2. Бензидинова проба на гем гемоглобіну.

Принцип методу. Гемоглобін складається з 4-ох субодиниць, кожна з яких містить білок глобін і простетичну групу - гем, який надає крові червоного забарвлення. Виявлення гемінової групи грунтується на її здатності окислювати бензидин за допомогою перекису водню, утворюючи сполуку синього кольору, що поступово може переходити в червоний. Ця дуже чутлива реакція використовується для виявлення навіть мінімальних кількостей крові в біологічних рідинах і широко застосовується в клінічній та судовій медицині.

Хід роботи: В пробірку вміщують 5 крапель 1% розчину крові, 5 крапель розчину бензидину, 2-3 краплі пероксиду водню і спостерігають за появою синього забарвлення.

Лiтература.

1. Конспект лекцiй.

2. Биологическая химия /Воронина Л.Н. и др.- Х.:Основа, 1999. – 640 с.

3. Губський Ю.I. Бiологiчна хiмiя. – Київ-Тернопiль: Укрмедкнига, 2000 – 507 с.

4. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. – Біохімія людини.

5. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. – Біохімія людини.Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744с.

Заняття №4 Тема: Будова, властивостi і класифікація ферментiв.

Актуальнiсть теми: Ферменти, як бiологiчні каталiзатори забезпечують нормальний обмiн речовин в органiзмi людини. Порушення структури, фiзико-хiмiчних i каталiтичних властивостей ферментiв зумовлює розвиток патологiчних станiв. Механiзм дiї багатьох фармацевтичних препаратів грунтується на їх взаємодiї з ферментами, та й метаболізм більшості лiкарських середникiв також здійснюється за участі відповідних ферментів.

Навчальнi цiлi:

Знати: структуру простих i складних ферментiв, властивостi i механiзм каталiтичної дiї.

Вмiти: дослiдити вплив температури i рН середовища на активнiсть ферментiв; визначати специфiчнiсть ферментативної дiї.

Самостiйна позааудиторна робота:

1. Навести докази бiлкової природи ферментiв.

2. Зобразити графiчно вплив температури i рН середовища на швидкiсть ферментативної реакцiї.

3. Складіть таблицю за схемою: вітамін – його коферментні форми.

4. Пiдготувати вихiднi данi для оформлення протоколу лабораторної роботи. Контрольнi питання:

1. Iсторiя розвитку ензимологiї.

2. Докази білкової природи ферментів.

3. Структурна органiзацiя простих i складних ферментiв. Активний центр.

4. Коферменти i простетичнi групи ферментiв

5. Властивостi ферментiв як бiокаталiзаторiв.

6. Специфiчнiсть дiї ферментiв.

7. Вплив температури i рН середовища на активнiсть ферментiв.

8. Активний центр.

9. Механiзм дiї ферментiв.

Самостiйна аудиторна робота.

1. Заповніть таблицю:

   Подібності ферментів та хімічних каталізаторів
   Відмінності ферментів від хімічних каталізаторів

2. Вкажіть відмінності в будові активного центру простого і складного ферментів.

3. Охарактеризуйте різні типи специфічності ферментів, наведіть відповідні приклади.

4. Зобразіть енергетичну діаграму для каталітичної та некаталітичної реакцій.

5. Виконати лабораторнi роботи, оформити I захистити протокол.

1. Визначеня активності амілази слини і її термолабільність.

Виконати лабораторнi роботи, оформити i захистити протокол.

Швидкість ферментативної реакції залежить від багатьох факторів: концентрації субстрата, концентрації фермента, рН середовища, наявності активаторів і інгібітсрів, коферментів.

Принцип методу. Фермент -амілаза (КФ 3.2.1.1) слини каталізує гідроліз 1-4-глікозидного зв'язку крохмалю і глікогену до дисахариду мальтози. Гідроліз крохмалю під впливом -амілази проходить стадії утворення декстринів. Нерозщеплений крохмаль з йодом дає синє забарвлення. Декстрини в залежності від розміру дають з йодом забарвлення: амілодекстрини - фіолетове, еритродекстрини - червонобуре, ахродекстрини і мальтоза - жовте забарвлення. Кінцевий продукт гідролізу крохмалю - глюкоза - має вільну альдегідну групу і може бути виявлена реакцією Фелінга, в основі якої лежить окислювально-відновна реакція. При цьому альдегідна група окислюється до глюкуронової кислоти, а мідь - гідрат окису міді (блакитного кольору) відновлюється до гідрат закису міді жовтого кольору. При подальшому нагріванні гідрат закису переходить в червоний закис міді.

Одним із характерних властивостей ферментів є термолабільність, тобто чутливість фермента до температури, при якій протікає ферментативна реакція. Температурний оптимум для ферментів – 38-40°С. Ферменти при нагріванні до 70°С втрачають свої властивості біологічних каталізаторів. Ступінь інактивації залежить від тривалості теплового впливу. Внаслідок теплової денатурації фермента відбувається сповільнення і припинення ферментативної реакції. При низьких температурах ферменти добре зберігаються, але швидкість ферментативного каталізу різко знижується. Про дію фермента судять по зникненню субстрату або появі продуктів реакції.

Хід роботи. В першу пробірку наливають невелику кількість нерозведеної слини і кип'ятять її протягом 5-8 хв., після чого охолоджують. В другу пробірку наливають нерозведену некип’ячену слину, в третю пробірку наливають таку ж кількість води. В усі пробірки додають по 10 крапель 1% розчину крохмалю та поміщають в термостат або водяну баню при температурі 38°С на 10 хв. Після цього додають по 2-3 краплі розчину йоду у всі пробірки. Спостерігають зміну забарвлення.

Реакція Фелінга. До досліджуваного розчину додають 3 краплі реактиву Фелінга І і реактиву Фелінга ІІ, нагрівають пробірку до кипіння і кип’ятять 1 хв. У випадку позитивної реакції на глюкозу спостерігається червоне забарвлення внаслідок утворення закису міді. Порівнюють дію амілази слини і сахарази фільтрату дріжджів на сахарозу.