А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

Тема 8. Основы медицинской биотехнологии

1. Краткая история развития биотехнологии

Как нам известно из древней истории, еще 6000–5000 лет до н. э. люди выпекали хлеб, варили пиво, готовили сыр, а из винограда делали вино. Они и не подозревали, что благодаря им уже в те далекие времена зародилась такая наука, как биотехнология. Не обоснованный научно, этот этап развития биотехнологии длился долгое время вплоть до XIX в., когда Л. Пастер открыл природу процесса брожения. Открытие этого процесса считается началом второго, научного этапа традиционной биотехнологии. С этого момента и по сегодняшний день получены и выделены ферменты, открыты и до сих пор открываются многие микроорганизмы. Кроме того, в результате изучения физиологии, биохимии и генетики микроорганизмов были разработаны способы их выращивания в массовых количествах; получены культуры животных и растительных клеток и разработаны способы их искусственного культивирования; получены многие продукты микробиологического синтеза, необходимые для медицины, сельского хозяйства и промышленности. Таким образом, вначале сформировалась техническая микробиология, а затем – биотехнология, при этом промышленное производство сводилось в основном к получению продуктов на основе природных штаммов.

С течением времени на основе достижений молекулярной биологии и микробиологии, генетики и генетической инженерии, иммунологии и химической технологии на смену старой биотехнологии пришла новая, основанная на применении искусственно получаемых штаммов – суперпродуцентов, использовании иммобилизованных ферментов, применении культур животных и растительных клеток, широком использовании генетической инженерии для получения клеток-рекомбинантов, моноклональных антител и других биологически активных веществ.

53

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

2. Понятие о биотехнологии, цели и задачи

Биотехнология – научное понятие, объединяющее в себе такие науки, как микробиология, молекулярная биология, генная инженерия, химическая технология и ряд других наук. Необходимость биотехнологии обусловлена потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяйства, в том числе медицины и ветеринарии, а также в принципиально новых технологиях.

Биотехнология – это получение продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов, в качестве которых могут быть использованы организмы животных и человека. Например, получение иммуноглобулинов из сывороток вакцинированных лошадей или людей; получение препаратов крови доноров; отдельные органы (получение гормона инсулина из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней) или культуры тканей (получение лекарственных препаратов). Но чаще всего в качестве биологических объектов используются одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетки. Это обусловлено следующими причинами:

1)клетки являются своего рода биофабриками, которые в процессе жизнедеятельности вырабатывают разнообразные ценные продукты. Ими являются белки, жиры, углеводы, витамины, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и иное, т. е. продукты, крайне необходимые в жизни человека, но недоступные для получения другими способами в связи со сложностью технологии процессов или экономической нецелесообразностью;

2)клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Это их свойство позволяет за относительно короткое время искусственно вырастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток;

3)биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и иное, значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез;

4)возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах при наличии соответствующего технологического оборудования и аппаратуры, доступность сырья, технологии переработки и др.

Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе ассимиляции и диссимиляции (или жизнедеятельности) образуют новые продукты и выделяют метаболиты, обладающие разнообразными физико-химическими свойствами и биологическим действием. При этом продукты ассимиляции и диссимиляции предложено делить на 4 категории:

1)сами клетки как источник целевого продукта. К примеру, для получения живой или убитой корпускулярной вакцины используют выращенные бактерии или вирусы; а дрожжи используют как кормовой белок или основу для получения гидролизатов питательных сред и т. д.;

2)макромолекулы, синтезирующиеся клетками в процессе выращивания. К ним относятся ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.;

3)первичные метаболиты – низкомолекулярные вещества, необходимые для роста клеток. Ими являются аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты;

4)вторичные метаболиты – низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток. Ими являются антибиотики, алкалоиды, токсины и гормоны.

Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный продукт, который может использоваться

вразличных отраслях: в медицине для производства антибиотиков, витаминов, ферментов, аминокислот, гормонов, вакцин, антител, компонентов крови, диагностических препаратов,

54

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

иммуномодуляторов, алкалоидов, пищевых белков, нуклеиновых кислот, нуклеозидов, нуклеотидов, липидов, антиметаболитов, антиоксидантов, противоглистных и противоопухолевых препаратов; в химической промышленности используют ацетон, этилен, бутанол; в пищевой промышленности используют аминокислоты, органические кислоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, спирты, дрожжи; в ветеринарии и сельском хозяйстве используют кормовой белок для производства кормовых антибиотиков, витаминов, гормонов, вакцин, а также биологических средств защиты растений и инсектицидов; в энергетике – биогаз и этанол.

Достижения в биотехнологии позволяют применять ее для решения проблем, связанных с нарушением экологии (например, для очистки сточных вод, переработки отходов и побочных продуктов производства, а также их дегидратации (фенола, нефтепродуктов и других вредных веществ, пагубно влияющих на окружающую среду) с помощью микроорганизмов.

В настоящее время в биотехнологии выделяют медико-фармацевтическое, продовольственное, сельскохозяйственное и экологическое направления, поэтому биотехнология подразделяется на медицинскую, сельскохозяйственную, промышленную и экологическую.

Медицинская биотехнология подразделяется на фармацевтическую и иммунобиологическую, сельскохозяйственная – на ветеринарную и биотехнологию растений, промышленная – на соответствующие отраслевые направления (пищевая, легкая промышленность, энергетика и т. д.).

Кроме того, биотехнология подразделяется на старую (традиционную) и новую, которую чаще связывают с генной инженерией.

Таким образом, можно сказать, что биотехнология в некоторой степени является не только наукой, но и производством. Доказательством этого может служить тот факт, что промышленное производство в биотехнологии, основанное на принципах брожения (ферментация), биоконверсии (превращение одного вещества в другое), культивировании растительных и животных клеток, бактерий и вирусов, генетических манипуляциях, невозможно без промышленного оборудования и аппаратуры, отработки и оптимизации технологических процессов, разработки способов оценки и контроля продукции на всех ее стадиях. В связи с этим биотехнологическая промышленность в своем распоряжении имеет крупные заводы, опытноконструкторские учреждения, научно-исследовательские институты. И хотя на предприятиях промышленной биотехнологии вырабатывается огромное количество (буквально тысячи тонн) продукции, тем не менее потребности быстрорастущего народного хозяйства биотехнология в полной мере удовлетворить не в состоянии. Поэтому развитию биотехнологии в настоящее время уделяется постоянное внимание, и эта отрасль быстро развивается.

55

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

3. Микроорганизмы, клетки и процессы, применяемые в биотехнологии

Как нам известно, в природе существует огромное число микроорганизмов, каждый из которых способен синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые могут быть пригодны для использования в биотехнологии. На современном этапе развития биотехнологии практическое применение нашло около 100 видов микроорганизмов – бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли, т. е. наиболее изученные.

Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, выработки кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из

500 известных видов дрожжей используется лишь Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.

Среди бактерий в биотехнологии применяют представителей таких родов, как:

1)Acetobacter, превращающих этанол в уксусную кислоту, а уксусную кислоту – в углекислый газ и воду;

2)Bacillus – для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis);

3)Clostridium – для сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол;

4)молочнокислые бактерии (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus);

5)псевдомонады (например, P. denitrificans – для получения витамина В2,

Corynebacterium glutamatum – для получения аминокислот и др.).

Актиномицеты (род Streptomyces), грибы Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acremonium и иные применяются в биотехнологии для получения разнообразных антибиотиков.

Кроме того, бактерии, дрожжи и вирусы используют в качестве рецепиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов – продуцентов биотехнологической продукции. Например, получены рекомбинантные штаммы Е. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующих интерлейкин-2, антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.

Для получения вакцин и диагностических препаратов используют и патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.).

Культуры животных и растительных клеток, строение, физиология, процесс культивирования которых являются более сложными, чем бактериальных клеток, также нашли широкое применение в биотехнологии. Тем не менее из культур тканей растений получают разнообразные соединения, используемые в медицине, и прежде всего алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства, ферменты, витамины, опиаты и иное, сельском хозяйстве, химической и других отраслях промышленности. Кроме того, животные клетки используют не только для получения продукции, синтезируемой клетками, но и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов.

Основными условиями успешного проведения технологического процесса получения продуктов микробного или клеточного синтеза являются:

1) выбор или получение высокопродуктивного промышленного штамма-продуцента и поддержание его в активном состоянии. Это обусловлено тем, что различные штаммы могут иметь существенные различия по количеству и качеству продукции того или иного вещества,

56

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

что в значительной мере сказывается на экономической эффективности и активности целевого продукта;

2) подбор питательных сред, которые смогли бы обеспечить максимальное накопление биомассы или целевого продукта. При этом питательные среды должны состоять из дешевого, недефицитного и доступного сырья. С этой целью в крупномасштабном производстве для приготовления питательных сред служит обычно сравнительно дешевое сырье, которым являются меласса, парафины нефти, дрожжи, уксусная кислота, природный газ. При получении медицинских препаратов применяются казеин, препараты крови, среды из мясных гидролизатов.

С целью получения продукции в максимальных количествах активный штамм-проду- цент выращивают на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования. Выращивание проводят в ферментаторах, или культиваторах, вместимость которых может

варьировать от 2 л до 100–400 м3 в зависимости от потребности в продукте. Процесс культивирования ведется в асептических условиях, чтобы получить чистые культуры целевых микроорганизмов или культуры клеток.

В ферментаторах применяют суспензионное (глубинное) культивирование, реже поверхностное – на плотных питательных средах (бактерии, грибы) или в жидком монослое (культуры животных клеток).

Полученную биомассу микроорганизмов или культуры клеток подвергают переработке, вид которой определяется технологией получения целевого продукта.

Наиболее типовые процессы:

1)концентрирование биомассы сепарированием, центрифугированием и приготовление из нее жидкого или сухого продукта;

2)высушивание, проводимое лиофильным способом из замороженного состояния или путем распыления в потоке теплого воздуха в специальных лиофильных аппаратах и распылительных сушилках;

3)сбор центрифугата после отделения биомассы и выделения из нее целевого продукта.

Внекоторых случаях предварительно прибегают к разрушению клеток механическим, осмотическим или ультразвуковым способом с целью увеличения выхода целевого продукта.

Если из биомассы или центрифугата необходимо выделить активную субстанцию (витамин, аминокислоту, антиген, фермент и др.), то применяют многоступенчатые физические (сепарирование, центрифугирование) или физико-химические (осаждение нейтральными солями, спиртом, ацетоном, ультрафильтрацию, хроматографию, электрофорез) методы очистки, выбор которых зависит от свойств выделяемого вещества, зависящих от природы, молекулярной массы, лабильности к внешним воздействиям и т. д. Чистота получаемого продукта определяется наличием в нем примесей и выражается коэффициентом очистки – отношением числа активных единиц продуктов к 1 мг белка или азота (так называемая удельная активность) в очищенном препарате к удельной активности исходного продукта.

Как правило, в препаратах активная субстанция содержит примеси питательных сред, на которых выращивали микроорганизмы, а также продукты метаболизма и продукты распада микробной клетки. К примесям относятся белки, полисахариды и их комплексы, нуклеиновые кислоты, соли и другие низкомолекулярные вещества – бесполезные для препаратов, но нередко вызывающие нежелательные побочные реакции организма при применении препаратов в виде местных реакций, повышения температуры тела, аллергических проявлений. Этим объясняется стремление к получению препаратов, содержащих активную субстанцию в максимально очищенном состоянии.

После получения активной субстанции из нее конструируют конечный препарат, который в зависимости от назначения и способа применения может быть в жидком или сухом состоянии или в виде мазей. Поскольку он может быть предназначен для наружного, парентерального или энтерального, аэрозольного применения, то может быть стерильным и нестерильным.

57

А. Луковкина. «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

Кроме того, конечный препарат, помимо примесей (от которых не удалось освободиться), содержит и необходимые добавки, которыми являются консерванты для поддержания стерильности препарата при хранении, стабилизаторы для повышения устойчивости лабильного активного начала при хранении, активаторы.

В конечной композиции препарат фасуется, этикетируется и снабжается инструкцией по применению.

Каждая серия препарата проходит стандартизацию в соответствии с технической документацией на производстве и в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича или в Фармакологическом комитете в зависимости от назначения препарата.

58