Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Nikolls_-_Ot_neyrona_k_mozgu

.pdf
Скачиваний:
40
Добавлен:
13.03.2016
Размер:
16.96 Mб
Скачать

Глава 3. Структура ионных каналов

53

Рис. 3.3. Модель третичной структуры субъединицы АХР, предположенная из анализа аминокислотной последовательности зтого белка. Каждый из участков М1-М4 образует трансмембранные спирали, а оба терминальных участка (СООН и NH ) находятся во внеклеточном пространстве.

Fig. 3.3. Model of the Tertiary Structure of an AChR Subunit as proposed originally from amino acid sequence analysis. Regions Ml through M4 each form membranespanning helices, and both the carboxy (COOH) terminus and the amino (NH ) terminus of the peptide lie in the extracellular space.

сыграло обнаружение в первичной последовательности белка обширных участков неполярных (и, следовательно, гидрофобных) аминокислот, способных к формированию трансмембранного домена. В оригинальной модели АХР, предложенной Нума с коллегами 9), были идентифицированы четыре такие области (М1-М4, см. рис. 3.2), и была предложена структура, представленная на рис. 3.3. Используя индекс гидрофильности аминокислот в М1-М4 областях, можно самостоятельно проверить аргументированность этих заключений. Согласно последним данным, все трансмембранные участки, за исключением М2, являются скорее β, чем α-спиралями (см.

рис.3.4А).

Как узнать, какая часть молекулы АХР является внеклеточной, а какая внутриклеточной? Прежде всего, на NН2-конце находится относительно гидрофобный участок из 24 аминокислот (рис. 3.2 и 3.5). Эта сигнальная последовательность необходима для проникновения синтезированного в клетке белка АХР в поверхностную мембрану. Следовательно, NН2-конец является внеклеточным. С этим согласуется тот факт, что два соседних цистеиновых остатка в позициях 192 и 193 ассоциированы с внеклеточным центром связывания АХ. Наконец, начальный внеклеточный сегмент составляет около половины от всей молекулы, что согласуется с известным распределением массы рецептора (см. рис. 3.1). Исходя из указанного четного числа трансмембранных участков, СООН-конец также является внеклеточным. Главные характеристики этой модели хорошо согласуются с другими наблюдениями. Например, в условиях плотной упаковки, АХР образуют димеры за счет дисульфидных связей между СООН-концами δ-

субъединиц. Показано также, что такие дисульфидные мостики являются внеклеточными11· 12).

Структура и функция канала

Основной техникой сопоставления функции канала и его структуры является экспрессия ионных каналов в ооцитах Xenopus или в других клетках инъекцией соответствующей мРНК или трансфекцией ДНК с помощью векторов 13). После этой процедуры можно производить запись электрических сигналов либо от фрагментов мембраны, содержащих одиночные каналы, либо регистрировать токи целой клетки (отображающие поведение всей популяции экспрессированных каналов). Этому помогает то, что интактные ооциты сами не экспрессируют АХР. Однако после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей АХР, они не только экспрессируют соответствующие субъединицы белка, но даже чудесным образом обеспечивают их сборку в функционально активные рецепторноканальные комплексы.

Структура ионного канала может быть изменена сайт-направленным мутагенезом. Для осуществления этой методики необходимо сконструировать мутантную кДНК с мутациями, меняющими какой-либо сайт белка ионного канала. Это позволяет добиться того, что выбранные аминокислоты с присущими им физико-химическими свойствами (положительным или отрицательным зарядом, высокополярные или неполярные) заменяются другими аминокислотами с отличающимися свойствами. Функциональные свойства мутантных каналов могут затем быть изучены после экспрессии этого белка в клетках, в которые была введена мутантная кДНК.

54

Раздел П. Передача информации в нервной системе

Эмбриональный и взрослый типы АХР в мышце млекопитающих

По мере развития скелетной мышцы свойства АХР могут изменяться за счет замены эмбрионального типа на взрослый тип АХР. Эмбриональная форма рецептора отличается от взрослой формы АХР более продолжительным временем, которое ионный канал проводит в открытом состоянии, и меньшей проводимостью. В основе изменения свойств рецептора лежит то, что γ-субъединица, характерная для эмбрионального АХР, заменяется ε субъединицей с иной аминокислотной последовательностью 14). Эта связь изменений кинетики ионного канала и его проводимости с набором субъединиц, образующих АХР, подтверждена многочисленными экспериментами по инъекции различных комбинаций мРНК, кодирующей разные субъединицы АХР 15). Ооциты, инъецированные мРНК для α-, β-, γ- и δ-субъединиц, экспрессируют ионные каналы эмбрионального типа. После инъекции мРНК для α-, β-, ε- и δ-субъединиц, экспрессируются каналы со свойствами, подобными АХР в зрелой мышце.

Какие субъединицы АХР выстраивают пору?

Для получения информации об устройстве выстилки поры ионного канала был активно использован сайт-направленный мутагенез субъединиц АХР. Несмотря на наличие общих представлений о третичной структуре субъединиц АХР, наши знания о точном топологическом расположении трансмембранных сегментов и их участии в формировании стенки ионного канала гораздо более поверхностны. Такие характеристики исключительно важны, поскольку структура поры определяет ионную избирательность и проводимость канала. Один из подходов к решению данной проблемы состоит в проведении одной или нескольких мутаций в участке белка, предположительно вовлеченном в выстилку поры, и регистрации следующих за этим изменений избирательности и проводимости канала.

Другой подход может базироваться на способности стенки ионного канала связывать молекулы с определенными физико-химическими свойствами. Например, молекула местного анестетика QX-222 может блокировать ток через ионный канал за счет связывания с определенным сайтом внутри открытого канала АХР. Мутации субъединиц АХР показали, что М2 домены формируют часть стенки открытого канала 16), как изображено на рис. 3.4А. В частности, М2 домены α- и δ-субъединиц АХР мыши содержат следующие аминокислотные последовательности (направление от цитоплазмы к внеклеточной среде, с нумерацией, относящейся к α-субъединице; рис. 3.2):

Можно предположить, что гидрофильные аминокислоты, такие как серии (S) или треонин (Т), скорее всего обращены к водной поре, в то время как гидрофобный изолейцин (I) будет более вероятно контактировать с мембранными липидами. Когда серии из указанных позиций (отмечено подчеркиванием) был заменен слабо гидрофобным аланином, проводимость модифицированных ионных каналов снизилась почти наполовину. Кроме того, у мутантных каналов резко снизился аффинитет для QX—222. Эти эффекты согласуются с идеей о том, что серии образует стенку водной поры ионного канала АХР и вносит вклад в функциональные свойства ионного канала. Предполагается, что все выделенные на приведенном рисунке аминокислоты в составе α-субъединицы принимают участие в образовании контура водной поры. Эти остатки были идентифицированы в экспериментах Карлин с коллегами 17), в которых каждый аминокислотный остаток α-субъединицы от М243 до V261 по очереди заменяли на цистеин. Мутантная α-субъединица была затем экспрессирована в ооциты вместе с интактными)*β, γ и δ-субъединицами. Мембранные токи, продуцируемые АХ, измерялись до и после действия гидрофильного реагента MTSEA (этиламмония метанэтиосульфонат). Реагент мог избирательно реагировать с сульфгидрильной группой цистеина только в том случае, если замешенный цистеин находился в водной фазе. MTSEA ослаблял ответы на АХ (за счет блока ионного канала) в тех случаях, когда мутациям подвергались аминокислоты, выделенные на рисунке (Т244, L245, S248, L250, L251, S252, V255, L258). Эти результаты предполагают модель устройства стенки водной поры, образованной регулярной спиралью белковой молекулы, прерванной в середине вытянутой структурой, содержащей остатки 250, 251 и 252.

Глава 3. Структура ионных каналов

55

·

Рис 3.4. Модель структуры субъединицы АХР, базирующаяся на электронно-микроскопическом изображении. (А) Три спиральных элемента находятся во внеклеточной части канала, окружая и формируя устье АХР, обращенное в синаптическую щель. В пределах плоскости мембраны участки Ml, МЗ и М4 образуют крупные β-спирали. М2 представляет собой изломанную мелкошаговую α-спираль, обращенную в просвет поры. (В) Поперечный срез рецептора, состоящего из пяти субъединиц.

Fig. 3.4. Proposed Model of the AChR Subunit Structure, based on electron microscope imaging. (A) Three helical elements lie within the extracellular region around the synaptic vestibule. Within the plane of the membrane, regions

MX M3, and M4 form a b sheet. M2 is a split a helix extending into the pore region. (B) Cross sections of the complete receptor, consisting of five subunits, in the plane of the membrane. In the closed receptor, the M2 helices extend into the core of the structure. An open pore is created by the rotation of each helix toward the channel wall. The model is not in agreement with biochemical experiments that suggest that the gate is closer to the cytoplasmic end of the pore.

Структура АХР с высоким разрешением

Эффективным подходом для изучения топологии ионных каналов является анализ изображения мембранного белка, полученного электронной микроскопией с высоким разрешением, как показано на рис. 3.1. Д. Анвин18, 19), анализируя изображения АХР в везикулах из постсинаптических мембран Torpedo, достиг разрешения более чем 0,9 нм, раскрыв, таким образом, многие детали функционального устройства этого белка. Пять субъединиц по физическому устройству подобны друг другу, за исключением α- субъединицы, которая имеет «карман», обращенный в синаптическую зону, и служащий, вероятно, центром связывания АХ. Принципиальные характеристики структуры субъединиц АХР суммированы на рис. 3.4А. В каждой субъединице вокруг внеклеточной входной части АХР найдены три участка с плотной упаковкой в виде α-спиралей. Их физические позиции приблизительно такие, как показано на рисунке, но их очередность по отношению друг к другу пока неизвестна. Анализ среза изображения на уровне мембраны указывает на то, что в этой области каждая субъединица состоит только из одной спиральной структуры (вместо ранее предполагавшихся четырех) и обладает заметным изгибом в середине.

В полном рецепторе ансамбль из пяти центральных спиралей обрамлен кольцом плотного материала, образующим подобие звезды (рис. 3.4В). Предполагается, что центральные спирали являются формирующими пору М2 участками, а окружающее кольцо — β- спирали оставшихся 15 трансмембранных доменов (три в каждой субъединице). По расчетам, окружность звездчатого кольца составляет приблизительно 20 нм, что близко к размерам, полученным при анализе изображений, зарегистрированных методом электронной дифракции.

56

Раздел П. Передача информации в нервной системе

Открытое и закрытое состояния АХР

На рис. 3.4А представлена одна из α-субъединиц закрытого АХР, в котором изогнутый М2 участок вдается в пору. Для того чтобы получить изображение открытого АХР, Unwin апплицировал АХ в течение 5 мс перед быстрым замораживанием, захватывая, таким образом, рецепторы в открытом состоянии19). Это достигалось быстрым нанесением АХ на АХРсодержащие везикулы, которые сразу после этого падали в жидкий азот.

Сравнение изображений, полученных без АХ и после действия этого медиатора, показывает, что связывание АХ вызывает вращательное движение спиралей во внеклеточных участках АХР, что передается, по-видимому, на М2 спирали. Каким бы ни был механизм, в М2 спиралях появляется вращательное движение, направленное на перемещение этих участков от центра (см. рис. 3.4В), что в конечном счете приводит к открытию ионного канала АХР.

Точная локализация воротного механизма пока не определена. На основании структурных данных можно предположить, что ворота расположены вблизи изгиба М2 спирали, возможно, соответствуя лейцину в позиции 251 (L251) 19). Однако, эксперименты Karlin и коллег на мутантных каналах, экспрессированных в ооиитах, позволяют предположить, что ворота располагаются гораздо ближе к цитоплазматическому концу спирали20). Эти авторы нашли, что добавленный во внеклеточный раствор водорастворимый блокирующий реагент MTSEA проходил закрытую пору до глубины, соответствующей треонину в позиции 244 (Т244). Если же MTSEA добавлялся с цитоплазматической стороны, он практически не мог проникнуть в закрытый ионный канал АХР.

Разнообразие субъединиц нейронального АХР

После установления аминокислотной последовательности никотинового АХР подобные подходы по изоляции и секвенированию были предприняты по отношению субъединиц никотиновых АХР из вегетативных ганглиев и ЦНС. Эти рецепторы получили название «нейрональные никотиновые рецепторы». Субъединицы, аналогичные α-субъединице мышечного рецептора, были идентифицированы по присутствию соседних цистеиновых остатков в проксимальной части NH2 конца (позиции 192 и 193 на рис. 3.2). Другие субъединицы были определены как "β". Вместе с α<=>, β, )γ<=>, δ*)и ε-субъединицами электрических органов и мышц эти субъединицы формируют семейство общего генетического происхождения.

Из мозга цыпленка и крысы были изолированы II субъединиц21· 22): α2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, a также β2, 3 и 4. Инъекция в ооциты мРНК для α2, α3 или α4 субъединиц с β2 или β4 приводила к формированию функциональных каналов23). Каналы, формирующиеся из 2 или более типов субъединиц, принято называть гетеромультимерными. Экспрессия только лишь α7 субъединиц является достаточным для формирования гомомультимериых ионных каналов22). Это же верно и для α8 или α9 субъединиц. Наличие большого семейства субъединиц, пригодных для формирования канала, предполагает, что они могут быть специфическим образом скомбинированы, формируя разнообразные варианты ионных каналов с отличающимися функциональными свойствами, такими как ионная избирательность, проводимость и кинетические параметры.

Субъединичная композиция нейрональных АХР

Какое количество субъединиц необходимо для формирования нейронального АХР? Это было определено мутациями α- и β-субъединиц АХР цыпленка, менявшими в результате модификации проводимость ионного канала24). Совместная инъекция в ооциты кДНК для нормальной и мутантной α-субъединицы вместе с кДНК, кодирующей нормальную β- субъединицу, давала в результате три различных типа проводимости канала. Один из них был таким же, как проводимость обычных каналов, другой — таким же, как у каналов, кодированных только мутантной кДНК. Третий тип проводимости, по всей видимости, был представлен каналами с одной нативной и одной мутантной α-субъединицей. По наличию одного (и только одного) промежуточного типа было сделано заключение, что обычный АХР содержит две α-субъединицы. Вследствие инъекции нормальной и мутантной β--субъединицы возникли каналы с четырьмя типами проводимости, указывающие на наличие трех не α- субъединиц. На основании этих экспериментов было сделано заключение о том, что нейрональный АХР представляет собой пентамер со стехиометрией (α)2(β)3·

Глава 3. Структура ионных каналов

57

Рис. 3.5.

Гидропатические индексы

 

для

аминокислотных

 

последовательностей α и β-субъединиц САВА рецептора и одной субъединицы АХР. Положительные отклонения соответствуют гидрофобным аминокислотам, а отрицательные значения — гидрофильным остаткам.

·

Fig. 3.5. Hydropathy Indices for the

ammo acid sequences of the GABA α and β subunits and the AChR subunit. Indices are calculated by taking a moving sum of the individual indices of adjacent ammo acids in the sequence. Regions in the positive range are hydrophobic, those in the negative range hydrophilic. Light grey indicates principal hydrophobic regions; the four areas in similar positions toward the carboxy terminus correspond to the Ml through M4 regions of the ACh receptor. Dark grey regions are signal sequences. (Ammo acid numbering includes the signal sequence on the amino terminus.) (After Schofield et al., 1987.)

§ 2. Суперсемейства рецепторов ГАМК, глициновые и 5- НТ рецепторы

Три типа анионных (хлоридных) ионных каналов являются посредниками синаптического торможения в нервной системе. Все три типа каналов активируются аминокислотами: рецепторы типа А и типа С активируются γ-аминомасляной кислотой (ГАМКА25·26) и ГАМКС27) рецепторы) и глициновый рецептор (глиР) — аминокислотой глицином28). Каждый тип рецептора имеет несколько изоформ субъединиц, причем все они гомологичны субъединицам АХР. Например, для ГАМКА рецепторов идентифицировано шесть α-, три β-, три γ-, одна δ- и одна ε-субъединица. 5-НТ3 рецептор для серотонина образует катионный канал с функциональными свойствами, подобными никотиновому АХР29'. Была клонирована субъединица 5-НТ3 рецептора, известная как CEPαl30). По аминокислотному составу CEPαl, как и субъединицы ГАМК и глицинового рецепторов, сходна с субъединицами никотинового АХР.

Хотя АХ и 5-НТ3 рецепторы являются катион-избирательными, а ГАМК и глициновый рецепторы — анион-избирательными, сходство аминокислотных последовательностей в их субъединицах позволяет предположить, что все четыре семьи рецепторов имеют общее генетическое происхождение. Вместе они образуют общее генетическое суперсемейство31). Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей предполагает, что структуры более высокого порядка также будут подобны. Свидетельство такого структурного подобия представлено на рис. 3.5, на котором сравнивается индекс водорастворимости последовательных аминокислот, входящих в состав двух субъединиц ГАМКА рецептора и α- субъединицы АХР. Как ясно следует из этого рисунка, все три пептида имеют сходные, профили с четырьмя гидрофобными последовательностями между аминокислотными остатками 220 и 500, указывающие на сходные трансмембранные домены. Подобные гидропатические профили показаны и для субъединиц глицинового и 5-НТ3 рецепторов. Таким образом, предполагаемая третичная структура субъединиц глицинового, ГАМК и 5-НТ, рецепторов аналогична таковой у субъединиц АХР (см. рис. 3.3).

58

Раздел II. Передача информации в нервной системе

Ионная избирательность лиганд-активируемых ионных каналов

Может вызвать удивление тот факт, чтр одно и тоже суперсемейство включает как катионные, так и анионные каналы. Каким образом селективность ионных каналов может различаться при столь очевидном структурном подобии? Одной из характерных черт строения ионных каналов является то, что их внемембранные части значительно выдаются над поверхностью мембраны (например, см. рис. 3.1). Unwin32) отмечает, что в катионных каналах стенки выступающего вестибюля канала имеют избыточный отрицательный заряд, тогда как анионные каналы в этих местах заряжены избыточно положительно. Так как открытый канал имеет около 2 нм в диаметре, а эффективный радиус электростатического взаимодействия в физиологических растворах составляет около 1 нм, положительный заряд в вестибюле канала может способствовать аккумуляции в нем отрицательных ионов, например, хлоридов в устье глицинового рецептора. Наоборот, в катионном канале в отрицательно заряженном вестибюле могут накапливаться положительно заряженные натрий и кальций. Аккумуляция ионов в вестибюле может способствовать процессу отбора анионным каналом анионов, а катионным каналом — катионов. Надо учесть также, что аккумуляция ионов будет способствовать увеличению проводимости каналов (напомним, что проводимость канала зависит от концентрации ионов).

§ 3. Потенциал-активируемые каналы

К каналам, специфически активируемым деполяризацией клеточной мембраны, относятся потенциал-активируемые натриевые каналы, отвечающие за фазу деполяризации потенциала действия, и потенциал-активируемые калиевые каналы, ассоциированные, с мембранной реполяризацией. В эту группу также входят потенциал-активируемые кальциевые каналы, которые в некоторых тканях отвечают за генерацию потенциала действия и поддержание длительной деполяризации, а также выполняют много других функций, таких как мышечное сокращение и освобождение нейротрансмиттеров. Каждое из этих трех семейств каналов имеет ряд изоформ, представленных у различных биологических видов и в разных частях нервной системы. Подобно АХР и его аналогам, они также составляют суперсемейство единого генетического происхождения.

Потенциал-активируемые натриевые каналы

Методы, которые были использованы для характеристики молекулярной структуры АХР, были также успешно применены к потенциал--активируемым каналам. Ключевыми шагами в этом процессе были биохимическая экстракция и изоляция протеина33) - 35) с последующим выделением клонов кДНК и расшифровкой аминокислотной последовательности36). Также как в случае АХР, электрические рыбы — на этот раз угорь Electrophorus electricus — явились богатым источником канального белка, а высокоаффинные токсины, такие как тетродотоксин (ТТХ) и сакситоксин (STX), обеспечили процесс изоляции протеина. Оба этих токсина блокируют ионную проводимость нативных каналов, закупоривая пору открытого канала. Позже натриевые каналы были изолированы из мозга и скелетной мышцы. Натриевый канал, выделенный из электрического угря, состоит из одного крупного (260 кД) пептида и является типичным представителем семейства структурно сходных протеинов.

В мозге млекопитающих ключевая 260 кД α-субъединица натриевого канала ассоциирована с двумя дополнительными субъединицами: β1 (36 кД) и β2 (33 кД). Показано, что присутствие β1 -субъединицы значительно повышает скорость инактивации натриевого канала 37). В мозге было найдено несколько различных вариантов мРНК, кодирующих α-субъединицу, что объясняет наличие разных подтипов натриевого канала. По крайней мере два дополнительных изоформы натриевого канала выделены из скелетной мышце млекопитающих — одна из взрослой мышцы (RSkMl)38), и другая, характерная для эмбриональной или денервированной мышцы (RSkM2)39). Третья изоформа этого канала обнаружена в сердечной мышце

Глава 3. Структура ионных каналов

59

 

 

Рис. З.6. Структура потенциал активируемых каналов. (А) Потенциал активируемые натриевые каналы, представляющие одну белковую молекулу с четырьмя доменами (I-IV), соединенными внутриклеточными петлями. Каждый домен имеет шесть трансмембранных участков (S1-S6). Структура, формирующая ионную пору, располагается между пятым и шестым сегментом. (В) Структура потенциал-активируемых кальциевых каналов подобна таковой натриевого канала. (С) Субъединица калиевого канала похожа на одиночный домен натриевого канала. (D) Предполагаемая трехмерная структура канала.

Fig. З.6. Figure 3.6 Voltage-Activated Channel Structure. (A) Voltage-activated sodium channel, represented as a single protein with four domains (I-IV) connected by intracellular loops. Each domain has six transmembrane segments (S1-S6), with a pore-forming structure between the fifth and sixth. (B) The structure of voltage-activated calcium channels is similar to that of the sodium channel. (C) The potassium channel subunit resembles a single domain of the sodium channel. (D) The proposed three-dimensional channel structure, with the domains in a circular array and the S5-S6 connectors dipping into the pore. The relative positions of SI through S6 in each domain are not known and thus are shown arbitrarily.

60

Раздел II. Передача информации в нервной системе

млекопитающих40). После трансляции происходит интенсивное гликозилирование канального белка. Так, около 30 % массы натриевого канала угря составляют углеводы, содержащие большие количества сиаловой кислоты.

Аминокислотная последовательность и третичная структура натриевого канала

Натриевый ионный канал угря представляет собой пептид с последовательностью из 1832 аминокислот, в котором выделяют четыре следующих другом за другом домена (I-IV), каждый из которых содержит от 300 до 400 остатков. Эти домены имеют примерно 50%-ную гомологию аминокислотных последовательностей. Каждый домен является структурным эквивалентом одной субъединицы канальных белков семейства АХР. Однако в отличие от АХР все домены натриевого канала соединены вместе в единый белок. В пределах каждого домена есть множественные гидрофобные или смешанные гидрофобно/гидрофильные (амфотерные) последовательности, обеспечивающие формирование трансмембранных сегментов.

Согласно общепринятой модели топологии канала (рис. 3.6А) каждый домен имеет шесть таких трансмембранных сегментов (S1-S6). Так же как в случае АХР, домены натриевого канала располагаются кольцом вокруг поры ионного канала (рис. 3.6D). Особенно интересен сегмент S4, который имеется во всех четырех доменах и несет положительно заряженный аргининовый или лизиновый остаток в каждой третьей позиции трансмембранного сегмента. Предполагается, что это свойство обеспечивает чувствительность канала к электрическому полю и оно имеется у всех потенциал-активируемых ионных каналов (глава 6).

Потенциал-активируемые кальциевые каналы

Семейство потенциал-активируемых кальциевых каналов содержит несколько подтипов, которые были классифицированы по их функциональным свойствам, таким как чувствительность к деполяризации мембраны и продолжительность открытого состояния (табл. 3.1) 41· 42). Изоформы кальциевых ионных каналов были клонированы из скелетной, сердечной и гладкой мышцы, а также из мозга. Аминокислотная последовательность первичной канал-формирующей субъединицы (α?) подобна аналогичной субъединице потенциал-активируемого натриевого канала43). В частности, трансмембранные сегменты S1— S6 гомологичны таковым натриевого канала. На основании этого предполагается, что кальциевый и натриевый каналы имеют одинаковую третичную структуру (рис. 3.6В).

Хотя для формирования функционирующего кальциевого канала в чужеродных клетках достаточно только α?-субъединицы, в нативных клеточных мембранах найдены три дополнительные субъединицы: α2δ, димер с внеклеточным α2-пептидом, связанным с трансмембранным δ-пептидом дисульфидной связью; β, внутриклеточный примембранный белок, и γ, интегральный белок с четырьмя трансмембранными доменами. Коэкспрессия различных комбинаций субъединиц позволила предположить, что α2δ- и β-субъединицы влияют как на проводимость канала, так и на его кинетику, а γ-субъединица обеспечивает потенциал-чувствительность канала44).

Потенциал-активируемые калиевые каналы

Потенциал-чувствительные калиевые каналы играют важную роль в процессах возбудимости и проводимости. Целый ряд разных генов кодирует разнообразные типы калиевых каналов. Первый калиевый канал, у которого была установлена аминокислотная последовательность, был выделен у Drosophila. Он был назван Shaker по генетическому мутанту, у которого был обнаружен дефект этого канала45). Особенность этих мутантных мушек заключалась в том, что они трепетали (shaking), когда для их подсчета их анестезировали эфиром. Столь легко распознаваемая мутация обеспечила удобный методический подход для клонирования этого калиевого канала, не требующий обязательной идентификации белка. Генетический анализ позволил установить область примерного расположения гена Shaker в геноме Drosophila. Последующее сопоставление нормальной и мутантной последовательностей в этой области привело к идентификации гена shaker.

Неожиданным было то, что аминокислотная последовательность полученного белка оказалось намного короче таковой у потенциал-активируемого натриевого или кальциевого канала. Пептид калиевого канала содержал

Глава 3. Структура ионных каналов

61

Таблица 3.1. Функциональная классификация потенциал-зависимых кальциевых каналов и соответствующие клоны субъединиц.

Table 3.1. Functional classification of voltage-activated calcium channels and corresponding clones of a subunits.

a Designations T, L, and N originally meant Transient, Long-lasting, and Neither Т nor L; Ρ refers to Purkinje cells.

b HV and LV indicate high-voltage and low-voltage thresholds for opening. c Lowercase designations a and b indicate splice variants.

только один домен (см. рис. 3.6В), подобный IV домену натриевого канала угря. Экспериментальные данные указывают на то, что в мембране отдельные субъединицы калиевого канала объединяются, формируя мультимерные ионные каналы46). У Drosophila были клонированы четыре отдельных подсемейства калиевых каналов (названные Shaker, Shab, Shaw, Shal). У млекопитающих найдены аналоги для всех этих типов (табл. 3.2). Каждое подсемейство представлено различными изоформами (Shakerl, Shaker2 и т.д.). Изоформы одного и того же подсемейства после экспрессии способны формировать гетеромультимерные

каналы, тогда как изоформы, принадлежащие разным подсемействам, такой способностью не обладают47).

Подобно натриевому и кальциевому каналам, потенциал-активируемые калиевые каналы обычно экспрессируются вместе с дополнительными (β) субъединицами48). Идентифицировано два подсемейства этих дополнительных субъединиц: Κνβ1.1-Κνβ1.3 и Κνβ2.1. Экспрессированные с основными субъединицами, β-субъединицы определяют потенциал-чувствительность и инактивационные свойства калиевых каналов.

Сколько субъединиц в калиевом канале?

Сравнение структуры калиевого канала со строением родственных натриевого и кальциевого каналов (рис 3.6) позволило высказать предположение, что полноценный калиевый канал представлен ансамблем четырех субъединиц (тетрамером). Для изучения этого вопроса были проведены эффектные эксперименты с блокатором калиевого канала charybdotoxin (СГХ) в сочетании с использованием мутантов, резистентных к данному токсину49). Субъединицы нативного и мутантного типов калиевого канала Drosophila были экспрессированы в ооцит в разных пропорциях. При использовании только нативных субъединиц калиевого канала, формирующих гомомультимерные каналы, калиевые токи в мембране ооцита полностью блокировались высокими концентрациями СТХ. Мутантные каналы при этом практически не блокировались.

Таблица 3.2. Гены субъединиц потенциал-зависимого калиевого канала у дрозофилы и соответствующие гены млекопитающих.

Table 3.2. Voltage-activated potassium channel subunit genes in Drosophila, and corresponding mammalian genes.

Drosophila gene

Mammalian genes

 

 

Shaker 1 to 12

Kv 1.1 to 1.12

 

 

Shab 1 and 2

Kv2.1 and 2.2

Shaw 1 to 4

Kv3.1 to 3.4

Shal 1 and 2

Kv4.1 and 4.2

62

Раздел II. Передача информации в нервной системе

Токи в ооцитах, инъецированных как мутантной, так и нативной мРНК, блокировались лишь частично.

Для трактовки этих экспериментов ключевое значение имел тот факт, что связывание СТХ даже одной субъединицей канала уже достаточно для блокирования всего канального комплекса и прекращения тока. Следовательно, в ооцитах, инъецированных смесью нативного и мутантного типов, незатронутыми токсином останутся только гомомультимерные каналы, образованные исключительно мутантными субъединицами. Фракция таких каналов, сформированных случайной ассоциацией субъединиц нативного и мутантного типов, может быть подсчитана по соотношению количества инъецированной мРНК для мутантного и нативного типов канала. Например, если канал состоит из четырех субъединиц и 90% РНК является мутантной, то вероятность формирования каналов, состоящих только из мутантных субъединиц, составит ([0,9]4), или 66%. Оставшиеся 34 % каналов будут иметь по меньшей мере одну субъединицу нативного типа и будут подвержены блокирующему действию токсина. Аналогичный подсчет предсказывает, что блокирующий эффект СТХ должен составить 27 % для каналов-тримеров (каналов, состоящих из 3 субъединиц) и 41 % для пентамеров (5 субъединиц). Поскольку в указанных экспериментах наблюдалось блокирование каналов на 34%, удивительно совпадающее с предсказанием, было сделано заключение о тетрамерной структуре калиевых каналов.

Строение поры потенциал-активируемых каналов

Общим признаком аминокислотных последовательностей всех потенциал-активируемых каналов является умеренно гидрофобный участок во внеклеточной петле между S5 и S6 сегментами (рис. 3.6). Так же как в экспериментах, описанных ранее для М2 участка АХР, мутации в этом участке калиевого канала Shaker снижали сродство канала для блокирующего действия тетраэтиламмония (TEA) и изменяли проводимость канала50· 51). Было сделано заключение, что этот участок погружен вглубь канала и принимает участие в формирования ионной поры52). Этот вывод подтверждался также данными рентгеновской дифракции канала (см. рис. 3.7). Петля S5—S6 формирует короткую спираль, которая погружена в центр канала; аминокислоты, восходящие от нижнего конца спирали, образуют верхнюю часть ионной поры (см. рис. 3.6D). Мутации в области поры существенно затрагивают ионную избирательность потенциал-активируемых ионных каналов. Например, в натриевых каналах мозга крысы замена в области поры в третьем домене положительно заряженного глутамата на отрицательно заряженный лизин приводит к появлению характеристик, свойственных кальциевым каналам53). Вместо селективной проницаемости для натрия мутантный канал имеет низкую избирательность для моновалентных катионов. Кроме того, при физиологических концентрациях ионов, большая часть тока через такой канал обеспечивается кальцием.

Анализ структуры калиевого канала с высоким разрешением

Структура калиевых каналов Streptomyces lividans (KCSA каналы) была изучена рентгеновской кристаллографией с разрешением 3,2А54). Бактериальные каналы относятся к классу калиевых каналов, субъединицы которых вместо шести трансмембранных доменов имеют только два. Другим примером такого двух-доменного белка является калиевый канал внутреннего выпрямления, который будет обсуждаться позже (см. рис. 3.8). Два сегмента калиевого канала являются структурными эквивалентами сегментов S5 и S6 в потенциал-активируемых каналах. Несмотря на разное число трансмембранных сегментов, аминокислотная последовательность в пору-формирующей петле S5-S6 удивительно консервативна у всех калиевых каналов 53· 55). Преимуществом исследования бактериального калиевого канала является то, что он может быть продуцирован в больших количествах, достаточных для кристаллизации, что делает возможным проведение рентгеновской дифракции.

KCSA канал является тетрамером. Рис. 3.7 представляет канал в разрезе и показывает большую часть его структурных деталей. Рядом с NH2-концом каждой субъединицы имеется наружная спираль, которая пронизывает мембрану от цитоплазматической стороны до наружной поверхности. За наружной спиралью следует короткая спираль, направленная в пору. Затем располагается внутренняя спираль, которая возвращается к цитоплазматической стороне. Соединяющие петли меж-

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]