Nikolls_-_Ot_neyrona_k_mozgu

Глава 8 Свойства и функции нейроглиальных клеток

Нервные клетки в центральной и периферической нервной системе окружены клетками--спутниками: шванновскими клетками на периферии и нейроглиальными клетками в ЦМС. В этой главе будут обсуждаться вопросы — как устроены клетки-спутники, как они взаимодействуют с нейронами и какова их физиологическая роль.

Нейроглиальные клетки составляют около половины объема мозга, а их количество значительно превышает количество нейронов. Основными классами нейроглиальных клеток являются олигодендроциты, астроциты и радиальные глиальные клетки. Микроглиальные клетки представляют собой особую популяцию клетокфагоцитов нервной системы. Нейроны и глиальные клетки очень плотно упакованы. Их мембраны отделены друг от друга узким экстраклеточным пространством шириной около 20 нм, заполненным жидкостью. Мембраны глиальных клеток — так же как и мембраны нейронов — содержат ионные каналы, рецепторы нейромедиаторов, насосы, транспортирующие ионы, и транспортеры аминокислот. Вдобавок, глиальные клетки связаны друг с другом щелевыми контактами, через которые могут проходить ионы и небольшие молекулы. Глиальные клетки имеют более отрицательный, чем нейроны, потенциал покоя, но не способны генерировать потенциалы действия.

Основной ролью олигодендроцитов и шванновских клеток является формирование миелина вокруг аксонов, что значительно ускоряет проведение нервных импульсов. Глиальные и шванновские клетки также являются проводниками растущих аксонов к их мишеням. Микроглиальные клетки появляются в участках повреждения или воспаления и фагоцитируют продукты распада.

В силу близкого расположения мембран глиальных клеток и нейронов, между этими двумя типами клеток существует динамическое взаимодействие. Так, нейроны освобождают К+ в узкое внеклеточное пространство по время проведения нервных импульсов, что приводит к увеличению концентрации внеклеточного К+ и деполяризации глиальных клеток. Глиальные клетки влияют на состав жидкости, которая окружает нейроны, захватывая К , а также нейропередатчики, которые накапливаются в результате нервной активности. Глиальные клетки секретируют передатчики, питательные вещества и трофические факторы во внеклеточное пространство. Довольно сложно оценить количественно, каков вклад этих механизмов в нормальное функционирование нейронов.

Нервные клетки в мозге очень плотно окружены клетками-спутниками, которые называются глиальными клетками, или глией Было подсчитано, что количество глиальных клеток превышает количество нейронов по крайней мере в 10 раз, и глия составляет около половины объема нервной системы. С момента их открытия функция глиальных клеток длительное время оставалась загадкой для нейробиологов. Несмотря на то, что количество глиальных клеток заметно больше, физиологическая активность нервной системы часто обсуждается исключительно в рамках функционирования нейронов, как если бы глия не существовала. В настоящей главе обсуждаются физиологические свойства глиальных клеток и их функциональное взаимодействие с нейронами.

Исторический ракурс

Глиальные клетки были впервые описаны в 1846 году Рудольфом Вирховым, который считал, что они являются «нервным клеем» — отсюда они и получили свое название (glue по английски означает клей). Выдержки из работы Вирхова дают возможность почувствовать эту точку зрения1);

До сих пор, описывая нервную систему, я говорил только об истинно нейрональной ее части. Однако...

важно знать о той субстанции., которая находится между собственно нейрональными частями, скрепляет их вместе и создает целостную форму... это подтолкнуло меня к тому, чтобы дать ей свое название — нейроглия. ...Опыты показывают нам, что эта ткань головного и спинного мозга является одним из наиболее частых мест посмертных изменений... В нейроглии проходят сосуды, которые

практически повсеместно отделены от нервной субстанции промежуточным слоем и не входят с ней в непосредственный контакт.

В последующие годы нейроглиальные клетки интенсивно исследовались нейроанатомами и патологами, которым они были известны как наиболее частый источник опухолей в мозге. Это не так уж и удивительно, поскольку определенные глиальные клетки — в отличие от большинства нейронов — могут продолжать делиться и размножаться во взрослом живом организме. Среди самых первых предположений о роли глиальных клеток по отношению к нейронам были структурная поддержка, секреция трофических факторов и электрическая изоляция нейронов 2). Питательная роль нейроглии была предположена Гольджи в 1883 году3). Он писал:

Нейроглия... служит для доставки питательных веществ... (и)... отличается от обычной соединительной

ткани своими морфологическими и химическими характеристиками и иным эмбриологическим происхождением.

Идеи Гольджи казались настолько правильными и имели такую силу, что на протяжении многих лет никому и в голову не приходило их проверить.

Морфология и классификация глиальных клеток

Отличительным от нейронов свойством нейроглиальных клеток является отсутствие аксонов. Типичная глиальная клетка изображена на рис. 8.1. В ЦНС позвоночных глиальные клетки подразделяются на несколько классов 4· 5).

Астроциты контактируют с капиллярами и нейронами. Они делятся на две основные группы:

(I) фиброзные астроциты, которые содержат филаменты; эти клетки в большом количестве находятся в пучках миелинизированных нервных волокон в белом веществе мозга; (2) протоплазматические астроциты, которые содержат меньше фиброзного материала и изобилуют в сером веществе, возле сомы и дендритов нейронов и синапсов.

Олигодендроциты в основном находятся в белом вешестве, где они формируют миелин вокруг крупных аксонов (глава 7).

Радиальные глиальные клетки играют важную роль в развитии ЦНС млекопитающих. Они натянуты как струны через всю толщину спинного мозга, сетчатки, мозжечка к их поверхности, образуя продолговатые филаменты, вдоль которых развивающиеся нейроны мигрируют к своему месту назначения. В ЦНС взрослых животных присутствуют клетки, напоминающие радиальную глию — клетки Бергмана в мозжечке и мюллеровские клетки в сетчатке.

Эпендимиальиые клетки, выстилающие внутреннюю поверхность мозга — желудочков, — также классифицируются как глиальные клетки.

Микроглиальные клетки отличаются от нейроглиальных клеток по структуре, свойствам и происхождению 6, 7). Они напоминают макрофаги крови и, по всей видимости, от них и происходят.

В периферических нервах и ганглиях позвоночных шванновские клетки являются аналогом глиальных клеток. Они формируют миелин вокруг быстро проводящих аксонов. Шваиновские клетки плотно облегают также маленькие аксоны (менее 1 микрометра в диаметре), не формируя при этом миелинового слоя.

Определение клеток-сателлитов, или спутников, употребляется в настояшей главе для обозначения всех не нейрональных клеток в совокупности, включая глиальные клетки в ЦНС и шванновские клетки на периферии.

Различные типы глиальных клеток могут быть определены путем введения меток, например, специальных красок в живых препаратах, или с помощью иммунологических приемов (рис. 8.2). Существуют антитела, которые специфически связываются с астроцитами, олигодендроцитамии, микроглией, шванновскими клетками 8). Например, фиброзные астроциты могут быть покрашены с помощью антител к белку GFAP 9) (glial fibrillary acidic protein; рис. 8.2Б).

Как и нейроны в центральной и периферической нервной системах, глиальные и шванновские клетки имеют различное эмбриональное происхождение: глиальные клетки в ЦНС происходят из клеток предшественников, выстилающих нервную трубку, которая представляет собой внутреннюю поверхность мозга. Шванновские клетки происхо-

Рис. 8.3. Нейроны и отростки гпиальных клеток мозжечка крысы. Глиальные клетки слегка окрашены. Нейроны и гпиальные клетки разделены щелью шириной около 20 нм. Нейрональные элементы: дендриты (Д) и аксоны (Ах). Два синапса (Syn) отмечены стрелками.

Fig. 8.3. Neurons and Glial Processes in Rat Cerebellum. The glial contribution is lightly colored. The neurons and glial cells are always separated by clefts about 20 nm wide. The neural elements are dendntes (D) and axons (Ax). Two synapses (Syn) are marked by arrows. (After Peters, Palay, and Webster, 1991.)

Рис. 8.4. Нейроны, глия, внеклеточное пространство и кровь. (А) Нейронально-глиальные и глиально-глиальные взаимодействия. В то время как нейроны и глиальные клетки всегда разделены щелью, глиальные клетки соединены щелевыми контактами (gap junctions). (В) Связи между капиллярами, глией и нейронами в световом и электронном микроскопе. Пути диффузии из капилляров к нейронам проходят через заполненное жидкостью пространство межклеточных щелей. Пропорции клеточных размеров несколько изменены.

Fig. 8.4. Neurons, Glia, Extracellular Space, and Blood. (A) Neuronal-glial and glial-glial relationships. While neurons are always separated from glia by continuous clefts, the interiors of glial cells are linked by gap junctions. (B) Relations of capillaries, glia, and neurons as seen by light and electron microscopy. The pathway for diffusion from the capillary to the neuron is through the aqueous intercellular clefts. Cell dimensions are not in proportion. (After Kuffler and Nicholls, 1966.)

водных и млекопитающих, и обнаружилось значительное сходство между ними 16).

Потенциал покоя глиальных клеток больше (более отрицательный внутри), чем у нейронов. Самые большие значения мембранного потенциала в нейронах не превышают - 75 мВ, в то время как у глиальных клеток мембранный потенциал может достигать -90 мВ. Другим отличительным свойством глиальных клеток является отсутствие распространяющихся потенциалов действия. Лишь в нескольких исследованиях было показано, что глиальные клетки в культуральных условиях способны генерировать регенеративные ответы.

Мембрана глиальной клетки ведет себя как калиевый электрод, т. е. в соответствии с уравнением Нернста для растворов с различными концентрациями ионов калия (глава 5). Другие ионы вносят весьма незначительный вклад в мембранный потенциал17). На рис. 8.5 показана зависимость мембранного потенциала глиальной клетки от наружной концентрации ионов калия [К]0 в логарифмической шкале. Прямая линия — теоретическая зависимость мембранного потенциала с наклоном 59 мВ при 10-кратном изменении

Рис. 8.5. Зависимость мембранного потенциала глиальной клетки от наружной концентрации ионов калия. (А) Схема внутриклеточной регистрации от глиальной клетки. (В) Уменьшение концентрации калия с физиологического уровня (3 ммоль) до 0,3 ммоль вызывает гиперполяризацию мембраны; увеличение внеклеточной концентрации калия до 30 ммоль приводит к деполяризации на 59 мВ. (С) Зависимость между мембранным потенциалом и внеклеточной концентрацией калия, рассчитанная по уравнению Нернста (сплошная линия), точно соответствует экспериментальным данным, за исключением очень низких концентраций калия. Нейроны менее чувствительны к небольшим изменениям концентрации калия в физиологическом диапазоне. RP — потенциал покоя.

Fig. 8.5. Dependence of Glial Membrane Potential on potassium concentration. (A) System for recording from a glial cell in mud puppy optic nerve while changing external potassium concentration. (B) Reducing the potassium concentration from the normal 3,0 mAf to 0,3 mA) hyperpolarizes the membrane; increasing the potassium concentration to 30 mA) depolarizes by 59 mV. (C) The relation between potassium concentration and membrane potential predicted by the Nernst equation (solid line) accurately fits the experimental results, except at very low extracellular potassium concentrations. Neurons are less sensitive than glia to small changes in potassium concentration in the physiological range. RP = resting potential. (After Kuffler, Nicholls, and Orkand, 1966.)

концентрации в соответствии с уравнением Нернста (при 24° С). Эта зависимость значительно отличается от большинства нейронов, мембранный потенциал которых не соответствует рассчитанному по уравнению Нернста в диапазоне физиологических концентраций [К]0 от 2 до 4 ммоль (глава 5).

Распределение калиевых каналов было исследовано на мембране мюллеровских глиальных клеток и астроцитов, изолированных из сетчатки и оптического нерва различных животных: лягушки 18), саламандры 19) и кролика20). Чувствительность к калию максимальна на конце отростка мюллеровской клетки и сравнительно мала на теле. Изолированная мюллеровская клетка саламандры и ответы на аппликацию высокой концентрации калия на ее различные участки показаны на рис. 8.6. На ранних этапах развития калиевые каналы расположены по поверхности мюллеровской клетки более однородно, а повышенная чувствительность к высокому калию на конце ножки появляется только после трансформации головастиков во взрослых лягушек18). Возможное физиологическое значение этого явления обсуждается ниже в этой главе.

Ионные каналы, транспортеры и рецепторы в мембранах глиальных клеток

На мембране глиальных и шванновских клеток, выращиваемых в культуральных условиях,

Рис 8.6. Ответы на повышение внеклеточного калия в мюллеровских глиальных клетках, изолированных из сетчатки саламандры. Ответы на аппликацию раствора с повышенной концентрацией калия на различные участки клетки регистрировались с помощью внутриклеточного электрода. А — концевая ножка мюллеровской клетки, a G — ее дистальная часть. Чувствительность к калию самая большая на концевой ножке, что предполагает более высокую концентрацию калиевых каналов в этом участке клетки.

Fig. 8.6. Responses to Potassium of a Millier Glial Cell isolated from salamander retina. Recordings were made with an intracellular electrode while potassium was applied to different sites. A is the end foot and G is the distal part of the cell. The sensitivity to potassium is much greater at the end foot suggesting a higher concentration of potassium channels in that region. (After Newman, 1987; micrograph kindly provided by E. Newman.)

обнаруживаются разнообразные ионные каналы и транспортеры:

1.При этом, как уже было отмечено выше, доминируют калиевые проводимости 16).

2.На мембранах шван поисках клеток и астроцитов есть потенциалзависимые натриевые и кальциевые каналы21). Обшее соотношение проводимости мембраны мюллеровских клеток к калию и натрию оценивается приблизительно как 100 : 1. Как уже было отмечено выше, активация натриевых и кальциевых каналов не приводит к генерации потенциала действия.

3.Исследование с помощью пэтч-кламп регистрации обнаружило хлорные каналы в шванновских клетках и астроцитах 22).

4.В глиальных клетках присутствуют ионные помпы для транспорта натрия и калия, а также бикарбоната и протонов 23).

5.На мембранах глиальных клеток в большом количестве экспрессированы транспортеры

глутамата, ГАМК и глицина; они захватывают нейромедиаторы, выделяемые нейронами

24).

6. Олигодендроциты, астроциты и шванновские клетки имеют многочисленные рецепторы к нейромедиаторам25).

Электрические контакты между глиальными клетками

Соседние глиальные клетки соединены друг с другом посредством щелевых контактов (глава 7). Этим они напоминают эпителиальные клетки, а также гладкомышечные клетки. Глиальные клетки обмениваются ионами и маленькими молекулами напрямую, минуя внеклеточное пространство, и такие связи могут использоваться для уменьшения концентрационных градиентов 26) - 28). Как отмечалось выше, щелевых контактов между нейронами и глиальными клетками не обнаруживается, и ионные токи через мембраны нейронов не влияют напрямую на близлежащие глиальные клетки.

§ 2. Функции глиальных клеток

На протяжение многих лет практически каждая функция клеток в нервной системе, которая не находила очевидного объяснения, причислялась к функции глиальных клеток. В последующих разделах мы вначале рассмотрим те функции глиальных клеток, которые хорошо установлены, а затем перейдем к вопросам о тех функциях, которые требуют дальнейших исследований.

Рис. 8.8. Локализация миелинового протеина РМР22 в молодых и старых культурах аксонов и шванновских клеток. Возрастные изменения в распределении миелинового протеина РМР22 при совместном культивировании аксонов со шванновскими клетками. (А, В) Недельная культура нейронов (А) и шванновских клеток (В), окрашенных моноклинальными антителами к нейрофиламентам и поликлональной сывороткой к РМР22. Стрелками указаны шванновские клетки, контактирующие с нейрональными отростками. На этом раннем этапе развития распределение глиальных и нейрональных белков значительно различается, и РМР22 в основном находится в теле шванновских клеток. (С, D) Через 4 недели культивирования РМР22 перераспределяется в миелиновые сегменты. Стрелками обозначены аксоны (С) и тела шванновских клеток (D).

Fig. 8.8. Localization of Myelin Protein (PMP22) in shortand long-term myelinating cultures of axons and Schwann cells. Changes in distribution of myelin protein PMP22 induced by coculture of axons with Schwann cells. (A, B) 1-week-old coculture of neurons (A) and Schwann cells (B) doubly stained with monoclonal antineurofilament and polyclonal PMP22 antiserum. Arrows point to Schwann cells that are in contact with neuronal processes. At this early stage the glial and neuronal proteins have different distributions, with PMP22 mainly in Schwann cell bodies. (C, D) After 4 weeks in medium that promotes myelination, PMP22 becomes colocalued with myelin segments (stained by antibody PO). Arrows point to axons (С) and to the cell bodies of elongated Schwann cells (0), with uniform PMP22 staining over the cell membrane. (After Pareek et al., 1997; photos kindly provided by E. Shooter.)

Несколько интересных вопросов возникает относительно связи шванновских клеток и олигодендроцитов с аксонами при формировании миелина. Например, какие генетические и внешние факторы позволяют глиальным клеткам выбирать подходящие аксоны, окружить их в надлежащее время и поддерживать миелиновую оболочку? Каковы характеристики нейрологических нарушений миелина, вызванных заболеванием или генетическими нарушениями? Формирование миелиновой оболочки в процессе развития происходит в результате комплексных и точных взаимодействий между нейронами и глиальными клетками. Расстояние между перехватами, зазор между глиальной клеткой и нейроном в участках, прилегающих к перехватам, распределение натриевых и калиевых каналов регулируется таким образом, чтобы обеспечить быстрое проведение импульса по аксону.

Динамическое взаимодействие между нейронами и шванновскими клетками было исследовано в культуральных условиях, при которых воспроизводятся как развитие самих шванновских клеток, так и процессы миелинизации и ремиелинизации аксонов31). Ключевые белки, участвующие во взаимодействии между шванновскими клетками и аксоном, идентифицированы 9). Например, Шуутер и его коллеги показали, что когда шванновские клетки выращиваются в культуральных условиях сами по себе, то они синтезируют белок периферического миелина (известный как РМР22). В этих условиях оборот РМР22 очень быстр, и он подвергается деградации в эндоплазматическом ретикулуме. Если к этой культуре добавить нейроны (рис. 8.8), то сразу после контакта между нейроном и шванновской клеткой РМР22 перемещается в мембрану щванновской клетки. Это является важным этапом в формировании миелина. Вместе с тем, механизм сигнализации между нейронами и шванновскими клетками пока неизвестен 32, 33).

Точное количество производимого РМР22 является критическим для надлежащей миелинизации; избыточное или недостаточное производство РМР22 является причиной некоторых заболеваний. На рис. 8.9 показано, что замена всего одной аминокислоты в РМР22 (например, лейцина на пролин) приводит у мышей к заболеванию ("trembler"), которое характеризуется дефицитом миелинизации и серьезными неврологическими проблемами. Такая же мутация ответственна за наследственную нейропатию у человека.

Глиальные клетки также алияют на образование кластеров натриевых каналов в миелинизированных нервных волокнах. При миелинизации, димиелинизации и ремиелинизации изменяется распределение ионных

Рис. 8.9. Нарушение миелинизации у мутантной «трясущейся» мыши с генетическим дефектом миелинового белка РМР22. Седалищный нерв в контроле (А) и у «трясущейся» мыши (В). Обращают на себя внимание значительные различия в калибре аксонов и толщине миелиновой оболочки (отмечены стрелками на В). Точечная мутация, приводящая к замене всего одной аминокислоты (лейцина на пролин), вызывает нейропатию у мыши и у человека.

Fig. 8.9. Deficient Myelination in "Trembler" Mutant Mice with a genetic defect in a myelin protein, PMP22. Morphological appearance of sciatic nerves in normal (A) and mutant trembler (B) mice, aged 10 days. Note the marked differences in axon caliber and myelin thickness between normal and trembler mice (indicated by arrows in B) in microscopic sections at equivalent magnifications. Also note the severity of dysmyeli nation A single ammo acid mutation from leucine to proline produces trembler neuropathy in mice and in humans. (After Notterpek, Shooter, and Snipes, 1997.)

каналов в перехватах, участках возле и между перехватами 34) - 35). Эти процессы напоминают кластеризацию рецепторов нейромедиаторов в постсинаптической мембране при формировании синапса. Отростки астроцитов в области перехвата также интенсивно связываются с сакситоксином (токсин, который связывается с натриевыми каналами) (глава 6), что предполагает высокую плотность натриевых каналов на глиальной мембране 36). Было предположено, что натриевые каналы переносятся от астроцитов к перехватам Ранвье 37), однако это интересное предположение не получило пока прямого доказательства.

Глиальные клетки, развитие ЦНС и секреция факторов роста

Основные аспекты развития, в которые вовлечены глиальные клетки, рассматриваются в главе 23. В этой главе мы рассмотрим несколько ключевых ролей, за которые ответственна глия, шванновские клетки и микроглия. Например, глиальные и шванновские клетки секретируют такие молекулы, как фактор роста нервов и ламинин; эти молекулы способствуют росту нейритов, как в культуре, так и в целом организме 38, 39). Был также выделен глиальный белок, стимулирующий рост нейритов, GDN (glial-derived nexin). Monard с коллегами предположили, что GDN, который является сильным ингибитором протеаз, препятствует разрушению молекул экстраклеточного матрикса, которые важны для роста40). Глиальные клетки могут также быть репеллентами, ингибирующими рост нейритов 41). Например, белок, известный как NI-25/250, содержится в миелине и олигодендроцитах. Эта молекула останавливает продвижение вперед конусов роста нейронов и вызывает их коллапс. Белки, ингибирующие рост, могут также участвовать в формировании проводящих трактов в спинном мозге, ограничивая рост нервных волокон в неправильном направлении. Возможные эффекты этих белков на процесс регенерации после повреждения рассматриваются в главе 24.

Во время развития нервной системы глиальные клетки играют роль в апрегации нейронов в ядрах. Ядра и структуры, развивающиеся in situ и в культуральных условиях, в самом начале формируются глиальными клетками 42· 43). Так, например, четко ограниченные группы клеток очерчены глиальными клетками еще до появления нейронов в сомато-сенсорной коре развивающейся мыши (глава 18).

Механизмы, посредством которых радиальные глиальные клетки направляют нейрональную миграцию по время развития, были вскрыты в экспериментах Ракича 44), Хаттена 45, 46) и их коллег (см. также главу 23). В процессе развития коры, гиппокампа и мозжечка человека и обезьяны, нервные клетки мигрируют к местам назначения вдоль отростков глиальных клеток. Движение нервной клетки гиппокампа вдоль радиальной глиальной клетки продемонстрировано