Рис. 6.6. Алгоритм бактериологического метода
Рис. 6.7. Этапы накопления чистой культуры и ее идентификации
возбудителя. Прингококковоймени инфекции бактериемия наиболее и первые часы болезни, а в течение вторых и третьих суток р отсутствие антибактериальной терапии.
51
Во-вторых, существенное значение для эффективности бактери диагностики имеетсоблюдение правил забора материала для исслед забор крови, мочи, слизи, кала должен осуществляться в ст перед этим обеззараживалась путем термической обработки, дезинфицирующих средств. ченьПри этомважно производить забор био материала из места наиболее вероятного нахождениякраев налетоввозбуди на миндалинах, кожных поражений, язв кишечника, спинномоз пунктата гнойных очагов. Наружные покровы риалавместе(иззаборавены, артерии, местного очага) должны быть тщательно обработаны этиловым спиртом) во избежание попадания в просвет иглы а Очень важное значение имеет отсутствие в исследуемом мате роста бактерий,жде превсего, антибиотиков, которые резко снижаю 2-3 раза) вероятность высева возбудителя. По этой причине исследование нужно производить немедленно при поступлении от времени суток до назначениятиков.антибио
В бактериологической диагностике играет существенную роль питательных сред для исследования в соответствии с предпо и их качество: среда должна быть сертифицирована, пригото технологии,нитьсяхра при соответствующей температуре в предел
Материал для бактериологического исследования должен дост лабораторию с соблюдением правил транспортировки. Наилучш предупредить гибель предполагаемого яетсявозбудитпосевля наявлосновну питательную среду или на транспортную среду у постели бол случаях следует максимально сократить сроки доставки мате предохранить его от загрязнения, охлаждения и высыхания.
Рис. 6.8. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
исследования материал хранится в стерильной посуде с герм термостате при 37 °С, перевозится при той же температуре транспортном обогревателе.
52
Очень важной составляющей частью бактериологической диагност являетсяопределение чувствительности возбудителя к антибиотикам, способы которог довольно разнообразны (рис. 6.8).
Несмотря на многообразие существующих методов и их оценки наиболее эффективных антибиотических препаратов для лечения и заболеваний, существуют определенные проблемы в реализаци бактериологического исследования. Главная из них заключае выделение чистой культуры, предшествующееувствительностиопределению ч к антибиотикам, занимает относительно большой- в среднемпериод временоколо- 3 дней. В связи с этим такие важные для лечебного процесс
врачу с большим опозданием. По этой причине особый интере автоматизированные способы определения чувствительности возб антибиотикам.
Приборы, используемые для определения чувствительности к позволяют работать не только с чистой культурой, но и с и материалом. В этом случаеениеопрлекарственнойдел устойчивости во происходит автоматически без выяснения видовой принадлежн исследование занимает от 2 до 6 ч.
МИКОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Микологический метод, применяемый в диагностике грибковых основанный на использовании искусственных питательных сред др.), имеет множество особенностей, отчасти отраженных в чистых культур при микозах (рис. 6.9). Этот метод обязате микроскопическим исследованиеэтом,особоепр значение придают ди грибових способности-разнпому проявлять свои свойства в парази сапрофитической фазе.
Рис. 6.9. Алгоритм микологического метода
Недостатком микологического метода следует считатьую доволь продолжительность исследования, поскольку грибы растут на значительно медленней бактерий. В связи с этим микологиче растягивается-10додней6 .
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
53
Вирусологический метод отличаетсябиологическийтем, что материал, предположительно содержащий вирусы, используется для зара эмбриона, культуры клеток или культуры органов лабораторн принципиально изменяет алгоритм проводимого исследования
Если исследуемыйматериал содержит постороннюю микрофлору, его предварительно обрабатывают антибиотиками. Культивировани после их заражения осуществляется-8 дней,втечениекультур5 - вткантеченией- 5 6 дней, а общая продолжительность говирусологическоисследования составл 3 нед, что в большинстве случаев позволяет поставить лишь диагноз.
Такие феномены как цитопатогенное действие вируса на ткан культивирования, бляшкообразование (образованиетканей),очагов ра цветная проба (отсутствие закономерного изменения цвета с живого возбудителя), полученные при различных разведениях материала для заражения, позволяют не только обнаружить в его примерное количество, т.е. провести титрование вируса.
Завершается вирусологический метод идентификацией вируса серологических реакций как реакция нейтрализации (РН) дей ткань, реакция торможения гемагглютинации (РТГА)ов, куриныхреакция связывания комплемента (РСК), реакция иммунофлюоресценции
Оценивая диагностическое значение вирусологического метод подчеркнуть, что оно -невеликозадлительностииз диагностического исс необходимостиержатьсод специализированную вирусологическую ла строгого режима. В связи с этим вирусологический метод ча мониторинга циркулирующих штаммов различных вирусов, в ча гриппа, гепатитов.
54
Рис. 6.10. Алгоритм вирусологического метода
Биологический метод
Биологический метод (биопроба) заключается в выделении возбудителя из биологического материала или идентификации его токсинов путем заражения лабораторных животных, высоко восприимчивых к данному возбудителю и чувствительных к действию его токсинов. В современных условиях метод биопроб в силу своей дороговизны и опасности применяется преимущественно как первый этап обнаружения и идентификации возбудителей особо опасных инфекций.
Несмотря на то, что среди диагностических возможностей этого метода ранее отмечали выделение и идентификацию чистой культуры, в настоящее время биологический метод с этой целью не используют, а применяют для накопления или обогащения биологического материала соответствующим микроорганизмом.
Биологический метод имеет ведущее значение при идентификации бактериальных экзотоксинов (ботулинического, столбнячного).
На основе биопробы можно воспроизводить такие серологичес токсина или РН вируса, которые позволяют не только иденти возбудителя, но и способствуют обнаружению антител к экзо
55
Иммунологические методы
Иммунологические методы лабораторной диагностики инфекцио занимают значительное место в клинической практике и могу самостоятельное, так и вспомогательное значение.
МЕТОДЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ
Задачи, решаемые иммунодиагностическими методами, довольн целям постановки и включают сероиндикацию-циюсероиденвозбудителейифик а также серодиагностикуаллергодиагностику инфекционных болезней
Сероиндикация - обнаружение возбудителя в биологическом материа основе применения специфических антител к его видовым ант диагностическое направление, сероиндикацияпользуетсяширокоприисэкспредиагностике различных инфекционных заболеваний, а ее знач диагноза определяется качеством препарата из специфически регистрации результата исследования.
Сероидентификация не является самостоятельным методом диагностики инфекционных заболеваний, а является этапом бактериологич вирусологического методов, связанным с определением вида видовым антигенам. Этому исследованию предшествует выделе возбудителя,а сам процесс идентификации включает использовани специфических видов антител.
Серодиагностика - постановка диагноза путем обнаружения антител сыворотке крови и других биологических жидкостях как спец инфекционного процесса. Методическая основа такого диагнос исследования не очень однозначна в интерпретации. Она тре попадания возбудителя и, соответственно, выработки антите также факта высокой вероятностирисутствияп в организме больного «но антител, способных давать перекрестные реакции с антигена микроорганизма. Несмотря на это современнаясеродиаг
Рис. 6.11. Назначение методов иммунодиагностики
ностика составляетльнуюзначитечасть исследований по верификации клинике инфекционных болезней.
Аллергодиагностика основана на ориентировочном диагностировании процесса путем регистрации местной аллергической реакции, коже в месте введениямикробного аллергена. Тем не менее при нек
56
инфекционной патологии этот метод до настоящего времени н диагностического значения как скринингового теста.
Итак, направления диагностических исследований с использо иммунологических методов довольно разнообразны, как и сами с воспроизведения иммунологических тестов. Условно среди пр иммунодиагностики можно выделить следующие методы:
методы с использованием феномена перекрестного взаимодейс комплексов кции[реа агглютинации (РА), пассивной (непрямой) ге латекс-агглютинации, торможения гемагглютинации, преципитаци
методы с использованием феномена комплементарноголизиса);
методы, основанные на нейтрализующем действии(РН токсиана,тителРН вир
аллергические методы (внутрикожные пробы с микробными алл
методы иммуноанализов (иммунофлюоресцентный анализ, радио ИФА).
Среди методов с использованиемфеномена перекрестного взаимодействия иммунных комплексов наиболее доступными являются методы, основанные на агглютинации.
СущностьРА заключается в том, что в присутствии электролита комплексы, содержащие корпускулярные частицы антигена и а между собой и выпадаютезернистогов вид или хлопьевидного осадка, регистрируется визуально.
Наиболее часто РА используется в диагностике бактериальны состав иммунных комплексов при данной реакции входят бакт это собственно агглютинациямогут. участвоватьВРА различные поверхн антигены бактерий: компоненты их клеточной-антигены),стенкижгутики(О бак (Н-антигены), элементы капсулы-антигены)(К.
При диагностике некоторых инфекций это имеет принципиальн Например, сальмонеллы, классификация которых включает более 2 числе более 700 видов, патогенных для человека,-антигены,содержаттак- и антигены. Их идентификация по антигенной структуре провод классификацией, разработанфманойм КауиУайтом. По этой схеме все сальмонеллы -поантигенамО разделены на группы: A, B, C, D, E включает различное число видов сальмонелл, определить кот того, что-антигеныН сальмонелл обладают видовойстьюспецифично.Пользуясь схемой Кауфмана-Уайта, вначале в РА используют-сывороткиО и устанавлива группу, к которой принадлежит культура сальмонелл, выделе больного, а на следующем этапе-сыворотокпомощьюв НРА определяют в возбудителя,значительночто упрощает процесс идентификации.
Если микробные антигены искусственно адсорбированы на пов то такая реакция носитпассивнойназвание(или непрямой) гемагглютинации
(РПГА илиРНГА). Если микробные антигены адсорбированыверхностина латекспо-
этолатекс-агглютинация.
РА широко используется не только для сероидентификации ба серодиагностики бактериальных инфекций. При-агглютинацииэтомРПГА л применяются исключительно для серодиагностикиения. Дложнояпредот положительных результатов-зареакцииналичияиз в сыворотке больного «нормальных» антител было введенодиагностическогопонятиетитра.
57
Необходимость такого диагностического приема связана с те нормальных антител обычно роневеньлик,специфическиха у антител к возбудителю при наличии инфекционного заболевания значите этим существует пограничное разведение сыворотки больного реакцию, основанную на феномене агглютинации, можьнойсчи.Этао пограничное разведение сыворотки больного и получило назв титра. Величина диагностического титра зависит от возбуди серологической реакции. Так, например, для брюшного тифа составляет1:200, а для сыпного тифа 1:100, а для РПГА при бр т.д. (табл. 6.9). Основанием для того, чтобы считать ту и положительной, является превышение диагностического титра реакции не менее.-4чемразав.2 В то время,же если человек уже болел тем инфекционным забол
диагностика которого проводится в настоящий момент, для и ложноположительного результата- исследование проводят с парными сыворотками, полученными с интервалом от 7 до тически14дней.значимымДиагнос
считается нарастание титра антител при исследовании парны чем в 4 раза, или снижение титра при постановке реакции в
В некоторых случаях, например при бруцеллезе, антитела сы дают феномена агглютинациитак называемые неполные антитела. Для выявления реакцию ставят в два этапа. На первом этапе к с добавляют, как обычно, бактериальный диагностикум (взвесь этапе в -тесистему вносят тку,сыворополученную иммунизацией животн иммуноглобулинами человека. После соответствующей очистки содержит в своем составе антитела к иммуноглобулинам чело в случае формирования иммунного комплекса феномрензультате,агглюти если в сыворотке больного содержатся неполные антитела, т бруцеллам в составе диагностикума, а к ним, в свою очеред иммуноглобулинам человека. В конечном итоге эти «тройные» электролитабычно(о физрастворе) объединяются между собой и вы Такая реакция по выявлению неполных антителреакцииполучилаКумбса. назв
РА в различных вариантах ее постановки может использовать бактериальных инфекциях, а которыхтакжепримикозахне и заболеваниях, вызванных простейшими -(табл6.11). . 6.9
При заболеваниях вирусной природы постановка-заРАмелкихневозможн размеров вируса. В то же время при вирусных инфекциях исп вариантов реакции, связанныхгемаггс явленютиемнации куриных эритро вирусами. В основе такой серологической реакции лежит спо противовирусных антител блокировать у вируса гемагглютини диагностический прием носитРТГАназвание. Эту реакцию воспроизводятдля ка идентификации вируса, полученного при вирусологическом ис серодиагностики вирусных инфекций путем обнаружения антит больного (табл. 6.11).
В число методов с использованием феномена перекрестного в иммунных комплексов входитреакция преципитации с тем отличием от описан выше методов, что антиген в ней имеет молекулярную форму раствор. В присутствии антител и электролита иммунные ком конгломераты и вызываютениепомутнсреды. Чтобы зарегистрировать э помутнение существует несколько- реакцияспособкольцепрев-ции,питареакция преципитации в геле, с помощью прибора нефелометра, позво зарегистрировать даже слабую степень помутнения среды.
58
Реакция кольцепреципитации используется в инфекционно-эпидемиоло-гической практике при необходимости обнаружения микробных-теновантигенона объектах внешней среды (реакция Асколи для обнаружения сп язвы) или в составе биологическогоотбольногоматериала(реакция кольцепреципитации с гаптеном для обнаружения дизентерийн Реакция обладает очень большой чувствительностью, позволя присутствии даже единичных микроорганизмов в исследуемом
Другой разновидностью преципитацииреакцияслужитпреципитации в геле. В инфекционной практике она используется при определении то (способности выделять экзотоксинов) штаммов бактерий, выд больного. Такая необходимость возникает,при бактериологическойнапример диагностике дифтерии, поскольку нетоксичные штаммы не выз их присутствие в организме больного свидетельствует тольк
Средиметодов с использованием феномена комплементарного лизиса наибольшей известностью пользуетсяРСК, учет которой производится по феномену которая широко используется для диагностики инфекций как небактериальной этиологии.
Реакция основана на том, что антитела в составе иммунныхют новое свойствоактивировать систему комплемента, которая в пр формирует мембрано-атакующий комплекс и вызывает лизис антиген в комплексе с антителами.
РСК относится к рутинным методам, хотя и довольно.Темсложнане менее ее продолжают широко использовать в клинике инфекци
Система комплемента используется при диагностике лептоспиРА лизиса лептоспир. При постановке этой реакции учет результатов п
микроскопом, наблюдаяпри положительном тесте не только процесс живой культуры лептоспир, но и их комплементарный лизис.
В арсенале иммунодиагностикиметодыесть, основанныетакже на нейтрализующем действии антител, например,РН воспроизводится на живыхвосприимчивыхобъектах, к действию бактериальных экзотоксинов или вирусов. В соот
различают РН токсина и РН вирусов. Суть реакции заключает взаимодействуя с токсином или вирусом, препятствуют прояв воздействия на живой объект. РН можно использовать для индик токсинов в биологическом материале, идентификации вирусов вирусных инфекций.
Очень близкими к реакциям нейтрализации по механизму восп служатреакции иммобилизации, которые используют для идентификации в обладающих подвижностью. Этот лабораторный прием применяю сифилиса (реакция иммобилизации трепонем), а также холеры холерного вибриона).
Еще один вариантнейтрализация антителами сыворотки крови больно гемолитической активности стрептококкового-О (АСЛОстреп). Этотолизинатест используется для диагностики инфекций, ассоциированных с стрептококком группы А.
Аллергическая проба. Для ее постановки человеку чаще всего внутрик раствор микробных антигенов. Антигены взаимодействуют с э клетками в месте введения, что способствует выделению хем месту введения аллергена различныхнногоклетокответаимму преждевсе лимфоцитов-лимфоциты,.Т которые под воздействием микробных а выделяют провоспалительные цитокины. Все это в совокупнос
59
основные проявления положительной аллергическойлимфоиднореакции макрофального инфильтрата в месте введения аллергена.
Аллергические пробы, хотя и носят лишь ориентировочный ха при массовых обследованиях на наличие таких инфекционных туберкулез, бруцеллез, токсопламоз. В тельнаяэтихслучаяхаллергическположи проба указывает на инфицированность организма и необходим диагностики инфекционного процесса.
К числу современных методов диагностики инфекционных забо относятсяметоды иммуноанализа. Это особая группа оснметованнаядов, на использовании меченых моноклональныхМоноклональныеантителантитела. получают с использованием так называемых гибридомных технологий, о поскольку способны к взаимодействию только с одной наибол антигеннойдетерминантой среди всего набора видовых микробных Моноклональные антитела обычно метятся с помощью-флюорохромовкрасител. Такие антитела, присоединяясь к специфичномуискомомудля них объе микроорганизму в составе биологическогоа,вызывмаюттериалего свечение ультрафиолетовом свете, что может быть зарегистрировано, люминесцентного микроскопа. Этот способ обнаружения микро получил названияпрямого иммунофлуоресцентного анализа (РИФ).
Этот способользуетсяисп не только для обнаружения возбудителе материала от больного, но и для выявления антител к возбу крови (серодиагностика). В последнем случае убитую культу обрабатывают сывороткой больного с бавпослениемдующимв системудо меченных флюорохро-мом антител к IgG человека. Наблюдаемое в п свечение микроорганизма говорит о возникновении сложногомикроб + антитела из сыворотки больного класса IgG -IgG+ люми МКАТ.Такую реакцию называютреакцией непрямой иммунофлюоресцепнции (РНИФ).
Другой способ иммуноанализа- радиоиммунный анализ. Он основан на использов моноклональных антител, меченных радиоизотопом. Присоедин специфичному им объекту,придает последнему радиоактивность, что определено с помощью специальных приборов.
Наконец, еще один высоко перспективный способ мечения -мон с помощью фермента. В качестве последнего чаще всего испо ферментпероксидазу хрена. Обработка изучаемого объекта та требует последующего нанесениясубстрата«хромогена»для фермента, меняющего цвет при образовании перекиси. В результате объ присоединения меченых антитаетелприобреокрашивание, которое может зарегистрировано спектрофотометром, а методИФАполучил. назва
ИФА, как и описанный выше иммунофлуоресцентный анализ, мо в виде прямого (выявление антигенов возбудителя в биологи непрямого (выяваление антител в сыворотке больного) метод помощью ИФА можно обнаруживать микроорганизмы в материале противомикробные антитела и антитела к другим веществам а С введением в клиническуюктику праметодов иммуноанализа и, в перв аппаратного ИФА, диагностические возможности-инфекционистврачазначител возросли. Особенно это касается серодиагностики, поскольк устанавливать не только наличие антителиному квозбудителютому ил в сыв крови больного, но и определять принадлежность антител к иммуноглобулинов, что повышает качество диагностики инфек Дело в том, что антитела, принадлежащие разнымлинов,классам им выполняют различные функции (рис. 6.12).
60