободных фаговых частиц в природе это повреждение их ДНК ультрафилоетовым излучением или активными
химическими соединениями. Фаги, обладающие наиболее подробно
изученной генетической системой, такие как Т4, используются для
исследования фундаментальных принципов мутагенеза и репарации, включая
механизмы естественного мутагенеза и факторы, определяющие частоту
спонтанных мутаций, которые возникают в процессе репликации ДНК
(DrakeandRipley, 1994). Многие фаги в большой степени или полностью
зависимы от хозяйских механизмов рекомбинации и репарации повреждений
ДНК, но некоторые из них имеют собственные механизмы, такие как
фотореактивация, эксцизионная репарация, рекомбинационно-зависимая
ДНК-репликация через поврежденные сайты (Cechetal., 1981;
KreuzerandDrake, 1994). Например, специальный фермент Е. coliотвечает за
фотореактивацию, во время которой пиримидиновые димеры, образованные
под действием ультрафиолетового облучения, преобразовываются в
нормальное состояние - мономеры. Напротив, эндонуклеаза V, продукт гена
Т4denV,является прототипом белков репарационного вырезания нуклеотидов.
Она обладает одновременно N-гликозилазной и основной лиазной
активностью, которая надрезает ДНК (формируя ковалентно связанные ДНКбелковые промежуточные продукты). В результате удаляются
96
пиримидиновые димеры для последующего ресинтеза участка ДНК ДНКполимеразами (например, Е. coliPolI), который осуществляется при участии
фагового белка, связывающегося с однонитевой ДНК (ssb). Глубокие различия
в чувствительности к ультрафиолету у фага Т4 и Т2 объясняются
присутствием denV,имеющимся у Т4 и отсутствующим у Т2. UvsXген Т4
кодирует гомолог RecA,главного белка гомологической рекомбинации,
необходимого для внедрения одноцепочечной ДНК в двуцепочечную;
uvsXмутанты чувствительны к облучению, поскольку они не могут выполнять
ДНК- репарацию, которая использует рекомбинацию для восстановления
потерянных ДНК участков. Некоторые из репарационных механизмов
являются источником ошибок: они сохранятют жизнеспособность фага ценой
высокой вероятности возникновения мутаций. И радиационное воздействие, и
большинство химических мутагенов вызывают мутации в основном
посредством склонной к ошибкам системы SOS-репарации как у клеточных
организмов, так и у фагов и других вирусов (DrakeandRipley, 1994).
Red-общая рекомбинационная система лямбдоидных бактериофагов очень интересна.Экзо- (Ехо) и бета- (Beta) белки системы Redосуществляют
рекомбинацию, которая восстанавливает двунитевые разрывы на основании
гомологии как минимум 30 н.п., в то время как белок Gamтингибирует
клеточную RecBCDэкзонуклеазу, которая иначе уничтожает однонитевые
фрагменты ДНК в клетке Е. coli.Это особые способности рекомбинационной
системы Redфага X были использованы для разработки мощной и широко
используемой новой технологии, получившей название рекомбинационной
инженерии (Recombineering) (Courtetal., 2002), с помощью которой различные
генно-инженерные конструкции могут быть собраны в плазмидах или прямо в
хромосоме Е. coliиз ПЦР-продуктов или синтетических олигонуклеотидов
благодаря гомологичной рекомбинации. Это о возможным, поскольку Redсистема эффективно рекомбинирует последовательности с короткой
гомологией вплоть до 35-50 нуклеотидных пар, в отличиеот значительно более
длинных участков гомологии, которые требуются для схожих систем
97
клеточных организмов. Хотя известно много методов трансформации,
которые позволяют ввести кольцевую плазмидную ДНК в клетки Е. coliдругих
бактерий, линейная ДНК быстро уничтожается ферментом RecBCD;
возможность использовать линейную ДНК для трансформации экспериментах
создает трудности, например, для получения штаммов с нокаутированными
генами. Лаборатория Курта и другие создали системы, которые временно
экспрессировали белки системы Red. Эти Яеё+-клетки эффективно
рекомбинировали бактериальную хромосому с вводимыми линейными
кусками ДНК с гомологичными нуклеотидными последовательностями в 3050 н.п. Замены возникают с частотой 0,1%, нокауты и другие манипуляции
могут быть проведены даже без селективного маркера подобного
устойчивости к хлорамфениколу (CmR).
ТРАНСКРИПЦИЯ
Большая часть механизмов регуляции развития фага действуют на
уровне транскрипции. Гены, транскрибируемые немедленно после инфекции,
часто служат для реструктуризации обмена хозяина для целей поддержания
процесса фагового инфекционного процесса. Это может быть выбором
лизогенного или литического пути для умеренных фагов или полным
выключением хозяйской транскрипции, трансляции и репликации у Т4 и SP01.
Группа отсроченно ранних/средних генов отвечает преимущественно за
процесс репликации фаговой ДНК, за ними следует транскрипция поздних
генов, которые кодируют компоненты вириона и требующиеся для его сборки
белки, а аткже белки лизиса клетки. Многие фаги кодируют одну или
несколько новых РНК-полимераз для облегчения этого процесса; другие
просто осуществляют серию модификаций хозяйской РНК-полимеразы
(RNAP). Регуляторные механизмы фагов обнаружены для каждого этапа
транскрипции: инициации, элонгации и терминации, и изучение этих
механизмов весьма способствовало нашему пониманию процесса
бактериальной транскрипции.
Большое количество фагов кодируют свои собственные РНК-
98
полимеразы, которые очень полезны и как реагенты для молекулярной
биологии, и как модели для исследования фундаментальных механизмов
транскрипции. Эти состоящие из одной субъединицы полимеразы гораздо
меньше и двигаются обычно быстрее, чем крупные составные полимеразы
(msRNAPs) бактерий и эукариот, являются высокоспецифичными к
определенным промоторам и не требуют дополнительных белковых факторов
для идентификации своих промоторов и транскрипции. Схожие РНКполимеразы обнаружены у прокариотических вирусов и в митохондриях
(Cermakianetal., 1996; Rousvoaletal., 1998), что вызывает интересные вопросы
об их происхождении и эволюции; они также родственны обратным
транскриптазам и PolI (А) семейству ДНК-полимераз. Важно, что
биохимические механизмы инициации, элонгации и терминации сходны с
таковыми у msRNAPs. Наиболее хорошо изученной является 883аминокислотная полимераза, кодируемая бактериофагом Т7, чья скорость
транскрипции составляет более чем 200 оснований/сек при 37°С - в пять раз
быстрее Е. coliRNAP. Структура фермента напоминает правую руку человека
с активным сайтом, расположенным в ладони. Промотор, который она
распознает, расположен от -17 до -5, где фермент связывается с одной из
сторон закрытого дуплексного промотора с помощью пары петель, которые
определяют специфичность.
В результате элегантного кристаллографического исследования был
определен механизм этого сложного «молекулярного мотора», действующий
с использованием специфических комбинаций олигонуклеотидов для
имитации взаимодействующих нуклеиновых кислот на каждой стадии
процесса. Cheethamс Steitz(1999) и Yinс Steitz(2002) описали структуру
комплекса инициации (рис. 7.13, А и С). После связывания, которое
использует «петлю специфичности» на RNAP, образованную остатками 740770, «пальцы» частично закрываются на ДНК. Шпилька из остатков 230-240
способна отделить цепи ДНК друг от друга на верхнем конце
транскрипционного пузыря, после чего происходит добавление первых
99
нескольких нуклеотидов, но формирование ДНК/РНК-дуплекса длинее чем 3
нуклеотида стерически затруднено. Образование стабильного элонгационного
комплекса происходит к моменту, когда растущий транскрипт достигает 12-14
нуклеотидов и требует сильных конформационных изменений с
освобождением сигма-фактора, созданием канала для растущей РНК-цепи.
Эта конформационная перстройка создает структурную основу для высокой
процессивности транскрипционного процесса. Механизм, отвечающий за
высокую точность выбора оснований, был определен Темяковым (Temiakov,
2004), который показал, что спаривание с матричным основанием происходит,
когда фермент еще находится в «открытом» состоянии, перед формированием
каталитически активной «закрытой» конформации; это сильно отличается от
того, что наблюдают у родственных ДНК-полимераз, но сравнение с данными
о структуре msRNAPдает основание предположить, что здесь работает
похожий механизм.
Исследования Т7 РНК-полимеразы также играет важную роль в
определении энергетических механизмов, движущих эту молекулярную
машину. Сравнивая структуру, в которой входящие нуклеотиды связываются
с транскрипционным комплексом непосредственно до реакции, со структурой,
в которой связывание происходит после добавления нуклеотида, но до
высвобождения из комплекса отщепленного пирофосфата, Yinи Steitz(2004)
привели доказательства того, что конформационные изменения полимеразы
связаны с диссоциацией пирофосфатов, которые ведут к ее перемещению
вдоль ДНК и разделению цепей ДНК.
Один из факторов, осложняющих координацию процессов при вирусной
инфекции, состоит в том, что репликация и транскрипция происходят
одновременно на одной и той же матрице с разными скоростями. Репликация
обычно в десять раз быстрее, чем транскрипция, а последняя также высоко
процессивна. При этом транскрипт может быть произведен только начиная с
промотора, и большое число неполных транскриптов способно создать
разнообразные проблемы. Liuи Alberts(1995) показали, что как минимум для
100
Т4 реплисомы есть возможность прохода активно транскрибирующей РНКполимеразы как в попутном, так и во встречном направлении, без диссоциации
любого из ферментов или даже большой задержки их функционирования. Они
обнаружили, что в случае лобового столкновения РНК-полимераза переходит
на вновь синтезируемую цепь, вместо того чтобы оставаться на старой,
являющейся в данном случае запаздывающей цепью, которая остается
одноцепочечной до синтеза нового фрагмента Оказаки.
ФАГОВЫЕ РНК:СТРУКТУРА И НЕОЖИДАННЫЕ ФУНКЦИИ
Еще совсем недавно РНК рассматривали в основном как
информационную макромолекулу, хотя было известно о существовании
рибосомальной РНК, создающей структуру рибосомы, и транспортной РНК.
Эта точка зрения начала меняться с открытием рибозимов - РНК,
выполняющих энзимоподобные каталитические функции (Cechetal., 1981), и
мнение о начальных стадиях эволюции жизни изменилось. Ниже мы
подробнее рассмотрим информацию о «новом мире РНК».
СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ САЙТОВ СВЯЗЫВАНИЯ
РИБОСОМ
Большинство механизмов регуляции синтеза фаговых белков на уровне
трансляции используют вторичные структуры РНК, которые оказывают
воздействие на доступность сайтов связывания рибосом; во многих случаях на
эти структуры оказывают влияние факторы внешней среды. Колифаги
сыграли исключительно важную роль в определении вовлеченных в этот
процесс факторов. Как минимум шесть элементов могут оказывать
воздействие на формирование комплекса инициации трансляции мРНК-ЗОБ субъединица - fMet-tRNAf. Он включает в себя кодон инициации трансляции,
обычно AUG, но это может быть и GUG, UUGили AUU; последовательность
Шайн-Дальгарно (SD), участок, включающий какую- то часть канонической
последовательности UAAGGAGGU, комплементарной З'-концу 16SрРНК;
спейсер SD-инициаторный кодон, размером в 5-13 нуклеотидов с оптимумом
в 6-8. Также в образовании комплекса могут участвовать другие
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]