Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Nikolls_-_Ot_neyrona_k_mozgu

.pdf
Скачиваний:
40
Добавлен:
13.03.2016
Размер:
16.96 Mб
Скачать

Глава б. Ионные механизмы потенциала действия

113

Если потенциал выше порогового, то увеличение натриевой проводимости достаточно для того, чтобы натриевый ток значительно превзошел калиевый и реполяризации не возникло. Если, напротив, потенциал мембраны ниже уровня порога, то увеличение gNa не будет достаточно большим, и калиевый ток приведет к гиперполяризации.

Каков механизм возникновения рефрактерного периода? Во время потенциала действия происходят два процесса, в результате которых нейрон не способен какое-то время генерировать следующий потенциал действия. Во-первых, инактивация натриевых каналов достигает наибольшего уровня во время фазы спада потенциала действия, и на ее устранение необходимо несколько миллисекунд. Во-вторых, благодаря активации калиевых каналов, gК очень высока на спаде потенциала действия, и постепенно возвращается к уровню покоя. В этих условиях для возбуждения каких-либо деполяризующих регенеративных процессов потребовалось бы очень большое увеличение gNa. Два вышеприведенных фактора приводят мембрану в состояние абсолютной рефрактерности, которое поддерживается в течение фазы спада потенциала действия и характерно тем, что никакая деполяризация мембраны не способна запустить следующий регенеративный процесс. После абсолютной рефрактерности наступает период относительной рефрактерности, в ходе которого порог постепенно снижается к своему нормальному значению, натриевые каналы восстанавливаются из инактивированного состояния, а калиевые каналы закрываются.

Достижений Ходжкина и Хаксли в детальном объяснении столь сложных биофизических процессов трудно переоценить. Даже несмотря на то, что более поздние эксперименты по регистрации одиночных каналов дополнили наши знания о молекулярных механизмах мембранных процессов, без ранних опытов с фиксацией потенциала и их интерпретации невозможно было бы определить, каким образом происходит генерация и проведение потенциала действия на основе одних лишь данных об одиночных каналах. Все последующие исследования лишь обогатили, но ни в коем случае не упразднили данных, полученных первопроходцами.

Токи воротного механизма

Ходжкин и Хаксли высказали предположение, что активация натриевого канала связана с перемещением внутри мембраны заряженных структур, или частиц. Они предположили, что подобное перемещение вносит вклад в емкостной ток, производимый деполяризационным скачком. После того как были разрешены некоторые технические проблемы, эти токи воротного механизма удалось, наконец, увидеть16, 17).

Как отличить воротный ток от обычного емкостного тока, возникающего в результате скачкообразного изменения потенциала (см., например, рис. 6.3)? Токи, обусловленные исключительно процессами зарядки и разрядки мембраны, должны быть симметричными. Другими словами, их величина должна быть одинакова как для деполяризующих, так и для гиперполяризующих скачков потенциала. Напротив, токи, связанные с натриевыми каналами, должны возникать в ответ на деполяризацию (к примеру, от -70 мВ до -20 мВ), но не в ответ на гиперполяризацию с того же начального потенциала. Иными словами, если канал уже закрыт, то в ответ на дальнейшую гиперполяризацию ток не возникнет. Сходным образом воротные токи, связанные с закрытием канала, должны протекать в момент окончания деполяризующего, но не гиперполяризующего скачка потенциала. Таким образом, один из возможных способов записи воротного тока состоит в сложении токов, производимых скачками потенциала одинаковой величины и противоположной полярности. Асимметрия, связанная с наличием воротных токов, проиллюстрирована на рис. 6.9А, части а и b. Ток, протекающий в начале деполяризующего скачка, больше тока, вызванного гиперполяризацией, благодаря дополнительному перемещению заряда в связи с работой воротного механизма натриевого канала. При сложении двух токов (рис. 6.9А, с) получается воротный ток (или «ток асимметрии») в чистом виде.

На рис. 6.9В показан пример воротного тока в аксоне кальмара, полученный способом взаимного вычитания емкостного тока. Потенциалзависимые калиевые токи были заблокированы при помощи TEA. Скачкообраз-

114

Раздел II. Передача информации в нервной системе

Рис. 6.9. Воротный ток натриевого канала. (А) Принцип разделения воротного и емкостного токов. (В) Пример воротного тока с последующим натриевым. (С) Изолированный воротный ток в присутствии ТТХ.

Fig. 6.9. Sodium Channel Gating Current. (A) Method of separating gating current from capacitative current. A depolarizing pulse (a) produces capacitative current in the membrane, plus gating current. A hyperpolarizing pulse of the same amplitude (b) produces capacitative current only. When the responses to a hyperpolarizing and a depolarizing pulse are summed (c), capacitative currents cancel out and only gating current remains.

(B) Record of current from a squid axon in

response to a depolarizing pulse, after cancellation of capacitative current. Inward sodium current was reduced by lowering extracellular sodium to 20 % of normal. The small outward current (arrow) preceding the inward current is the sodium channel gating current. (C) Response to depolarization from the same preparation after adding TTX to the bathing solution, recorded at higher amplification. Only the gating current remains. (B and С after Armstrong and BezanilU, 1977.)

ная деполяризация перфузированного аксона кальмара вызвала сначала воротный ток, а вслед за ним входящий ток натрия. Натриевый ток в данном случае гораздо меньше обычного, поскольку внеклеточная концентрация натрия снижена до 20% от нормы. На рис. 6.9С показан воротный ток в чистом виде, зарегистрированный после того, как натриевый ток был полностью устранен с помощью тетродотоксина (обратите внимание на изменение вертикальной шкалы). Данные о том, что ток асимметрии действительно связан с активацией натриевых каналов, собраны в обзоре Армстронга18).

Активация и инактивация одиночных каналов

Использование метода patch-clamp позволило получить подробную информацию о том, как натриевые каналы отвечают на деполяризацию. Один из экспериментов с использованием этого метода приведен на рис. 6.10. Ток регистрировался от мышечного волокна крысы в культуре, в режиме cell-attached19). Для устранения инактивации натриевых каналов мембрана была гиперполяризована на некоторое время до —100 мВ. Затем через пэтч--электрод была приложена деполяризация величиной 40 мВ приблизительно на 20 мс (рис. 6.10В, а). Приблизительно в 30 % случаев активации натриевых каналов в ответ на деполяризацию не было. В остальных случаях одиночные каналы открывались один или два раза, и наиболее часто это происходило в самом начале деполяризации (рис. 6.10В,Ь). Средний ток составил 1,6 пА. Если допустить, что натриевый равновесный потенциал равен +30 мВ, то потенциал, создающий движущую силу для натрия, составит приблизительно -90 мВ; следовательно, проводимость одиночного канала равна 18 пСм. Эта величина сравнима с проводимостью натриевых каналов, измеренной в различных типах клеток. Просуммировав 300 отдельных токов одиночных каналов (рис. 6.10В, с), получим входящий ток, временной ход которого совпадает с током, протекающим в мембране целой клетки.

Как видно из рис. 6.10, среднее время пребывания канала в открытом состоянии (0,7 мс) невелико в сравнении с временным

Глава б. Ионные механизмы потенциала действия

115

Рис. 6. 10. Токи натриевых каналов. (А) Схема опыта. (В) Токи одиночных каналов в ответ на повторные деполяризующие скачки потенциала.

Fig. 6.10. Sodium Channel Currents recorded from cell-attached patch on a cultured rat muscle cell. (A) Recording arrangement. Vc - the command potential applied to the membrane patch. (B) Repeated depolarizing voltage pulses applied to the patch, with the waveform shown in (a), produce single-channel currents (downward deflections) in the nine successive records shown in (b). The sum of 300 such records (c) shows that channels open most often in the initial 1 to 2 ms after the onset of the pulse, after which the probability of channel opening declines with the time constant of inactivation. (After Sigworth and Neher,

1980.)

ходом суммарного тока. Константа времени спада последнего (около 4 мс) не отражает то время, в течение которого отдельные каналы открыты. Время спада суммарного тока связано временем снижения вероятности открытия канала. Процессы активации (m3) и инактивации (h) отражают сначала увеличение, а затем снижение вероятности того, что канал откроется в данный момент на короткое время. Произведение этих двух величин (m3h) описывает временной ход обобщенного изменения вероятности, которая быстро возрастает в начале деполяризации, достигает максимального значения, а затем постепенно спадает. При каждом отдельном деполяризующем скачке канал может открыться в самом начале, в середине или в конце деполяризации, или вовсе не открыться.

Обратимся вновь к рис. 6.9. Из рисунка видно, что перемещение заряда практически заканчивается в течение 0,5 мс, до того, как натриевый ток достигнет максимального значения, т. е. до того, как большинство каналов перешло в открытое состояние. Отсюда следует, что изменение конформации белковой молекулы канала, связанное с перемещением зарядов внутри мембраны, отлично от изменения конформации, связанного с открытием канала. Неверно было бы, следовательно, говорить об этих зарядах как о некоей «ручке», непосредственно открывающей ворота канала. Перемещение зарядов означает лишь то, что вероятность перехода канала в открытое (или инактивированное) состояние возросла.

§ 3. Молекулярные механизмы активации и инактивации

Воротные механизмы потенциалзависимых каналов

Данные исследований структуры потенциал--зависимых каналов указывают на то, что воротный механизм расположен недалеко от цитоплазматической части поры (глава 2). Один

из открытых вопросов заключается в том, как именно ворота канала зависят от мембранного потенциала. Для того, чтобы потенциалзависимый воротный механизм функционировал, необходимо наличие заряженных элементов в составе белка канала, которые меняют свое положение при деполяризации. Именно такое перемещение заряда отвечает за возникновение воротного тока. Одной из структур, привлекших особое

116

Раздел II. Передача информации в нервной системе

Рис. 6.11. Предполагаемое смещение спирали S4 деполяризацией мембраны. (А) Состояние покоя. (В) Деполяризованное состояние, вызывающее открытие канала.

Fig. 6.11. Proposed Shift of S4 Helices by membrane depolarization. Charged S4 helices are represented in two of the four domains of a voltage-activated sodium channel. (A) At the resting potential the helices are held against the inner end of the channel and the channelgating elements are closed. (B) Depolarization causes outward movement of the positively charged helices, allowing the gate to open.

внимание исследователей в этой связи, является спираль S4, пронизывающая мембрану и содержащая цепочку положительно заряженных аминокислот, а именно, лизина или аргинина, расположенных на каждой третьей позиции на данном участке молекулы (рис. 6.11). Это общее свойство всех членов супер-семейства потенциал--зависимых каналов навело ученых на мысль о том, что спираль S4 играет роль потенциал--чувствительного элемента, обеспечивающего связь между мембранным потенциалом и работой воротного механизма 20). Таким образом, деполяризация мембраны (т.е. увеличение положительного заряда внутри клетки) должна вызвать смещение положительных зарядов в направлении внеклеточной среды, поэтому вся спираль переместится в том же направлении (рис. 6.11В), а вероятность открытия канала увеличится. Механизм увеличения вероятности еще не изучен полностью.

Для проверки этой гипотезы были произведены направленные мутации гена, кодирующего область S4 молекулы натриевого канала мозга крысы 21). Нейтральные или кислые аминокислотные остатки заменили на один или более щелочных остатков, с тем чтобы исследовать их влияние на активацию канала. Гипотеза состояла в том, что если удалить положительные заряды из спирали, то для активации канала потребуется более высокий уровень деполяризации мембраны. Данное предположение подтвердилось, когда мутации затрагивали участки молекулы поблизости от ее цитоплазматического окончания. Подобные результаты были получены в результате экспериментов с мутациями S4 калиевых каналов типа А22).

Биохимические эксперименты на каналах--мутантах также подтвердили, что активация канала сопровождается изменениями в сегменте S4 23, 24). В этих экспериментах аминокислотные остатки по обеим концам спирали были заменены на цистеин. Затем исследовали доступность сульфгидрильных групп цистеина для гидрофильных реагентов (глава 3). Аминокислоты, которые были недоступны с внеклеточной стороны мембраны в состоянии покоя, во время деполяризации становились доступными. В то же время те остатки, которые были доступны изнутри, становились недоступными во время деполяризации, что указывало на перемещение спирали в сторону внеклеточной поверхности мембраны.

Обобщим вышесказанное. Несмотря на недостаточность экспериментальных данных, можно с высокой степенью надежности допустить, что перемещение спирали S4 в направлении наружной поверхности мембраны представляет собой первый этап воротного механизма. В состоянии покоя отрицательный внутриклеточный заряд притягивает спираль в направлении цитоплазмы. В момент деполяризации снижение величины отрицательного заряда позволяет спирали переместиться в противоположном направлении. Перемещение S4 влечет за собой дополнительные изменения конформации белковой молекулы, которые в конце концов приводят к открытию канала.

Глава 6. Ионные механизмы потенциала действия

117

Рис. 6.12. Модель инактивации потенциалзависимого калиевого канала «шар на цепочке». (А) Воротный механизм на внутренней стороне рецептора в открытом состоянии. (В) Один из четырех инактивационных «шаров» блокирует устье канала.

Fig. 6.12. Ball and-Chain Model of Inactivation of a voltage-activated potassium channel. The figure shows the complete channel with one ball-and-chain element tethered to each of the four channel subumts. (A) Gating elements at the inner (cytoplasme) end of the channel are open. (B) One of the four inactivation balls enters the inner vestibule to block the open channel.

Инактивация натриевого канала

Из экспериментов Ходжкина и Хаксли с пре-деполяризацией и пре-гиперполяризацией мембраны следует, что инактивация представляет собой самостоятельный процесс, отделимый от активации. Последующие эксперименты с использованием проназы подтвердили эти гипотезу. После перфузии внутриаксонной среды раствором проназы (смеси протеолитических ферментов) процесс инактивации замедлился, а затем полностью исчез 25). Внеклеточное приложение ферментов в той же концентрации не имело эффекта. Очевидно, проназа разрушила часть цитоплазматического окончания белка, отвечающую за инактивацию канала. На основании этих данных Армстронг и Безанилла разработали модель «шара на цепочке», по которой внутриклеточная блокируюшая частица (шар), закрепленная на цитоплазматическом окончании белковой молекулы канала посредством гибкого соединения (цепочки), при своем раскачивании способна блокировать канал во время инактивации 26).

В результате экспериментов на натриевых каналах удалось идентифицировать внутриклеточную петлю, состоящую из аминокислотных остатков, которая участвует в процессе инактивации. В петле содержится приблизительно 45 остатков, и она подобна булавке, которая, раскачиваясь из стороны в сторону, входит во внутриклеточное устье канала и тем самым блокирует его. В исследовании на каналах мозга крысы, экспрессированных в ооцитах, были выделены три аминокислотных остатка, расположенные в средней части петли, которые необходимы для инактивации 27, 28). Удаление или замена этих остатков методом направленного мутагенеза приводит к ослаблению или устранению инактивации. Подобного рода эксперименты помогли также выявить группы пролиновых и глициновых остатков на обоих концах петли, участвующей в инактивации. Их принято считать местами «подвески», позволяющей булавке попасть в устье канала 29).

Кроме того, активация и инактивация натриевых каналов зависят от группы гидрофобных токсинов, включающей в себя вератридин, алкалоид из растений семейства лилий, и батрахотоксин, получаемый из кожи южноамериканской лягушки. Эти токсины полностью устраняют инактивацию, так что каналы остаются открытыми сколь угодно долго30).

Кроме того, они смещают потенциалзависимость активации каналов таким образом, что они открываются при потенциале покоя.

Инактивация калиевого канала типа А

Внутриклеточная структура, связанная с инактивацией, была впервые идентифицирована для калиевых каналов А—типа дрозофилы (глава 3), которые, в отличие от натриевых каналов, инактивируются во время деполяризации. Экспериментально показано, что инактивация зависит от цепочки внутриклеточных аминокислот и происходит по схеме «шара на цепочке», предложенной ранее для натриевых каналов. Модель проиллюстрирована на рис. 6.12. Шар соответствует сгустку аминокислот, а цепочка — последовательности аминокислотных остатков, связывающих шар с основной структурой канала в целом. Во время деполяризации шар связывается с посадочным местом в устье канала, тем самым блокируя его.

Для экспериментальной проверки данной модели исследовали поведение каналов, экспрессированных в ооцитах генами, кодирующими субъединицы-мутанты (напомним, что А—канал представляет собой тетрамер, а не одиночный полипептид). Около 80 аминокислот на участке между N-концом

118

Раздел П. Передача информации в нервной системе

и первой мембранной спиралью S1 были удалены или мутированы31). Канал, состоящий из субъединиц с устраненными аминокислотами (с 6 по 46), практически не демонстрировал инактивации, что указывает на участие некоторых из этих аминокислот в процессе инактивации. При добавлении в раствор, омывающий цитоплазматическое окончание канала, синтетического пептида, содержащего первые 20 аминокислот N-терминали в соответствующей последовательности, инактивация была восстановлена и обладала линейной концентрационной зависимостью в диапазоне от 0 до 100 мкМ32). Эти замечательные наблюдения убедительно показали, что первые 20 аминокислот калиевого Α-канала ответственны за блокирующее действие в процессе инактивации. Этот тип инактивации калиевых каналов зачастую называют N-типом, благодаря участию в нем N-терминали. Некоторые типы калиевых каналов обладают также свойством С-инактивации, более медленной, получившей свое название из-за первоначального предположения об участии в ней С— терминали. Впоследствии, однако, было показано, что С—инактивация связана со структурами, расположенными недалеко от внешнего устья поры канала 33, 34).

Кинетические модели активации и инактивации каналов

Обнаружив, что временной ход активации натриевых и калиевых каналов лучше всего описывается экспонентами, возведенными в третью или четвертую степень (m3 и n4), Ходжкин и Хаксли предположили, что активация и инактивация объясняется независимым перемещением трех или четырех заряженных частиц внутри мембраны. Например, можно предположить, что для открытия канала необходимо, чтобы деполяризация вызвала смещение спиралей S4 во всех четырех субъединицах, составляющих калиевый канал. Можно также предположить, что смещение по крайней мере трех подобных структур необходимо для активации натриевого канала. Далее, можно допустить, что как минимум одно подобное

смещение связано с инактивацией. Подобная параллельная модель была предложена Кейнесом

35· 36).

Предположение о том, что в процессе активации канала задействовано четыре отдельных события (таких, как смещение S4), дает возможность говорить о 16 различных состояниях канала: без смещения (одно состояние), одно из четырех возможных смещений (четыре состояния), два из четырех (шесть состояний), три из четырех (четыре состояния) и все четыре смещения (одно состояние). Если все переходы между состояниями независимы и кинетически идентичны, то количество возможных состояний сокращается до пяти: без смещения, смещение в одной области, смещение в двух, в трех и в четырех областях. Таким образом, переход из закрытого в открытое состояние будет выглядеть следующим образом:

где С4 — состояние канала в покое, С3 и т. д. — серия закрытых состояний при деполяризации,

а О — открытое состояние. Для натриевых каналов необходимо добавить состояние инактивации. Исследования как одиночных каналов, так и токов от целой клетки показали, что инактивация натриевых каналов не зависит от того, побывали ли каналы предварительно в открытом состоянии37, 38). Переход в состояние инактивации (I), таким образом, может произойти как из открытого, так и из закрытого состояния:

Разными авторами были предложены многочисленные модификации данной схемы, включающие большее или меньшее количество переходов, а также несколько инактивированных состояний 39· 40). Отличие этих схем от модели Ходжкина и Хаксли состоит в том, что процессы активации и инактивации проходят через несколько общих состояний, а не протекают параллельно и независимо, как показано выше. Кроме того, хотя переходы из одного состояния канала в другое и должны быть потенциалзависимы, это вовсе не

обязательно для окончательных переходов в активированное или инактивированное состояния

41· 42).

Сколько в действительности различных состояний канала? Достоверно это не известно, хотя есть основания полагать, что в процессе активации натриевого канала происходит как минимум три отдельных перемещения заряда. Конти и Штумер43) пришли к такому выводу на основе опытов по измерению воротных токов в больших участках мембраны в конфигурации cell-attached

Глава б. Ионные механизмы потенциала действия

119

(так называемые «макро-пэтчи»). Каналы были экспрессированы в ооцитах Xenopus путем инъекции РНК натриевых каналов, полученной из мозга крысы. Величину единицы заряда, переносимого воротным током, рассчитали на основе средних значений для большого количества индивидуальных воротных токов. Метод напоминает расчет величины тока одиночных каналов путем измерения шума (глава 2): соотношение среднего и вариации (разброса) пропорционально амплитуды одиночных событий. Подсчитанная величина элементарного заряда, переносимого воротным током, составила 2,3 заряда электрона (2,3е). Полный заряд, переносимый одним каналом, можно оценить на основе угла наклона кривой активации (см. рис. 6.7В): чем больше заряд исследуемой структуры, тем меньше величина изменения потенциала, требующаяся для изменения конформации этой структуры. На основе этого соображения было подсчитано, что при активации происходит перенос заряда величиной от 6е до 8e, т. е. в три раза превышающего элементарный заряд, переносимый воротным током. Примечательно соответствие данных результатов первоначальной модели активации, предложенной Ходжкиным и Хаксли. Конти и Штумер отметили, что наиболее привлекательной интерпретацией их результатов будет предположение о том, что перенос заряда связан с тремя из четырех субъединиц, в то время как инактивация связана с взаимодействием между ними и четвертой субъединицей. Разумеется, данные исследования не принимают во внимание возможные переходы в промежуточные состояния, поскольку последние никак не проявляются электрически.

Обобщим вышесказанное. Кинетические модели указывают на то, что в результате деполяризации запускается цепочка последовательных конформационных изменений,

ведущих, в конечном итоге, к открытию канала. Точное описание этих изменений не представляется возможным, однако в наиболее общем виде их можно себе представить (глава 3). Были сделаны первые шаги в определении того, с какими группами аминокислот в молекулах натриевого и калиевого каналов связана их инактивация. По мере того, как совершенствуется наше понимание молекулярной анатомии этих каналов, несомненно, будут установлены новые структурно-функциональные связи.

Свойства канала, связанные с потенциалом действия

В ходе экспериментов методом пэтч-кламп на крысиных мышечных волокнах в культуре, проводимость потенциалзависимых натриевых каналов была измерена непосредственно и составила 20 пСм (рис. 6.10); подобные измерения в мотонейронах крысы выявили проводимость величиной 14 пСм44). Плотность натриевых каналов была измерена в ряде тканей методом исследования плотности мест связывания ТТХ. Используя меченый тритием тетродотоксин, Левинсон и Мевес45) определили, что на один квадратный микрометр мембраны аксона кальмара приходится приблизительно 553 места связывания молекулы токсина. Цифры, полученные в других тканях, варьируют от 2 молекул на мкм2 в оптическом нерве новорожденных крысят46) до 2 000 в перехвате Ранвье седалищного нерва кролика 46). Плотность натриевых каналов в скелетной мышце была измерена методом локальной деполяризации небольшого участка мембраны с помощью внеклеточной пипетки при одновременном измерении натриевого тока, протекающего через этот участок мембраны. Результаты варьировали от одного участка к другому, что указывает на неравномерность распределения каналов в мембране. Плотность была наибольшей в районе концевой пластинки, снижалась по мере удаления от нее и достигала 10 % от максимального уровня по мере приближения к сухожилию 48). Кроме того, было показано, что натриевые каналы в мышце группируются в кластеры 49).

Проводимость калиевых каналов, ответственных за позднюю составляющую тока, была измерена в препарате вскрытого аксона кальмара 50). Каналы типа «выпрямитель с задержкой» обладают проводимостью 10, 20 и 40 пСм, причем наиболее часто встречается канал с проводимостью 20 пСм. Подобно натриевым, калиевые каналы мышцы лягушки распределены не равномерно, а кластерами 36). Тем не менее, паттерны расположения кластеров натриевых и калиевых каналов не совпадают между собой. Выпрямители с задержкой полностью отсутствуют в перехватах Ранвье миелинизированного нерва кролика, так как в ответ на деполяризацию поздний выходящий ток не возникает 51). В ходе потенциала действия реполяризация после быстрой инактивации натриевых каналов достигается за счет большого тока утечки.

120

Раздел II. Передача информации в нервной системе

Вклад открытых калиевых каналов в реполяризацию

Кроме выпрямителя с задержкой, в нейронах имеется целый ряд других типов калиевых каналов 52), некоторые из которых принимают участие в реполяризации мембраны. Один из таких каналов — это Α-канал, быстро активируемый в результате деполяризации. Вклад Α- каналов в реполяризацию в ходе потенциала действия минимален по двум причинам: они быстро инактивируются, и в большинстве клеток активация этого типа каналов возможна лишь при условии предварительной гиперполяризации (т. е. они инактивированы в состоянии покоя). Два других типа потенциалзависимых калиевых каналов, М-канал (глава 16) и S- канал, похожи на выпрямитель с задержкой тем, что открываются в ответ на деполяризацию. Дополнительное свойство М-каналов состоит в том, что они инактивируются ацетилхолином через мускариновые АХ рецепторы (отсюда название). S-каналы открыты в покое и инактивируются серотонином.

Кальций-активируемые калиевые каналы также могут вносить вклад в реполяризацию 53). В ходе потенциала действия кальций входит в клетку через потенциалзависимые кальциевые каналы (см. следующий раздел). Во многих типах клеток такое повышение уровня кальция способствует увеличению калиевой проводимости, которая способствует реполяризации и приводит к последующей гиперполяризации. Существует как минимум три подтипа кальцийактивируемых калиевых каналов, с очень большим (200 пСм), средним (30 пСм) и малым (10 пСм) уровнями проводимости. Наличие этих каналов можно продемонстрировать экспериментально посредством повышения уровня кальция внутри клетки, например, путем инъекции через внутриклеточную микропипетку 54). Вслед за такой инъекцией проводимость мембраны резко возрастает и мембранный потенциал покоя приближается к калиевому равновесному потенциалу. По мере устранения излишков кальция из цитоплазмы за счет внутриклеточных буферов и выброса кальция из клетки, сопротивление и потенциал возвращаются к своему нормальному уровню. Существует также тип калиевых каналов, активируемый внутриклеточным натрием 55, 56). В некоторых клетках активация таких каналов может вносить вклад в реполяризацию в ходе потенциала действия 57).

§ 4. Роль кальция в возбуждении клетки

Кальциевые потенциалы действия

Вмембране нервов и мышечных волокон содержится большое количество потенциалзависимых кальциевых каналов (см. главу 3, классификация и свойства кальциевых каналов). Кальций, входящий в клетку через эти каналы во время потенциала действия, оказывает влияние на самые разные процессы (главы 9-12). К примеру, кратковременное увеличение уровня кальция в ходе потенциала действия вызывает секрецию как секрецию химических медиаторов в нервном окончании, так и сокращение мышечного волокна.

Внекоторых мышечных волокнах и нейронах кальциевые токи достигают такой величины, что либо вносят значительный вклад, либо полностью формируют фазу роста потенциала

действия. Процесс этот носит регенеративный характер благодаря возрастанию gСа при деполяризации, точно такому, как у натриевых каналов (см. выше). Участие кальциевых каналов в потенциале действия было впервые изучено Фаттом и Гинзборгом 58), а впоследствии Хагиварой 59). Кальциевые потенциалы действия описаны в сердечной мышце, в

целом ряде нейронов беспозвоночных, а также в нейронах вегетативной и центральной нервной системы позвоночных 60). Наличие кальциевых потенциалов действия также показано в не-нейрональных типах клеток, таких как ряд эндокринных клеток и некоторых яйцеклетках беспозвоночных. Потенциалзависимые кальциевые токи блокируются в миллимолярных концентрациях кобальтом, магнием или кадмием, добавленным во внеклеточный раствор. Барий может заменить кальций в прохождении через пору канала; магний на это не способен. Поразительным примером со-существования натриевых и кальциевых потенциалов действия в одном типе клеток является клетка Пуркинье в мозжечке млекопитающих. Натриевые

потенциалы действия генерируются в теле клетки Пуркинье, в то время как кальциевые — в дендритах 61· 62).

Ионы кальция и возбудимость

Ионы кальция влияют также на возбудимость мембраны: снижение внеклеточной концентрации кальция приводит к увеличению возбудимости; повышение внеклеточного уровня кальция, напротив, влечет за собой снижение

Глава 6. Ионные механизмы потенциала действия

121

Рис. 6.13. Влияние поверхностного заряда на мембранный потенциал. (А) Нейтрализация двухвалентными катионами отрицательных зарядов в структуре мембраны. (В) Устранение экранирующих элементов (например, кальция) изменяет распределение заряда и градиент потенциалов на мембране, но не потенциал покоя.

Fig. 6.13. Effect of Surface Charge on Membrane Potential proposed to explain the effects of calcium on action potential threshold. (A) The membrane structure includes negatively charged elements on the outer surface whose charge is neutralized by divalent cations. The resting membrane potential VR, produced by ionic charge separation, is determined by the composition of the intracellular and extracellular fluids. (B) When the fixed negative surface charges are unscreened (e. g., by removing calcium from the extracellular solution) the resting potential is unchanged, but the shape of the potential profile is altered by the surface negativity, reducing the potential gradient across the membrane.

возбудимости. Франкенхаузер и Ходжкин 63) использовали метод фиксации потенциала для исследования этих эффектов в аксоне кальмара. Они обнаружили, что при снижении внеклеточной концентрации кальция происходит сдвиг потенциалзависимости активации натриевых каналов таким образом, что для достижения порога и генерации натриевого тока нормальной величины требовались меньшие уровни деполяризации. Снижение уровня необходимой деполяризации было постоянным во всем диапазоне возбудимости и зависело от концентрации кальция. Пятикратное повышение внеклеточного уровня кальция приводило к снижению порогового уровня деполяризации на 10-15 м В.

Франкенхаузер и Ходжкин предположили, что этот эффект может быть обусловлен тем, что ионы кальция частично заслоняют (или экранируют) отрицательные заряды, расположенные на внешней поверхности мембраны. Подобное воздействие на мембрану может оказать, к примеру, гликолизация мембранных белхов последовательностями углеводов, содержащими отрицательно заряженную сиаловую кислоту. Натриевый канал ската сам по себе обладает более чем 100 остатками сиаловой кислоты 64). При условии заслонения зарядов градиент потенциала на мембране будет равен измеряемому потенциалу покоя (рис. 6.13 А). После устранения кальция, заряды, лишенные экранирования, увеличат отрицательный заряд на внешней стороне мембраны, тем самым снижая общий электрический градиент (рис. 6.13В). Эта гипотеза вносит новый ракурс в понимание мембранного потенциала: разность потенциалов между внутри- и внеклеточным растворами определяется вне- и внутриклеточной концентрациями ионов, а также проводимостями, как показано в главе 5. Однако, форма градиента потенциала может зависеть от заряженных молекул, связанных с поверхностью мембраны. Для потенциалчувствительных элементов мембраны этот эффект будет иметь огромное значение, поскольку они распознают лишь те градиенты потенциала, которые находятся в непосредственной близости от них.

Одна из проблем с гипотезой поверхностного заряда состоит в том, что удаление внеклеточного кальция должно повлиять не только на активацию, но и на инактивацию натриевых каналов, а также на активацию калиевых. Снижение порога натриевой инактивации и калиевой активации приведет тогда к снижению возбудимости. В силу неизвестных при-

122

Раздел II. Передача информации в нервной системе

чин, влияние устранения кальция на эти параметры гораздо менее выражено, чем влияние на активацию натриевых каналов 64· 65). Возможно, это и не удивительно, что локальные изменения электрического градиента оказывают столь разное влияние на различные молекулы канала, или даже на разные участки одной и той же молекулы, в зависимости от расположения потенциалчувствительного элемента относительно поверхностных зарядов. Какими бы ни были причины этих различий, общий эффект кальция заключается в стабилизации мембраны и внесении дополнительной степени надежности при варьировании уровня потенциала мембраны между покоем и порогом для потенциала действия.

Выводы

·Потенциал действия в большинстве клеток возникает за счет кратковременного возрастания натриевой проводимости, которое стремится привести мембранный потенциал к уровню натриевого равновесного потенциала и за которым следует увеличение калиевой проводимости, возвращающее мембрану в состояние покоя.

·Возрастание проводимостей возникает благодаря потенциалзависимости натриевых и калиевых каналов: вероятность их открытия возрастает при деполяризации.

·Эксперименты на аксоне кальмара с фиксацией потенциала предоставили детальную информацию о потенциалзависимости и временном ходе изменений проводимостей. При деполяризации мембраны натриевая проводимость сначала быстро активируется, а затем инактивируется. Калиевая проводимость активируется с задержкой и остается на высоком уровне до тех пор, пока не кончится деполяризация.

·Временной ход и потенциалзависимость изменений натриевых и калиевых проводимостей в точности определяют амплитуду и временной ход потенциала действия, а также такие характеристики мембраны, как порог активации и рефрактерный период.

·Теоретически активация натриевой и калиевой проводимостей при деполяризации должна быть связана со смещением заряда внутри клетки. Эти смещения, называемые воротными токами, удалось измерить экспериментально.

·Эксперименты с использованием метода пэтч-кламп дополнили сведения, полученные в более ранних опытах с фиксацией потенциала, новыми деталями о процессе возбуждения. Так, например, натриевые каналы открываются на довольно короткое время, и вероятность их открытия в ходе деполяризации сначала возрастает, а затем снижается, в соответствии с активацией и инактивацией натриевой проводимости в целой клетке. Различные кинетические модели были предложены с целью описания процессов активации и инактивации каналов.

·Кальций играет важную роль в возбуждении. В некоторых клетках именно вход кальция, а не натрия, отвечает за фазу роста потенциала действия. Кроме того, внеклеточный уровень кальция определяет возбудимость мембраны. Снижение внеклеточной концентрации кальция приводит к увеличению возбудимости.

Рекомендуемая литература

оArmstrong, С. М., and Hille, В. 1998. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron 20: 371380.

оFrankenhaeuser, В., and Hodgkin, A. L. 1957. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. J. Physiol. 137: 218-244.

оHille, B. 1992. Ionic Channels of Excitable Membranes, 2nd Ed. Sinauer Associates, Sunderland, MA, Chapters 2-5.

оHodgkin, A.L., Huxley, A.F., and Katz, B. 1952. Measurement of current-voltage relations in the

membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. 116:424-448.

оHodgkin, A.L., and Huxley, A.F. 1952. Currents carried by sodium and potassium ion through the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. 116:449-472.

оHodgkin, A. L., and Huxley, A. F. 1952. The components of the membrane conductance in the giant axon of Loligo. J. Physiol. 116: 473-496.

оHodgkin, A. L., and Huxley, A. F. 1952. The dual effect of membrane potential on sodium conduc-

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]