А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

Тема 48. Микробиологическая диагностика бактериальных инфекций

1. Микробиологическая диагностика бактериальных острых кишечных инфекций

Основными острыми кишечным инфекциями являются: эшерихиозы, дизентерия, сальмонеллезы, в том числе брюшной тиф и паратифы, а также пищевые токсикоинфекции несальмонеллезной природы.

По частоте встречаемости возбудителей острых кишечных инфекций выделяют следующие уровни приоритетности.

1.Патогены высокого уровня приоритетности: Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Shigella, Vibrio cholerae cepopуппа 01, нехолерные вибрионы, Aeromonas, Plesiomonas.

2.Патогены среднего уровня приоритетности: не относящиеся к возбудителю брюшного тифа сальмонеллы, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile.

3.Патогены низкого уровня приоритетности: энтеропатогенные, энтеротоксигенные, энтероинвазивные и энтерогеморрагические Escherichia coli.

Для микробиологической диагностики острых кишечных инфекций используются: 1) бактериологический метод – основной метод при большинстве инфекций;

2) серодиагностика – чаще ретроспективно (при дизентерии, пищевых токсикоинфекциях, эшерихиозах), но могут использоваться для серодиагностики тифопаратифозного заболевания, иерсиниозов – реакции агглютинации (РПГА, латекс-агглютинации);

3) иммуноиндикация – для ориентировочной экспресс-диагностики (чаще для диагностики эшерихиозов, сальмонеллезов, дизентерии) – реакция иммунофлюоресценции, РПГА

сантительным шигеллезным диагностикумом, реакция ко-агглютинации с реагентом на сальмонеллы группы В.

Бактериологическое исследование

Материалом служат фекалии, реже – рвотные массы, промывные воды желудка (по клиническим показаниям – желчь, кровь, моча). В целях эпидемиологического анализа это могут быть пробы воды (при холере), остатки пищевых продуктов (при пищевых токсикоинфекциях).

Перед исследованием фекалий необходимо:

1)провести окрашивание мазков фекалий метиленовым синим для выявления лейкоцитов, свидетельствующих о поражении слизистой кишечника;

2)провести микроскопический анализ нативного мазка фекалий на яйца глистов, так как гельминтозы могут протекать с клиникой острых кишечных инфекций, и микроскопический анализ на простейшие (амебы, лямблии, криптоспоридии);

3)для исключения псевдомембранозного колита, вызванного токсинами Clostridium difficile, по возможности произвести сигмоскопию;

Проба, аккуратно отобранная с помощью ректального тампона и содержащая небольшое количество материала, должна быть помещена в соответствующую транспортную среду вместе со слизью и частицами эпителия.

Со взятым материалом следует начать работу как можно быстрее после доставки его в лабораторию (не позже чем через 2 ч после взятия), образцы исследуемого материала следует хранить при температуре 4 °С. Безотлагательный посев особенно информативен в отношении шигелл и кампилобактеров.

260

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

Особенности проведения первого этапа бактериологического исследования при подозрении на острую кишечную инфекцию:

1)первичная бактериоскопия мазков из фекалий не проводится, поскольку в норме в них содержится большое количество различных микроорганизмов со сходными морфолого-тинк- ториальными свойствами;

2)учитывая полиэтиологичность острых кишечных инфекций, для выделения чистой культуры посев проводится (из разведений фекалий в физиологическом растворе) на диффе- ренциально-диагностические среды или в среды обогащения, при этом образец в первую очередь исследуется на наличие патогенных бактерий.

На втором этапе бактериологического исследования для накопления и дальнейшей биохимической и серологической идентификации в первую очередь отбираются выросшие на диф- ференциально-диагностических средах лактозонегативные колонии грамотрицательных палочек. При их отсутствии среди лактозоположительных колоний грамотрицательных палочек отбор потенциальных возбудителей проводят по результатам реакции агглютинации по идентификации с комплексными поливалентными эшерихиозными сыворотками, содержащими в своем составе антитела к антигенам различных серогрупп патогенных кишечных палочек – возбудителей эшерихиозов.

Для накопления отобранную чистую культуру пересевают на скошенный мясопептонный

агар.

Накопленную чистую культуру возбудителя идентифицируют до рода и вида путем определения подвижности, капсулообразования, постановки теста на оксидазу, по биохимическим свойствам с использованием или рутинных тестов, или набора соответствующих сред. В дальнейшем, особенно для сальмонелл, шигелл и патогенных кишечных палочек, с использованием соответствующих видоспецифических и вариантспецифических агглютинирующих сывороток проводят серологическую идентификацию для внутривидовой дифференцировки до серовара.

Особенность бактериологического исследования при диагностике брюшного тифа и паратифов состоит в том, что выбор материала для исследования диктуется фазой течения заболевания:

1)в начале болезни и в дальнейшем на высоте лихорадки для выделения гемокультуры используется кровь;

2)со 2–3-й недели и в период реконвалесценции материалом для исследования (в частности, для выделения миелокультуры) служат в основном пунктат костного мозга, для выделения копрокультуры – фекалии, для выделения уринокультуры – моча, в период разгара болезни для выделения розеолокультуры берут соскоб с розеол.

Выделение чистой культуры сальмонелл – возбудителей тифопаратифозного заболевания

–проводится путем высева на дифференциально-диагностические среды, а дальнейший ход бактериологического исследования (накопление выделенной культуры, определение ее морфологических и тинкториальных свойств, биохимическая и серологическая идентификация выделенной чистой культуры возбудителя до рода и вида) – по общепринятой методике, без особенностей.

Для бактериологической диагностики иерсиниоза первичный посев проводится на специальные среды с последующим холодовым обогащением.

Для выделения Campylobacter первичный посев проводится на специальные для них питательные среды с добавлением антибиотиков с целью подавления сопутствующей микрофлоры. Посевы инкубируют в анаэростате.

Для бактериологической диагностики холеры материал от больного засевают на элективную питательную среду.

При диагностике заболеваний, вызываемых С. difficile, в фекалиях больных обнаруживают экзотоксин или применяют молекулярно-генетические методы.

261

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

При пищевых токсикоинфекциях первичный посев материала проводится для выделения возможно большего круга возможных возбудителей на ряд сред.

262

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

2. Микробиологическая диагностика гнойно-воспалительных заболеваний

Гнойно-воспалительные заболевания поражают практически любые ткани, органы и системы организма человека.

Большинство гнойно-воспалительных заболеваний полиэтиологичны, поэтому их возбудители могут относиться к различным группам микроорганизмов. Это:

1)гноеродные кокки (стафилококк, стрептококк, менингококк, гонококк);

2)грамотрицательные бактерии (энтеробактерии, псевдомонады и другие неферментирующие бактерии);

3)анаэробы, в том числе и неклостридиальные.

Во многих случаях в ходе проведения микробиологической диагностики возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний, являющихся условно-патогенными бактериями, надо дифференцировать от сапрофитных или условно-патогенных представителей этих же семейств или родов микроорганизмов, входящих в состав нормальной микрофлоры человека.

Виды исследуемого материала и методы микробиологической диагностики различных форм гнойно-воспалительных заболеваний определяются их клиническим проявлением.

Материал для микробиологической диагностики гнойно-воспалительных заболеваний забирают стерильным шприцем, пинцетом или ватным тампоном, по возможности из более глубоких отделов, так как верхние могут содержать сапрофитную флору. При снятии повязки рекомендуется очистить поверхность от мази, отмерших тканей и лишь затем отбирать материал.

В ряде случаев материал из очага инфекции может быть получен только при оперативном лечении. Взятый материал помещают в стерильную посуду, предохраняют от высыхания и в течение 1–2 ч доставляют в лабораторию.

Проведение исследования. Проводят микроскопию мазков раневого отделяемого: с очищенной раневой поверхности готовят мазки-отпечатки, фиксируют (не на огне), окрашивают по Романовскому-Гимза и микроскопируют, отмечая морфологию и количество микроорганизмов.

Посев раневого отделяемого непосредственно с тампона производят на кровяной агар, в сахарный бульон и среду для анаэробов (тиогликолевый бульон).

Из жидких проб исследуемого материала готовят десятикратные разведения в физиологическом растворе и из каждого разведения делают высев по 0,1 мл на кровяной агар, Эндо, ЖСА.

Кусочки тканей взвешивают, измельчают в стерильной ступке с питательным бульоном, затем делают десятикратные разведения в физиологическом растворе и по 0,1 мл из каждого разведения засевают на плотные питательные среды.

Посевы инкубируют аэробно и анаэробно при температуре 37 °С, просматривая ежедневно.

При появлении роста в жидких питательных средах готовят мазки, окрашивают по Грамму, микроскопируют, делают высев на соответствующие плотные питательные среды для выделения чистой культуры.

При появлении роста на плотной питательной среде подсчитывают число выросших колоний и пересчитывают на 1 мл исходного материала (1 г ткани). Выделенную с плотной питательной среды чистую культуру идентифицируют по общепринятой методике, определяют чувствительность к антибиотикам.

Оценка результатов. Отрицательный результат исследования выдают через 7 суток при отсутствии роста на всех питательных средах.

263

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

Критерии количественной оценки микробного роста при прямом штриховом посеве тампоном раневого отделяемого на плотную питательную среду (1/2 чашки Петри).

I – очень скудный рост – рост только в жидких средах, на плотной питательной среде рост отсутствует.

II – небольшое количество – на плотной среде рост до 10 колоний.

III – умеренное количество – на плотной среде рост от 11 до 100 колоний. IV – большое количество – рост на плотной среде более 100 колоний.

Рост I–II степеней чаще всего свидетельствует о контаминации, III–IV степеней – об этиологической роли данного микроорганизма.

Уровень обсемененности тканей в ране, равный 105 КОЕ/г, является критическим. Его превышение свидетельствует о большой вероятности развития гнойной инфекции и возможности генерализации инфекционного процесса.

В тех случаях, когда патологический материал берется из закрытых полостей или из глубины гнойных ран, выделенные микроорганизмы являются возбудителями данного инфекционного процесса.

Интерпретация результатов микробиологического исследования при хронических воспалительных процессах, когда выявляют ассоциации бактерий, осложняется. В этом случае ведущее значение в течении раневого процесса следует отдавать видам, количественно преобладающим в данном микробиоценозе.

Бактериоскопический метод микробиологической диагностики гнойно-воспалительных заболеваний как самостоятельный используется при острой гонорее, менингите. При этом при острой форме гонореи основной целью обнаружения в исследуемом материале являются внутрилейкоцитарно расположенные диплококки, а при менингите по результатам первичной микроскопии дается только предварительное заключение.

Бактериологическое исследование является основным методом микробиологической диагностики гнойно-воспалительных заболеваний и включает первичную микроскопию как обязательный этап. Для выделения чистой культуры пневмококков из исследуемого материала следует сначала ввести его внутрибрюшинно белым мышам, а уже после развития пневмококковой инфекции секционный материал пересеять на кровяной или сахарный агар и проводить бактериологическое исследование. При гонорее бактериологическое исследование проводят только при отрицательных результатах бактериоскопического исследования, чаще – при дальнейшем развитии процесса, на более поздних, хронических, стадиях, когда отделяемого становится меньше. Для увеличения количества отделяемого применяют метод перевода хронической гонореи в острую с помощью убитой гонококковой вакцины, пирогенала или пива («провокацию»).

Далее приведена схема бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях.

Материал для исследования:

1)гной – первичная микроскопия обязательна;

2)спинно-мозговая жидкость – первичная микроскопия обязательна;

3)мокрота – первичная микроскопия проводится только из разведений в физиологическом растворе 104–105;

4)моча – первичная микроскопия не проводится;

5)мазок из зева – первичная микроскопия не проводится;

6)кровь – первичная микроскопия не проводится, непосредственно у постели больного проводится посев крови в сахарный бульон (1:10).

Исходя из полиэтиологичности гнойно-воспалительных заболеваний, с учетом результатов первичной микроскопии гноя, спинно-мозговой жидкости, посевов крови в сахарный бульон исследуемый материал засевают на соответствующие среды для выделения чистой куль-

264

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

туры возбудителя. При этом первичный высев из мокроты делают не из разведений, а из исходной взвеси бактерий.

Из мочи высев делают на кровяной агар и среду Эндо, а мазок из зева – на кровяной агар. На 2-й день исследования проводят учет роста колоний на питательных средах, определяют морфологические, тинкториальные и культуральные свойства возбудителя, осуществляют посевы на скошенный агар для накопления выделенных чистых культур. Колонии с кровяного агара, по результатам микроскопии возможно содержащие стрептококк, для накопления

пересевают в сахарный бульон.

На 3-й день исследования проводят посев на среду Пешкова для определения подвижности, постановку биохимических тестов для родовой и видовой идентификации накопленной чистой культуры, определение оксидазной активности и чувствительности к антибиотикам методом стандартных дисков.

Для стрептококков на этом этапе исследования возможна идентификация по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам с определением их принадлежности к серогруппе в реакции преципитации.

На 4-й день исследования осуществляют учет биохимических тестов и окончательную идентификацию культур по биохимическим свойствам, а также проводится внутривидовая дифференцировка, учет результатов определения чувствительности выделенной культуры бактерий к антибиотикам.

В ходе бактериологического исследования конкретный штамм стафилококков обычно считают патогенным, если он образует коагулазу, ферментирует маннит, разжижает желатин или гемолизирует эритроциты. Помимо видовой идентификации возбудителя, определяют продукцию выделенным штаммом факторов вирулентности.

Если в результате бактериологического исследования патологического материала выделена культура условно-патогенных микроорганизмов, то для определения ее роли в качестве возбудителя данного заболевания необходимо пользоваться критериями этиологической значимости.

265