37_DFU_2.1 / DFU_Dopolnenie_2cr

Лінійність. Валідація лінійності містить у собі кореля­ цію результатів кількісного визначення в Б ІЧ-області спектра, розрахованих з відкликів у БІЧ-області з ура­ хуванням використовуваних алгоритмів, з результа­ тами методики порівняння, розподіленими в межах всього заданого діапазону калібрувальної моделі. На­ явні нелінійні БІЧ-відклики також мають бути валідо­ ваними.

Діапазон застосування. Діапазон стандартних значень аналізованого зразка визначає діапазон БІЧ -методи­ ки і межі кількісного визначення методики. У процесі роботи необхідно контролювати, щоб результати виз­ начення не виходили за межі валідованого діапазону.

Правильність. Правильність може бути визначена шля­ хом порівняння результатів аналізу з результатами ана­ лізу валідованої методики або з результатами аналізу відомих зразків (холості зразки, та зразкі , у які додана певна кількість випробовуваної речов и н и ) . Пра­ вильність може бути виражена як стандартна помил­ ка прогнозування (SEP) БІЧ методики, яка повинна погоджуватись з даними валідованної методики. Стан­ дapTHa помилка прогнозування являє собою стандар­ тне відхилення різниць, отриманих для визначених зразків при порівнянні результатів БІЧ - методики з аналітичними даними методики порівняння. Це де­ монструється кореляцією результатів Б І Ч-методики з аналітичними даними методики порівняння шляхом порівняння стандартної помилки прогнозування з даними стандартної методики, використовуваної для валідації. Для порівняння результатів БІЧ -методики зі стандартними значеннями можуть бути використані альтернативні статистичні порівняльні методи (двос­ торонній І-тест, оцінка систематичної похибки) .

ПрецизіЙність. Дана характеристика виражає ступінь близькості результатівдля серії вимірювань у зазначе­ них умовах. Вона оцінюється за результатами я к мінімум 6 випробувань, виконаних відповідно до роз­ робленої аналітичної методики. Прецизійність може бути розглянута на 2 рівнях: збіжність (повторні вимі­ рювання того самого зразка із змінами у положенні зразка або без них) і внутрішньолабораторна пре­ цизійність (повторні вимірювання різними аналітика­ ми, різні дні вимірювань).

Робасність. Дана характеристика відображає вплив змін температури , вологості, обробки зразка і впливу інструментальних змін.

Викиди. Результати БІЧ -вимірювань зразка, що вихо­ дять за межі діапазону калібрування, вказують на не­ обхідність подальшого тестування. Я кщо подальше випробування зразка із застосуванням підхожої аналі­ тичної методики дає значення кількісного вмісту в межах специфікованих значень, отримана інформація приймається і розглядається як відповідна специфі­ кації. Я кщо при подальшому випробуван ні зразка із застосуванням підхожої аналітичної методики резуль­ тат кількісного вмісту вкладається у встановлені в спеціфікації межі, то отриманий результат приймаєть­ ся і розглядається як такий , що відповідає специфі-

кацїі. Таким чином випадковий результат, одержаний при випробуванні зразка із застосуванням Б І Ч мето­ дики, може, проте, відповідати вимогам специфікації для випробовуваного зразка.

ОЦІ Н КА Д І ЮЧОї МОДЕЛ І

Валідовані Б І Ч - моделі п ідлягають функціональній оцінці і спостереженню за валідаційними параметра­ ми в процесі роботи. При виявленні відхилень необхід­ но застосовувати коригувальні дії. Рівень потрібної ре­ валідацїі залежить від характеру змін . Ревалідація моделі якісного аналізу необхідна при поповненні до­ відкової бібліотеки новим и матеріалами і може бути необхідна при зміні фізичних властивостей і поста­ чальника матеріалу. Ревалідація кількісної моделі по­ трібна при змінах складу готового продукту, виробни­ чого процесу та постачальникі в/кваліфікацїі сировини.

П ЕР ЕНОС БАЗИ ДАНИХ

Якщо базу даних переносять на інший прилад, беруть до уваги спектральний діапазон, кількість експериментальних точок, спектральне розрізнення й інші пара­ метри. Для демонстрації того, що модель є валідова­ ною для нової бази даних або нового приладу, мають бути проведені наступні валідаційні процедури і пере­ вірка відповідності прийнятим критеріям.

ЗБЕРІГАННЯ І НФОРМАЦ І Й Н ИХ ДАНИХ

Зберігають електронні версії БІЧ -спектрів, бібліоте­ ки й інформаційні дані відповідно до діючих правил.

Зберігають БІЧ-спектри з попередньою обробкоюда­ них для конкретного використання (наприклад, іден­ тифікації, аналізурозміру частинок, вмісту води та ін.) відповідно до діючих специфікацій.

2.2.42. ГУСТИНАТВЕРДИХ РЕЧОВИН

Густина твердих речовин відповідає їхнім середнім масам на одиницю об'єму і звичайно виражається в грамах на сантиметр кубічний (г/см\ хоча Міжнарод­ на Одиниця - кілограм на метр кубічний ( 1 г/смЗ =

1 000 кг/мЗ) .

На відміну від газів і рідин, гу тина яких залежитьлише від температури і тиску, густина части нок твердої ре­ човини також залежить від ії молекулярної структури і , отже. залежить від ії кристалічної структури та сту­ пеня кристалічності.

Я кщо частинки твердої речовини аморфні або част­ ково аморфні, іх густина може також залежати від іх одержання та обробки.

Тому на відміну від флюїдів ( плинних середовищ) гус­ тини двох хімічно еквівалентних твердих речовин мо­ жуть бути різними, і ця різниця пов'язана з відміннос­ тями в структурах речовин в твердому стані. Густина складових частинок є важливою фізичною характерис­ тикою порошків для фармацевтичного застосування.

Густина частинок твердої речовини може бути вира­ жена ріЗI;ІИМИ величи!-'ами в залежності від методу, що використовується при вимірюванні об'єму частинок. Для зручності розрізняють три рівні вираження густи­ ни:

-кристалічна густина, яка характеризує лище тверду

фракцію речовини; кристалічну густину також на­ зивають дійсною густиною;

-густина частинок, при визначенні якої також вра­ ховують і об'єм пор усередині частинок;

-насипна густина, при визначенні якоїдодатково вра­ ховують об'єм порожнин між частинками, сформо­

ваних шаром порошку; насипну густину також на­

зивають уявною густиною.

ними для газу. При виборі газу перевага надається гелію, або через його високий коефіцієнт дифузії більшість відкритих пор доступна для даного газу. Таким чином, величина пікнометричної густини тонко здрібненого порошку, як правило, істотно не відрізняється від величини кристалічної густини.

В. Ртутно-nорозиметричну густину також називають

гранулярною густиною. Об'єм, що визначається да­

ним методом також виключає об'єм , зайнятий зак­ ритими порами; до того ж він включає об'єм тільки тих відкритих пор, розмір яких більщий за деяку межу. Дана межа розміру пор або мінімальний діа­ метр доступу залежить від максимального ртутного

інтрузійного тиску, застосовуваного під час визна­ чення; при цьому при нормальному робочому тис­ ку ртуть не проходить крізь найдрібніші пори , дос­

тупні гелію. Для одного зразка можуть бути одержані

різні значення гранулярної густини, бо для кожно­

го застосовуваного ртутного інтрузийного тиску гус­ тина може бути визначена при відповідній межі роз­ міру пор за даного тиску.

КРИСТАЛ І Ч НА ГУСТИ НА

Кристалічна густина речовини є відношенням серед­ ньої маси до одиниці об'єму, за винятком усіх порож­ нин, що не зумовлені особливостями молекулярної структури.

Кристалічна густина є характерною властивістю речо­

вини і, відповідно, не має залежати від методу визна­

чення. Кристалічна густина може бути визначена роз­ рахунковим методом або методом прямо го визначення.

А. Розраховану кристалічну густину одержують із ви­ користанням кристалографічних даних (розмір і структура елементарної комірки) ідеального крис­ талу,наприклад, за даними рентгенівської дифрак­ ції,та молекулярної маси речовини.

В. Вимірювана кристалічна густина є відношенням маси до об'єму монокристалу.

ГУСТИ НА ЧАСТИ Н О К

Густина частинок обумовлена я к кристалічною густи ­ ною, так і пористістю частинок (закриті і/або відкриті пори). Таким чином, густина частинок залежить від ве­ личини об'єму, що визначається, який у свою чергу за­ лежить від методу визначення. Густина частинок може бути визначена з використанням одного з двох наве­

дених нижче методів.

А. Пікнометричну густину визначають вимірюванням об'єму, зайнятого відомою масою порошку, що екві­

валентний об'єму газу, витисненого порошком із ви­

користанням газ пікнометра (2. 9. 23). При вимірі пікнометричної густини, визначуваний об'єм вклю­ чає об'єм відкритих пор; однак він виключає об'єм ,

зайнятий закритими порами або порами , недоступ-

НАСИ П НА ГУСТ И НА ТА ГУСТ И НА П І СЛЯ УСАДК И

Насипна густина порошку включає об'єм порожнин між частинками. Тому насипна густина залежить як від густини частинок порошку, так і від просторовоїструк­ тури частинок у шарі порошку.

Насипну густину порошку часто дуже складно вимі­

ряти, бо незначне порушення його шару може призве­ сти до одержання іншого значення густини. Таким чи­ ном , важливо при поданні даних зазначати, яким чином було проведено визначення.

А. Насипну густину визначають вимірюванням об'єму відомої маси порошку, пропушеного крізь сито у градуйований циліндр (2. 9. 15).

В. Густина після усадки досягається механічним стру­ шуванням мірного циліндра, що містить зразок по­ рош ку. Фіксують вихідний об'єм , а потім здійсню­ ють механічне струшування циліндра і відзначають показання об'єму, поки різниця між попереднім і на­

ступ ним виміряними об'ємами буде незначущою

(2. 9. 15).

2.2.43. МАС -СПЕКТРОМЕТРІЯ

М ас спе ктрометрія заснована на прямому вимірі відношення маси до кількості позитивних або негатив­ них елементарних зарядів іонів (m/z) у газовій фазі, що

одержана з аналізованої речовини. Це відношення ви­ ражається в атомних одиницях маси (\ а.О. М . = одній дванадцятій маси 12с) або в дальтонах (І Да = маса ато­ ма водню).

Іони, які генеруються уджерелііонів приладу, приско­ рюються і потім розділяються аналізатором перш, ніж

вони досягнуть детектора. Усі ці процеси відбуваються

в камері, у3 якій системою6 насосів підтри мується ваку­ ум від 10' до І0' Па.

Результуючий спектр показує відносний вміст різних іонів, представлених у вигляді функції відm/Z. Сигнал, що відповідає іону, представляється у виді декількох піків, відповідних статистичному розподілу різних ізо­

топів даного іона. Ця зображення називається ізотоп­ ним профілем, а пік, що являє ізотопи, які є найбільщ

переважаючими для кожного атома, називається мо­ ноізотопним піком.

І нформація, одержана за допомогою мас-спектро­ метрії, є переважно якісна (визначення молекулярної маси, інформація про структуру із фрагментів, що спо­ стері гаються ) або кількісною (при в и користанні внутрішніх або зовнішніх стандартів) в межах детек­ туючого діапазону від пікомолю до фемтомолю.

ПОДАЧА З РАЗКА

Найпершим етапом аналізу є введення зразка у при­ лад, уникаючи надмірного впливу на вакуум. У загаль­ ному методі , названому прямерідинне введення, зразок, поміщають на кінці циліндричного стрижня (у квар­ цовому тиглі, на катоді, або на металевій поверхні). Стрижень вводиться у спектрометр після пропускан­ ня через вакуум ний шлюз, у якому підтримується пер­ винний вакуум , проміжний між атмосферним тиском і вторинним вакуумом приладу.

Інші системи введеня дозволяють аналізувати компо­ ненти суміші в порядку їх розділення на підхожому приладі, з'єднаному з мас спектрометром.

Газова хроматографія/мас спектрометрія. Використо­ вують підхожі колонки (капілярні або напівкапілярні), що дозволяють кінець стовпчика вводити безпосеред­ ньо в джерело приладу без використання сепаратора.

Рідинна хроматографія/мас спектрометрія. Дана комбі­ нація особливо корисна для аналізу полярних сполук, які недостатньо леткі або занадто термолабільні, щоб аналізуватися з використанням газової хроматографії в комбинации з мас спектрометрією. Застосування да­ ного методу утруднено складністю одержання іонів у газовій фазі з рідкої фази, що потребує дуже специф­ ічних інтерфейсов, таких як:

-пряме рідинне введення: рухома фаза розпилюється, а розчинник випаровується перед іонним джерелом приладу;

-інтерфейс потоку частинок: рухома фаза, що може мати швидкість потоку до 0.6 мл/хв, розпилюється в десольватаційній камері таким ч ином, що тільки компоненти проби в нейтральній формі досягають іонного джерела приладу; цей метод використову­

ютьдля сполук з відносно низькою полярністю З мо­ лекулярною масою менше ІОООДа;

-інтнрфейсзрухомоюстрічкою: рухома фаза, що може мати щвидкість потоку 1 мл/хв, нанесена на поверх-

ню смуги, що рухається; після того як розчинник випаровують, аналізовані компоненти послідовно переміщаються до іонного джерела приладу, де вони іонізуються; цей метод не зовсім підходитьдля дуже полярних або термолабільних сполук.

І нщі типи сполучень (електророзпилення, термороз­ пилення, хімічна іонізація за атмосферного тиску) роз­ глядаються я к власне методи іонізації, що описують­ ся в розділі способів іонізації.

Суперкритична хроматографія/мас спектрометрія. Рухо­ ма фаза, що звичайно включає вуглецю діоксид у су­ перкритичному стані, переходить у газоподібний стан після пропускання розігрітого капіляру між колонкою і джерелом іонів.

Капілярний електрофорез/мас спектрометрія. Елюент вводиться в джерело іонів у деяких випадках після до­ давання іншого розчинника, таким чином, що щвид­ кість потоку може дося гти приблизно декількох мікролітрів за хвилину. Цей метод обмежений необхід- н істю використання маленьких кількостей зразка, що вводиться, та летких буферних розчинів.

СПОСОБИ ІОНІЗАЦІЇ

Електронний удар. Зразок у газоподібному стані іоні­ зується пучком електронів енергія яких (звичайно 70 еВольт) більшаза енергію іонізації зразка. На дода­ ток до молекулярних іонів м+реєструються фрагмен­ ти, що характеризують молекулярну структуру. Цей ме­ тод обмеже н и й гол о в н и м ч и н о м н еобхідністю випаровування зразка. Це робить його непідхожим для полярних, термолабіл ьних чи високомолекулярних сполук. Застосування електронного удару робить мож­ лиBиM поєднання газової хроматографії з мас спект­ рометрією й іноді допускає можливість використання рідинної хроматографії.

Хімічна іонізація. У даному способі іонізації викорис­ товуються гази-реагенти, такі як метан, аміак, оксид азоту, діоксид азоту або кисень. Спектр характери­ зyєтьcя іонами виду ( М + Н)+ або ( М - Н)', або іонами ­ аддуктами, утвореними з компонентів проби і вико­ ристовуваного газу. При цьому утворюється менше фрагментів, ніж у результаті електронного удару. Ва­ ріант цього методу використовується, коли субстан­ ція термолабільна: зразок, нанесений на катод дуже щвидко випаровують відповідно до ефекту Джоуля­ Томпсона (десорбційна хімічна іонізація).

Бомбардування швидкими атомами або іонізація бомбар­ дуванням швидкими іонами (рідинна вторинно-іонна мас спектрометрія LSIMS). Зразок, розчинений у в'язкій матриці, такій як гліцерин , наноситься на металеву поверхню, після чого він іонізується пучком нейтраль­ них атомів, таких як аргон або ксенон , або іонів цезію з високою кінетичною енергією. З матриці або зразка утворюються іони (М+Н)+ або (М-Н)'. Даний тип іон­ ізаціїдобре підходить для полярних та термолабільних

Польова десорбція і польова іонізація. Зразок випаро­ вується білн вольфрамової нитки, вкритої мікрогол­ ками (польова іонізація) або, нанеситься на цю нитку (польова десорбція). Напруга близько 1 0 кВольт, при­ кладена між цією ниткою і протиелектродом , іонізує зразок.

Ці два методи в основномудозволяють одержувати мо­ лекулярні іони М+ та (М + Н)+ іони і використовують­ ся для малополярних та/або термолабільних сполук.

Матрично-прискорена лазерна десорбційна іонізація

(МALDI). Зразок у підхожій матриці, нанесений на металеву підложку, іонізується задопомогою імпульс­ ного лазерного променя з довжиною хвилі в діапазоні від УФ дО ІЧ (імпульси, що тривають від пікосекунди до декількох наносекунд). Цей спосіб іонізації відіграє істотну роль в аналізі високомолекулярних сполук (більш 1ОООООДа), але обмежується можливостями ча­ сопролітного аналізатора (див. нижче) .

Електророзпилення. Цей спосіб іонізації застосовують за атмосферного тиску. Зразки у розчині вводять удже­ рело через капілярну трубку, кінець якої має потенці­ ал близько 5 кВольт. Газ може бути використаний для

того, щоб сприяти розпиленню. Десольватація утво­ рених мікрокрапель призводить до утворення одно­ або богатозарядних іонів в газовій фазі. Швидкість по­ току варіюється від декількох мікролітрів за хвилину до 1 мл/хв. Цей метод придатний для полярних спо­ лук і дослідження біомолекул з молекулярною масою до 1 00 ООО Да. Він може бути поєднаний з рідинною хроматографією або капілнрним електрофорезом.

Хімічна іонізація атмосферного тиску (АРСІ). Іонізацію

проводять при атмосферному тиску під дією електро­ да, на якому підтримується потенціал у декілька кіло­ вольт, поміщеного у напрямку переміщення мобіль­ ної фази, що розпилюється як під дією термічного впливу, так і в спрямованому струмені азоту. Утво­ рені іони мають одиничні заряди, позитивні заряди типу (М+Н)+ і негативні заряди типу ( М - Н)-. Висока швидкість потоку яка може бути використана в цьому способі іонізації (до 2 мл/хв), робить цей метод іде­ альним длн поєднання з рідинною хроматографією.

Терморозпилення. Зразок у мобільній фазі, що скла­ дається з води, органічних модифікаторів та містить леткий електроліт (як правило, ацетат амонію), вво­ диться в роспиленій формі після проходження через металеву капілярну трубку за контрольованої темпе­ ратури. Прийнятна швидкість потоку при цьому - при-

АНАЛ ІЗАТОРИ

Розходження в експлуатаційних якостях аналізаторів залежать переважно від двох параметрів:

-діапазону, в межах я кого можуть бути виміряні відношення m/z; тобто діапазон масових чисел;

-розрізнювальної здатності, що характеризується здатністю розрізняти два іони однакової інтенсив­ ності з m/z відношеннями, що відрізняються на f...M,

і перекривання яких виражаєтьсн величиною « впа­ дини» у відсотках. Наприклад, розрізнювальна здатність ( M/f...M)1 000 з 10 % величиною «впади­ ни» допускає розрізнення відношень m/z, що дорі­ BHює 1 000 і 1 00 1 з інтенсивністю до 10 % над базо­ вою лінією. П роте , роздільна здатність може в деяких випадках (часопролітні аналізатори, квадру­ польні аналізатори, іоннозахватні аналізатори) виз­ начатися як відношення між молекулярною масою і шириною піка на половині висоти (50 % величина «впадини» ) .

Магнітні й електростатичні аналізатори. Іони, що ут­ ворюються в джерелі іонів, прискорюються під напру­ гою Vi фокусуються по напрямку магнітного аналіза­ тора ( магнітне поле В ) або електростатич ного аналізатора (електростатичне поле Е), залежно від кон­ струкції приладу. Іони прямують траєкторією радіусом r відповідно до закону Лапласа:

mв2,.2

z2V

Для збору даних і реєстрації різних іонів, генерованих джерелом іонів, може бути використано два типи ска­ нування: сканування В, щО підтримує Vпостійним, або сканування V з константою В. Магнітний аналізатор звичайно супроводжується електричним сектором, що діє як кінетичний енергетичний фільтр і дозволяє істотно збільшити розрізнювальну здатність приладу. Максимальна розрізнювальна здатність такого прила­ ду (подвійний сектор) коливається від 1 0 ОООдо 1 50 ООО

і в більшості випадків дає можливість досить точно розрахувати значення m/z відношень, щоб визначити елементний склад відповідних іонів. Для однозаряд­ них іонів, маса знаходиться в діапазоні від 2000 Да до 1 5 ООО Да. Деякі іони можуть розпадатися спонтанно (метастабільні переходи) або при зіткненні з молеку­ лами газу (ударно-активована дисоціація (САО» у без­ польовій області між джерелом іонів і детектором. Дос­ л ідже ння цих розпадів є дуже кор исним для визначення структури й ідентифікації індивідуальної

сполуки в суміші і використовується в тандемній мас спектрометрії. Існує багато таких методів залежно від області , у якій відбуваються ці розпади:

-метод дочірніх іонів (визначення розпаду іонів да­ ного вихідного іону): ВІЕ= константа, M/KES(Mac­

аналізуюча іонно-кінетична енергетична спектроско­ пія),

.- метод вихідних іонів (визначення всіх іонів, що у ре­

зультаті розпаду дають іон з специфічним mlzвідно­ шенням): EfIE = константа,

-методнейтральноївтрати (реєстрація всіх іонів, що

втрачають ідентичні фрагменти) :

ВІЕ ( 1 -IIЕ)1/2 = константа, де J! - базова напруга

електричного сектора.

Квадрупольні аналізатори. Аналізатор складається з чотирьох паралельних металевих стрижнів, які є цил­ індричними або гіперболічними в поперечному пе­ рерізі. Вони розташовані симетрично паралельно траєкторії руху іонів; пари стрижнів, розташовані по діагоналі один проти одного навколо осі си метрії, з'єднані електрично. Потенціали двох пар стрижнів протилежні. Вони є результуючими постійної компо­ ненти та перемінної компоненти. Іони, утворені вдже­ релі іонів, проходять і розділяються під діє змінної напруги, прикладеною до стрижнів, таким чином, що відношення напруги до протилежної напруги зали­ шається постійним. Квадрупольні аналізатори звичай­ но мають діапазон масових чисел від 1 а . М . О до 2000 а . М . О . , але деякі можуть мати діапазон до 4000 а.М.О. Хоча вони мають більш низьку розрізню­ вальну здатність, ніж аналізатори з магнітним секто­ ром , вони тим не менш дають можливість одержувати моноізотопний профіль однозарядних іонів для по­ вного діапазону масових чисел. Можливе одержання спектра з використанням трьох квадруполів, розта­ шованих у послідовності QI' Q2' Qз(Q2СЛУГУЄ як сектор для зіткнень, а не є власне аналізатором; у більшості випадків як газ-для зіткнеь використовують аргон).

Найбільш поширені типи сканування такі:

-методдочірніх іонів: QI вибирає mlz іони , фрагмен­ ти яких, одержані в результаті зіткнеь у Q2,аналізу­ ються Qз;

-методвихідних іонів: Qзфільтрує тільки певні відно­ шення mlz , у той час як QI сканує заданий діапазон

масових чисел. Реєструються тільки іони , що роз­

кладаючись, утворюють іон, яки й відфільтровуєть­ ся Qз

- метод нейтральної втрати: QI і Qзсканують визна­ чений діапазон масових чисел, але при зміщенні, що відповідае втраті характеристичного фрагменту ана­ лізованої сполуки або групи сполук.

Можливе одержання спектрів шляхом комбінування квадрупільних аналізаторів з магнітними або електро­ статичним секторними приладами;

Такі прилади називаються гібридними мас-спектро­ метрами.

Іонозахватний аналізатор. Принцип роботи такий са­ мий як і в квадрупільних аналізаторів, але в цьому ви­ пaдKy електричним и полями в трьох напрямках. Да­ ний тип аналізатора дозволяє одержувати спектри отриманих іонів декількох поколінь (MS\

Аналізатори іон-циклотронного резонансу. Іони, утво­

рені в камері та на які діє однорідне інтенсивне магн­ iTHe поле, рухаються по коловим орбітам з частотами , що можуть бути безпосередньо співвіднесені з їхніми mlz відношеннями при використанн і алгоритму Фур'є-перетворення. Цей явише називається іон-цик­ лотронн и м резонансом . Аналізатори такого типу містять надпровідний магніт і мають дуже високу роз­ різнювальну здатність (до 1 000 ООО і більше), а також дозволяють одержувати MS'спектри. Однак для цього потрібні дуже низькі тиски (порядку 1 0-7 па).

Часопролітні аналізатори. Іони, утворені в джерелі іонів прискорюються п р и напрузі V від 1 0 кВольт до 20 к Вольт. Вони проходять через аналізатор , що

містить безпольову трубку завдовжки від 25 см до 1 .5 м, яку звичайно називають пролітною трубкою. Час (t),

за який іон перемішується до детектора, пропорцій­ ний квадратному кореню з mlz відношення. Теоретич­ но діапазон масових чисел такого аналізатора безмеж­ ний. На практиці він обмежений методом іонізації або десорбції. Часопролітні аналізатори переважно вико­ ристовуються для високомолекулярних сполук (до де­ кількох сотень тисяч дальтонів). Цей метод дуже чут­

зразку). Точність вимірів та розрізнювальна здатність таких приладів , може бути значно підвищена при ви­ користанні електростатичного відбивача (рефлекто­ ра).

ЗАП И С С И ГНАЛУ

Власне кажучи існує три можливих методи.

Повний спектральний метод. Реєструється повний сиг­ нал, одержаний в межах обраного діапазону масових чисел . Спектр являє собою відносну інтенсивність різних типів присутніх іонів як функцію від mlz . Ре­ зультати переважно якісні. Для більш швидкої іденти­ фікацїі можливе використання бібліотеки еталонних спектрів.

Фрагментометричний метод (контроль обраних іонів).

Отриманий сигнал обмежується одним (режим peєстрації індивідуальних іонів (SIM» , або декількома (режим реєстрації богатьох іонів (М І М» характерис­ тичними іонами аналізованої субстанції. Межа вияв­ лення може бути значно знижена у цьому методі. Кількісні або напівкількісні випробування можуть бути проведені з в и користанням зов н і ш н іх або внутрішніх стандартів (наприклад, дейтеровані стан­ дарти) . Такі випробування не можуть бути проведені з використанням часопролітних аналізаторів.

Фрагментометричний подвійний мас-спектрометричний метод (багаторазовий реакційний контроль (MRM»

Мономолекулярний або бімолекулярний розклад об­ раного вихідного іона, характеристичного для аналі­ зованої субстанції, відслідковується більш точно. Ви­ бірковість і висока специфічність цього методу сбору даних забезпечує високий рівень чутливості та робить його найбільш підхожих для кількісних випробувань з використанням підхожих внутрішніх стандартів (на­ ПРИКЛад, дейтеровані стандарти) . Даний метод аналі­ зу може бути виконаний лише на приладі, з трьома квадруполями в послідовному з'єднанні, іонозахват­ ними аналізаторами або аналізаторами іон-циклот­ ронного резонансу.

колонок, являє собою плівку рідини, рівномірно на­ несену на стінки колонки.

Надкритична хроматографія заснована на процесах адсорбції або розподілу.

П РИЛАД

Прилад звичайно складається із системи подачі рухо­ мої фази, що охолоджується , пристрою вводу проби, хроматографічної колонки , яка знаходиться у термо­ статованій печі, детектора, регулятора тиску і систе­ ми реєстрації даних (або інтегруючого пристрою, або самописа).

КАЛІБРУВАНН Я

Калібруван ня дозволяє відповідні значення m/z відно­ сити до зареєстрованого сигналу. Я к правило, це ро­ биться з використанням стандартної речовини. Це калібрування може бути зовнішнім (одержаний файл відокремлений від даних аналізу) або внутрішнім (стандартну речовину (або стандартні речовини) змішують з випробовуваною субстанцією і зареєстро­ вани й спектр поміщують на одному одержаному файлі). Число іонів або позицій, необхідних для дос­ товірного калібрування, залежить від типу аналізато­ ра та від бажаної точності виміру, наприклад, у разі маг­ нітного аналізатора, для якого співвідношення m/z змінюється експоненціально з величиною магнітного поля, позицій має бути так багато, наскільки це мож­ ливо.

РЕЄСТРАЦІЯ СИ ГНАЛУ Й ОБРОБКА ДАНИХ

Іони, розділені задопомогою аналізатора, перетворю­ ються в електричні сигнали за допомогою детектую­ чої системи, такої як Фотопомножувач або електрон ­ н и й помножувач . Ц і сигнали п ідсилюються перед ре-перетворенням у цифрові (дискретні) сигнали для обробки даних, що дозволяє викон н увати різні функції, такі як калібрування, відтворення спектра, ав­ томатичне кількісне визначення, архівування, форму­ вання або використання бібліотеки мас-спектрів. Різні фізичні параметри, необхідні для функціонування приладу як цілісної системи, контролюються комп'ю­ тером.

2.2.45. НАДКРИТИЧНАХРОМАТОГРАФІЯ

Надкритична хроматографія ( НХ) являє собою метод хроматографічного розділення, в якому рухомою фа­ зою є флюїд - речовина у надкритичному або субкри­ тичному стані. Нерухома фаза, яку поміщають у ко­ лонки, складається з тон ко здрібнених твердих частинок, наприклад, силікагель або пористий графіт. Хімічно модифікована нерухома фаза є такою самою, як і у рідинній хроматографії, а у випадку капілярних

Пристрої для подавання рухомої фази

Пристрій для подавання рухомої фази необхідний для подавання рухомої фази з постійною швидкістю по­ току. Коливання тиску при цьому зводиться до мініму­ му, наприклад, шляхом пропускання розчинника, що є під тиском, через пристрій зменшення імпульсів. Трубопроводи та з'єднання здатні витримувати тиск, що виникає в результаті роботи пристрою подачі ру­ хомої фази.

Система, що контролюється мікропроцесором, здат­ на точно подавати рухому фазу при постійних умовах або умовах, що змінюються, у відповідності з певною програмою. При градієнтному елююванні є пристрій для подавання рухомої фази, що подає розчинник(и) із декількох ємностей, при цьому змішування розчин­ ників відбувається на стороні високого або низького тиску відносно насоса(ів).

Інжектори

Введен ня проби може бути проведене безпосередньо у верхню частину колонки з використанням клапана.

Нерухома фаза

Нерухомі фази поміщають у колонки, описані в стат­ тях Рідинна хроматографія (2.2.29) (набивні колонки) і Газова хроматографія (2.2.28) (капілярні колонки).

Максимальний внутрішній діаметр (0) капілярної ко­ лонки дорівнює 100 мкм.

Рухома фаза

Як рухому фазу звичайно застосовують діоксид вугле­ цю, у який може бути доданий полярний модифіка­ тор, наприклад, метанол, 2-пропанол або ацетонітрил. Склад, тиск (густина), температура та швидкість по­ току зазначеної рухомої фази можуть бути постійни­ ми протягом усього часу проведення хроматографіч­ ної методики (ізократичне, ізотермічне елюювання, елюювання при постійній густині), або змінюватися у відповідності з певною програмою (градієнтне елюю-

вання модифікатора, зміна тиску (густини), темпера­ тури або швидкості потоку).

Детектори

Найчастіше використовуються УФ- і Вид-спектрофо­ тометри, а також полум'енево-іонізаційні детектори. Також можуть ви користовуватися детектори, щО РО3сіюють світло, катарометри або інші спеціальні детек­ тори.

М ЕТОД И КА

Ви пробовуваний розчин(и) і розчин(и ) порівняння готують, як зазначено в окремій статті. Розчини не мають містити твердих частинок.

2.2.46.МЕТОДИ ХРОМАТОГРАФІЧНОГО РОЗДІЛЕННЯ

Методи хроматографічного розділення - це багатоста­ дійні методи розділення, в яких компоненти зразка розподіляються між двома фа:зами , одна з яких є не­ рухомою, друга - рухомою. Нерухома фаза може бути твердою речовиною або ріди ною, що нанесена на твер­ дий носій або гель. Нерухома фаза може бути поміще­ ною в колонку, нанесеною у вигляді шару, плівки тощо. Рухома фаза може бути газом, рідиною або флющом (газом у надкритичному стані). Розділення може фун­ туватися на процесах адсорбції, масового розподілу, іонного обміну тощо. Він може також грунтуватися на різниці у фізико-хімічних властивостях молекул, та­ ких як розмір, маса, об'єм тощо.

Критерії оцінки придатності хроматографічної систе­ ми зазначені у статті «Методи хроматографічногороз­ ділення» (2.2.46). У даній статті також за:значений діа­

п азон варіювання парам етрів хромато графічної системи для відповідності критеріям придатності хро­ матографічної системи.

Даний розділ включає визначення та розрахунки за­ гальних параметрів, а також вимог, звичайно застосо­ вуваних до придатності системи. Принципи розділен­ ня, обладнання та методики надаються у відповідних загальних статтях, що описують такі загальні методи : - хроматографія на папері (2.2.26),

Наступнівизначення використовувуються длярозрахун­ ку відповіднихмеж в монографіях.

При використанніпевногообладнання, деякіхарактерис­ тики, такі як відношення сигнал/шум, можуть розра­ ховуватися за допомогою програмного забезпечення, яке постачається виробником обладнання. Користувач по­ винен забезпечити, щоб такі програмні методи розра­ хунку були сумісні з вимогами Фармакопеї, а якщо це не так, то внести необхідні корективи.

начається положенням максимуму піка на хроматог­ рамі. Виходячи з часу утримування, може розрахову­ ватися об'єм утримування (VR):

де:

ІR - час утримування або відстань уздовж базової лінії від точки введення проби до перпендикуляра, опущеного з максимуму піка аналізованого ком­

пoHeHTa'

v - швидкість рухомої фази.

Коефіцієнт розподілу мас

Коефіцієнт розподілу мас (Dm) (відомий також як ко­ ефіцієнт ємності k' або фактор утримування k) визна­ чається як:

, к р н ф

Dш =k = к р р ф =Kc xv) ,

м

де:

КРНФ - кількість розчиненої речовини у нерухомій фазі;

КРРФ - кількість розчиненої речовини у рухомій фазі;

-рівноважний коефіцієнт розподілу (відомий також як константа розподілу) ;

-об'єм нерухомої фази;

-об'єм рухомої фази.

Коефіцієнт розподілу мас конкретного компонента може бути розрахований із даних хроматограми із ви­ користанням співвідношення:

де:

IR - час (або об'єм) утримування або відстань уздовж

базової лінії від точки введення проби до перпен­ дикуляра, проведеного з максимуму піка аналі­ зованого компонента;

Ім - « мертвий час» (або об'єм): час (або об'єм) утри­ мування або відстань уздовж базовоїлінії від точ­ ки введення проби до перпендикуляра, проведе­ н о го з максимуму п іка ком п о н е нта, що не утримується.

Коефіцієнт розподілу

В ексклюзивній хроматографії характеристика елюю­ вання компонента на конкретній колонці може бути виражена коефіцієнтом розподілу (Ко), що обчислю­ ють за формулою:

де:

IR - час (або об'єм) утримування або відстань уздовж

базової лінії від точки введення проби до перпендикуляра, проведеногоз максимуму піка аналізо­ ваного ком понента;

{о - «мертвий» час (або об'єм): час (або об'єм) утри­ мування або відстань уздовж базової лінії від точ­ ки введення проби до перпендикуляра, проведе­ н ого з максимуму п і ка ком понента, що не утримується;

[, - час (або об'єм) утримування або відстань уздовж базової лінії від точки введен ня проби до перпендикуляра, проведеного з м аксимуму п іка, що відповідає компоненту, який має повний доступ до пор нерухомої фази.

Коефіцієнт затримки

Коефіцієнт затримки (RF) ( відомий також я к ко­ ефіцієнт утримування Rf), що використовується у пла­ нарні й хроматографії, є відношенням відстані між точкою нанесення і центром плями до відстані, прой­ деної фронтом розчинника від точки нанесення:

де:

Ь- відстань, пройдена компонентом, що хромато­

графується; а - відстань, пройдена фронтом розчинника.

ХРОМАТОГРАФІЧН І ПОКАЗ Н И К И

Пік може бути охарактеризований площею піка (А) або

висотою піка (h) і шириною піка на напіввисоті (Wh), або висотою піка (h) і шириною піка між точками перегину

(wJ Для піків гаусової форми ( Рис. 2.2.46.- 1) має місце співвідношення:

Коефіцієнт симетрії

Коефіцієнт симетрії (tai!ing factor) піка (Рис. 2.2.46.-2) обчислюють за формулою:

WПll5 - ширина піка на одній двадцятій висоти піка;

d - відстань між перпендикуляром , опущеним із

максимуму піка, і переднім фронтом піка на одній двадцятій висоти піка.

Значення As = 1 .0 означає повну (ідеальну) симетрію.

tR2 > tRl

де:

ІRl та tR2 - часи утримування або відстані уздовж ба­ зової лінії від точки введення проби до пер­ пендикулярів, проведених з максимумів двох сусідніх піків;

Whl та Wh/ - ширини піків на їх напіввисоті.

Коефіцієнт розділення більший ніж 1 .5 відповідає роз­ діленню піків до базової лінії.

В ище зазначена формула не може бути застосована, якщо піки не можуть бути розділені до базової лінії.

У кількісній планарній хроматографії замість часів ут­ римування використовуються відстані, пройдені ком ­ понентами, і коефіцієнт розділення може бути обчис­ лений за формулою:

1---W005

Рисунок 2.2.46.-2

Ефективність колонки і число теоретичних тарілок

Число теоретичних тарілок (М (ефективність колон­ ки) може бути обчислене з даних, одержаних в ізотер­ мічному, ізократичному режимах або ізобаричному режимі, залежно від методу, за формулою, де значен­ ня tR і wh мають бути виражені в одних і тих самих оди­ Hицяx (час, об'єм або відстань):

де:

tR - час (або об'єм) утримування або відстань уздовж базовоїлінії від точки введення проби до перпен­ дикуляра, проведеного з максимуму піка аналі­ зованого компонента;

Wh- ширина піка на його напіввисоті.

Число теоретичних тарілок (М варіює зі зміною як компонента, так і колонки і часу утримування.

ПОКАЗ Н И К И РОЗДІЛЕН НЯ

Коефіцієнт розділення

Коефіцієнт розділення (Rs) між піками двох компо­ нентів може бути обчислений за формулою:

де:

RF/Ta RF2 - відношення відстаней між точками нане­

сення і центрами плям до відстані, прой­ деної фронтом розчинника від точки на­ несення (коефіцієнт затримки);

Whl та Whl - ширини піків на Їх напіввисоті,

а- відстань, пройдена фронтом розчинника.

Відношення пік/впадина

Відношення п ік/впадина (Pjv) може використовува­ тися як вимога придатності системи у випробуваннях на супровідні домішки, якщо між двома піками не

може бути дося гнуто розділення до базової лі нії

( Рис. 2.2.46.-3).

нP

Plv = -нv '

де:

Нр - висота мінорного піка над екстрапольованою ба­ зовою лінію;

Ну - висота над екстрапольованою базовою лінією найнижчої точки кривої, що розділяє інорни!! та основний піки.

Відносне утримування

Відносне утри мування (r) обчислюють за формулою:

= tR2 - tм

r ---

t RI -tм

J

де:

tR2 - час утримування досліджуваного піка;

fR/ - час утримування піка порівнян ня (звичай но піка, що відповідає аналізованій субстанції) ;

Ім - « мертвий час»: час утримування або відстань уз­ довж базової лінії від точки введення проби до перпендикуляра, проведеного з максимуму піка неутримуваного омпонента.

2.2. Фізичні та фізико-хімічні методи

стерігається на відстані, що дорівнює двадцятик­ ратній ширині піка на його на напіввисоті;

h- діпазон фонового шуму на хроматограмі холос­

того розчину, що спостерігається на відстані, що дорівнює двадцятикратній ш ирині п іка на його напіввисоті на хроматограмі зазначеного розчи­ ну порівняння, розміщеному, якщо це можливо, рівномірно навколо місця розташування піка.

Рисунок 2.2.46.-4

Збіжність

v

Рисунок 2.2.46.-3

Відносне утримування (rG) без урахування « мертвого» об'єму обчислюється за формулою:

Значення відносних утримувань, що наводяться в окремих статтях, якщо немає інших зазначень, відпо­ відають невиправленим відносним утримуванням.

У планарній хроматографії замість величин tR2 та ІRl використовуються коефіцієнти затримки RF2 та RF1 •

ТОЧ Н І СТЬ КІЛ ЬКІСН ИХ ВИЗНАЧ Е Н Ь

Відношення сигнал/шум

Відношення сигнал/шум (S/N) впливає на точність кількісних визначень і обчислюється за формулою:

жаній для зазначеного розчину порівняння; ви­ сота в и м ірюється від максимуму п і ка до екстрапольованої базовоїлініїсигналу, який спо-

Збіжність сигналу виражають як відносне стандартне відхилення, у відсотках (RSD%), щО обчислюють для послідовної серії вимірів, одержаних після проведен ­ ня інжекцій або нанесень розчину порівняння за фор­ мулою:

де:

Уі - індивідуальні величини, виражені як площа піка, висота піку або відношення площ або висот піків для методу внутрішнього стандарту;

у- середнє значен ня індивідуальних величин;

n- число індивідуальних величин.

Максимально припустиме відносне стандартне відхи­ лення (RSDтa) для серії паралельних інжекцій розчи­ ну 'порівняння обчислюють, виходячи з визначених меж вмісту, за формулою:

обхідним RSDдля 6 введень при В = 1.0;

Вверхня межа вмісту, н аведена в окремій статті, мінус 1 00 %;

n- кількість паралельних введень розчину по­

рівняння (3 n 6);