30. Определение концентрации и молярной экстинкции вещества методом колориметрии, фотометрии.

Цель:Методом наименьших квадратов построить калибровочный график.Определить молярну. Экстинкцию красителя на одной длине волны и найти концентрацию в-ва.

Ход работы

1.Приготовьте растворы KMnO₄ следующих концентраций: 0,0025 М, 0,005 М и 0,015 М.2.На монохроматоре установите длину волны, соответствующую максимуму спектра поглощения исследуемого раствора.3.Первую кювету наполните дистиллированной водой, а вторую - раствором красителя концентрации наименьшей из предложенных растворов красителя. 4.Зависимость оптической плотности раствора на _max от концентрации красителя в растворе.

5.С помощью графика (калибровочного графика) и закона Бугера-Ламберта-Бера найдите значение экстинкции раствора на _max.

Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, для любых двух произвольных концентраций выполняется равенство, т.е. D_i=^.C_i^.l D_k=^.C_k^.l , где D_i и D_k - оптические плотности, С_i и С_k – соответствующие концентрации и l – оптический путь (длина кюветы). Найдем экстинкцию из соотношения D_i- D_k= l (C_i-C_k):

.

Определение неизвестной концентрации вещества с помощью спектрофотоколориметра

1.Налить в кювету раствор красителя с неизвестной концентрацией.

2.Измерьте оптическую плотность на _max. Определите концентрацию раствора по формуле, использую найденное экспериментально значение экстинкции раствора на _max:

.

Измерение коэффициента пропускания или оптической плотности раствора.

1.Установить в кюветное отделение кюветы с растворителем и контрольным раствором, по отношению к которому производится измерение, и исследуемый раствор. Кювету с растворителем или контрольным раствором установить в дальнее гнездо кюветодержателя, а кювету с исследуемым раствором – в ближнее гнездо кюветодержателя. В световой пучок установить кювету с растворителем (рукоятка влево до упора). Если измерение производится относительно воздуха, например, для образца из стекла или другого прозрачного материала, то в этом случае дальнее гнездо кюветодержателя должно быть свободным.

2.Установить ручкой 2 длину волны, на которой производится измерение. Длина волны высветится на верхнем световом табло.

3.При закрытой крышке кюветного отделения нажать клавишу «Г.Нажать клавишу «П» или «Е». Слева от мигающей запятой высветятся соответственно значения «1000.2» или «0.0000.002», означающие, что начальный отсчет пропускания (100%) или оптической плотности (0,000) установился на фотометре правильно. Если отсчеты «1000.2» или «0.0000.002» установились с большим отклонением, нажать на клавиши «Г», «П» или «Е» повторно через 3-5 секунд.

31. Определение собственной люминесценции белка.

Цель:Методом наименьших квадратов построить калибровочный график. Определить молярную экстинкцию красителя на одной длине волны и найти неизвестную концентрацию вещества.

Спектром люминесценции называется кривая зависимости интенсивности люминесценции от длины волны (или частоты): I = f (), Интенсивность люминесценции выражается обычно в величинах пропорциональных энергии или числу квантов.Преимуществом люминесцентного метода является его более высокая чувствительность.

Интенсивность люминесценции пропорциональна количеству света, поглощаемого объектом в единицу времени. Из уравнения

,

При малых концентрациях интенсивность люминес­ценции прямо пропорциональна концентрации. Измерение спектров люминесценции является одним из основных методов изучения состояния веществ в биологических системах, так как даже незначительные изменения состояния вещества: агрегация, комплексообразование, изменение кислотно-основного равновесия и т. д., часто очень сильно сказывается на его люминесцентных свойствах.Светофильтры используются для выделения отдельных участков спектра. Основной характеристикой всякого светофильтра является величина его пропускания (Т) при различных длинах волн:

,

где I₀—интенсивность падающего,а I —интенсивность пропущенного светофильтром монохроматического света.

При выборе светофильтров следует исходить из спектра поглощения объекта и правила Стокса, согласно которому спектр люминесценции сдвинут в длинноволновую сторону по сравнению со спектром поглощения.

Жидкостный фильтр Бекштрема представляет собой раствор сернокислого никеля и сернокислого кобальта в дистиллированной воде. Такой раствор, разведенный в три-пять раз, наливают в кварцевую колбу, которая служит одновременно светофильтром, тепловым фильтром и конденсором. Измерение спектра люминесценции белка при комнатной и низкой температуре