37_DFU_2.1 / DFU_Dopolnenie_2cr

"ЯКЩО немає інших зазначень в окремій стапі.....Із кожного контейнера проводять висівання на середо­ вище для виявлення бактерій і на середовище для ви­ явлення грибів. Якщо об'єм або кількість лікарського засобу в одному контейнері недостатня для проведен­ ня випробування, використовують вмістдвох і більше контейнерів для висівання на різні живильні середо­ вища.

ІНСТРУКЦІЯ ЩОДО ЗАСТОСУВАННЯ ВИПРОБУВАННЯ НА СТЕРИЛЬНІСТЬ

Наведена методика випробування на стерильність так само, як і всі інші фармакопейні методики, призначе­ надля того, щобдати змогу незалежному контролюю­ чому органу встановити, чи відповідає конкретний лікарський засіб вимогам Фармакопеї. Виробник не зобов'язаний дотримуватися наведених методик, він може вносити в них зміни або використовувати інші, якщо гарантує, що при випробуванні описаними вище офіційними методами його продукція буде відповіда­ ти вимогам Фармакопеї.

,.Запобігання мікробного забруднення. Асептичні умо­ ви при випробуванні на стерильність можуть бути до­ сягнуті, наприклад, використанням ламінар-боксу класу А, розташованого у чистому приміщенні класу В, або ізолятора.....

Рекомендації виробникам. Рівень надійності, з яким за

задовільним результатом випробування на сте­ рильність (відсутність нестерильних !<онтейнерів у зразку) можна зробити висновок про якість всієї серії, залежить від однорідності серії, умов виробництва і прийнятого порядку відбору проб. У даній стапі під серією розуміють сукупність герметично закупорених

контейнерів, вироблених таким чином, що під час ви­ робничого процесу ризик мікробного забруднення однаковий для кожного з них.

Якщо лікарський засіб піддається процедурі кінцевої стерилізації, результати автоматичного контролю об­ грунтованих із точки зору біології фізичних пара­ метрів, що підтверджують дотримання встановлених режимів при стерилізації серії, характеризують П сте­ рильність з більшою надійністю за результати випро­ бування на стерильність. Умови, в яких допускається випуск за параметрами, наведені у стапі

готування стерильних продуктів» (5.1.1). Для підтвер­

дження дотримання асептичних умов у процесі вироб­ ництва може бути використаний метод наповнення живильними середовищами. Однак випробування на стерильність є єдиним аналітичним методом, шо доз­ воляє оцінити стерильність лікарського засобу, виго­ товленого в асептичних умовах, і, крім того, у будь­ якому випадку це єдиний аналітичний метод, що дозволяє оцінити стерильність зразка лікарського за­ собу при проведенні експертизи.

При проведенні випробування на стерильність мож­ ливість виявлення мікроорганізмів прямо пропорцій­ наїх кількості у випробовуваному зразку і залежить від здатності цих мікроорганізмівдавати видимий ріст на живильних середовищах за умов випробування. Ймовірність виявлення мікроорганізмів мала при дуже низькому рівні забруднення лікарського засобу навіть при рівномірному мікробному забрудненні серії. Інтерпретація результатів випробування на сте­ рильність грунтується на тому припущенні, ЩО одер­ жувані результати були б ідентичні для кожного кон­ тей нера, що входить до складу серії. Оскільки випробування кожного контейнера провести немож­ ливо, необхідно розробити план відбору проб. При

РОЗЧИННИ КИ ТА П РОМИ ВН І РІДИНИ

Для розчинення лікарськихзасобів і відмивання мемб­ ранних фільтрів можуть бути використані розчинни­ ки, які не мають антимікробної активності за умов випробування. Рекомендовані розчинники та про­ мивні рідини наведені нижче.

рН після стерилізації 7. 1 ±0.2

Стерилізують у паР0ВОМУ стерилізаторі, як описано вище для живильних середовищ. Час стерилізації виз­ начають при валідації методу стерилізації залежно від об'єму рідин, які стерилізуються.

ТЕСТ-МІКРООРГАНІЗМИ

При перевірці придатності методики і для контролю ростових властивостей живильних середовищ можуть бути також використані такі штами тест-мікроор­ ганізмів:

•

-замість тест-мікроорганізму Candida albicans АТСС

1023 1 ( ІР 48. 72, АТСС 2091 , І Р 1 180. 79) може бути

використаний тест-мікроорганізм Candida albicans

NTCC 885-653;

-замість тест-мікроорганізму Clostridium sporogenes

АТСС 19404 (СІР 79.3) може бути використаний

тест-мікроорганізм Clostridium sporogenes NQ 272.

•

2.6.14. БАКТЕРІАЛЬНІ ЕНДОТОКСИНИ

•

"Випробування на бактеріальні ендотоксини з вико­ ристанням лізату амебоцитів мечохвоста (Limulus

polyphemus або Tachypleus tridentatus) призначене для

виявлення або кількісного визначення ендотоксинів, джерелом яких є грам-негативні бактерії. Існують три основні методологічні підходи проведення даного вип­ робування: гель-тромб метод, заснований наутворенні гелю; турбідиметричний метод, заснований на появі каламутності після розщеплення ендогенного субстра-

ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.2

ту; хромогенний метод, заснований на появі забарв­ лення після розщеплення синтетичного пептид-хро­ могенного комплексу.

,.У даній CTaттi описані такі "шість методів.

Метод А - гель-тромб метод: граничне випробування;

Метод В - гель-тромб метод: напівкількісне випробування;

Метод С - турбідиметричний кінетичний метод; Метод D - хромогенний кінетичний метод; Метод Е - хромогенний метод кінцевої точки;

,.Метод F - турбідиметричний метод кінцевої точки

Випробування проводять будь-яким із шести наведе­ них методів. При сумнівах або розбіжностях остаточ­ ний висновок приймають на підставі результатів, одер­ жаних при проведенні випробування методом А, якщо немає інших зазначень в окремій CTaттi.

•

Випробування проводять за методикою, що дозволяє уникнути забруднення "ендотоксинами .

,.Обладнання

Проводять депірогенізацію всього скляного посуду Й іншого термостійкого обладнання у сушильній шафі з використанням валідованого процесу. Звичайно вико­ ристовуються мінімальні час і температура - 250 ОС протягом 30 хв. Для пластмасового обладнання, на­ приклад, планшет для мікротитрування та наконеч­ ників для автоматичних піпеток, має бути показано, що воно не містить визначуваних ендотоксинів і зава­ жаючих факторів, що впливають на результати вип­ робування.

ПРИМІТКА: У даній статті термін <<пробірка» вклю­ чає всі типи ємностей, наприклад, планшети для мікро­ титрування.

Приготування основного розчину стандартного препарату ендотоксину

Основний розчин стандартного препарату ендотокси­ ну готують зі стандартного препарату ендотоксину, каліброваного відносно Міжнародного Стандарту, на­

ПРИКЛад, ендотоксину БСп.

Активність ендотоксину виражають у Міжнародних Одиницях ( МО). Еквівалентність М іжнародного Стандартув Міжнародних Одиницях затверджена Все­ світньою Організацією Охорони здоров'я.

ПРИМІТКА: Одна Міжнародна Одиниця (МО) ендоток­ сину відповідає одній Ендотоксиновій одиниці (ЕО).

При приготуванні і зберіганні основного розчинустан­ дартного препарату ендотоксину дотримуються умов інструкції, доданої до упаковки та зазначеній на ети­ кетці.

1 15

Приготування розчинів стандартного препарату ендотоксину

Після енергійного перемішування основного розчину стандартного препарату ендотоксину готують відпо­ відну серію розведень цього розчину, використовую­ чи водудля проведення випробування на бактеріальні ендотоксини (вода для БЕТ).

Розчини використовують свіжоприготованими, щоб уникнути втрати Їх активності в результаті адсорбції.

Приготування випробовуваних розчинів

Випробовувані розчини готуютьрозчиненням або роз­ веденням лікарських субстанцій або лікарських пре­ паратів з використанням води дЛЯ БЕт. Деякі суб­ станції або препарати розчиняють або розводять в інших водних розчинах. Якщо необхідно, доводять значення рН випробовуваного розчину (або одержа­ ного з нього розведення) таким чином, щоб значення рН суміші лізату і випробовуваного розчину знаходи­ лося в інтервалі значень, зазначеному виробником лізату. Звичайно, цей інтервал для випробовуваного зразка має бути від 6.0 до 8.0 одиниць рН. Доведення рН можна проводити за допомогою кислоти, лугу або підхожого буферного розчину, відповіднодо рекомен­ дaцiй виробника лізату. Розчини кислот або лугів мо­ жуть бути приготовані з концентрованих розчинів або твердих речовин за допомогою води для БЕТ у посуді, що не містить визначуваних ендотоксинів. Буферні розчини мають бути валідованими щодо відсутності визначуваних ендотоксинів та заважаючих факторів.

Визначення максимально допустимого розведення

Максимально допустиме розведення ( МДР) є макси­ мально можливим розведенням зразка, при якому може бути визначений граничний вмістендотоксинів. МДР обчислюють за формулою:

Граничний вміст ендотоксинівх

Граничний вміст ендотоксинів для парентеральних

лікарських засобів обчислюють виходячи з максималь­ ноїдози лікарського засобу:

к

м'

де:

К - гранична пірогенна доза ендотоксинів на кілог­ рам маси тіла зц годину,

М- максимальна рекомендованадозалікарського за­ собу на кілограм маси тіла за годину.

Граничний вміст ендотоксинів для парентеральних лікарських засобів зазначають в окремих статтях у

МО/мл, МО/мг, МО/одиницю біологічної активності і Т.п.

Концентрація випробовуваногорозчину:

-у мг/мл, якщо граничний вміст ендотоксинів заз­ начений на одиницю маси (МО/мг),

-в Одиницях/мл, якщо граничний вміст ендоток­ синів зазначений на одиницю біологічної актив­ ності ( МО/Одиницю),

-у мл/мл, якщо граничний вміст ендотоксинів заз­ начений на одиницю об'єму (МО/мл).

л- зазначена на етикетці чутливість лізату (МО/мл) у гель-тромб методі аботочказ мінімальним зна­ ченням на стандартній кривій у турбідиметрич­ ному або хромогенному методах.

ГЕЛЬ-ТРОМБ М ЕТОДИ ( А і В)

Метод грунтується на утворенні щільного гелю в при­ сутності ендотоксинів і дозволяє виявити або кількісно визначити ендотоксини. Значення концентраціїендо­ токсинів, необхідне для того, щоб викликати у стан­ дартнихумовахутворення згусткулізату, дорівнює зна­ ченню чутливостілізату, зазначеному на етикетці. Для валідації випробування і гарантії його точності, підтверджують зазначену на етикетці чутливість ліза­ ту і проводять випробування на наявність заважаючих факторів відповіднодо зазначеньрозділу 1 . Попередні випробування.

1. ПОПЕРЕДНІ ВИПРОБУВАННЯ

(і) Підтвердження чутливості лізату, зазначеної на

етикетці

Перед використанням розчину лізату у випробуванні підтверджують зазначену на етикетці чутливість л, ви­ ражену в МО/мл, у чотирьох паралелях. Підтверджен­ ня чутливості лізату проводять у тих випадках, коли використовують нову серію лізату, або у випадкузміни в умовах експерименту, що може вплинути на резуль­ тати випробування.

Готують розчини стандарту ендотоксину принаймні в чотирьох концентраціях, що дорівнюють 2л, Л, 0.5Л і 0.25Л, розводячи основний розчин стандартного пре­ парату ендотоксину водою дЛЯ БЕТ.

Змішують у кожній пробірці розчин лізату з таким са­ мим об'ємом одного з розчинів стандарту ендотокси­ ну (наприклад, аліквотним 0. 1 мл). При використанні флаконів або ампул зліофілізованим лізатом, призна­ ченихдля проведення одноговипробування, розчини додають безпосередньо в флакон або ампулу. Реакцій­ ну суміш інкубують, уникаючи вібрації, протягом по­ стійного періоду часувідповіднодо рекомендацій ви­ робника лізату (звичайно при температурі (37 ± 1 ) ос протягом (60 ± 2) хв). Випробування на цілісність гелю для пробірок: беруть кожну пробірку по черзі безпо­ середньо з інкубатора і перевертають Подним по-

Розчин

А

В

С

D

Одержана концентрація

-

2 л Іл.

0.5 л

0.25 л

2 л

І л

0.5 л

0.25 л

-

Кількість

паралельних проб

4

4

4

4

4

2

2

2

2

2

вільним рухом, приблизно на 1 80 О. Якщо утворився стійкий гель, що залишається на місці після перевер­ тання, результат реєструють як позитивний. Резуль­ тат вважається негативним, якщо стійкий гель не ут­ ворився.

Випробування дійсне, якщо при найнижчій концент­ рації розчинів стандартного препарату ендотоксину одержаний негативний результат у всіх паралельних рядах.

Останній позитивний результат у ряду концентрацій ендотоксинів, що знижуються, є кінцевою точкою. Середнє значення логарифмів концентрацій у кінце­ вих точках, а потім - антилогарифм середнього зна­ чення обчислюютьза формулою:

Середнє геометричне значень концентрацій у кінцевих точках =

Іє

= антилогарифм f '

де:

e - сума логарифмів концентрацій у кінцевій точці використовуваних рядів розведень;

f- кількість паралельних проб.

Середнє геометричне значення концентрацій у кінце­ вих точках є розрахунковою чутливістю розчину ліза­ ту (МО/мл). Якщо вона не менша 0.5Л і не більша 2л, зазначена на етикетці чутливість лізату вважається підтвердженою і використовується при виконанні вип­ робувань з використанням цього лізату.

(іі) Випробування на наявність заважаючих факторів

Готують розч ини А, В, С і О, я к зазначено в Табл. 2.6. 14.-1 , використовуючи випробовувані розчи­ ни в розведенні, меншому МДР, щО не містять визна­ чуваних ендотоксинів відповідно до зазначень розді­ лу 1 . Попередні випробування, (і) П ідтвердження чутливості лізату, зазначеної на етикетці.

Середнє геометричне значення концентрацій розчи­ нів В і С у кінцевій точці обчислюють за формулою, зазначеною у розділі 1 . Попередні випробування, (і)

Підтвердження чутливості лізату, зазначеної на ети­ кетці.

Якщо в умови експерименту вносять зміни, які можуть вплинути на результат випробування, то випробуван­ ня на наявність заважаючих факторів повторюють.

Випробування вважають не дійсне, якщо не всі пара­ лельні ряди розчинів А і О показують відсутність ре­ акції, та результат для розчину С не підтверджує заз­ начену на етикетці чутливість лізату.

Якщо чутливість лізату, визначена для розчину В, не менша 0.5Л і не більша 2л, випробовуваний розчин не містить заважаючих факторів в умовах випробування. у протилежному разі розчин включає фактори, що за­ важають проведенню випробування.

Якщо при проведенні випробування випробовуваний зразок включає заважаючі фактори у розведенні, мен­ шому за значення МДР, повторюють випробування на наявність заважаючих факторів, використовуючи більш високе розведення, але не перевищуюче значен­ ня МДР. Використання більш чутливого лізату дозво­ ляє використовувати більш розведений випробовува­ ний зразок. Це може бути застосоване для усунення заважаючих факторів.

Зашіжаючі фактори можна усунути, використовуючи відповідну методику пробопідготовки, що включає, наприклад, фільтрацію, нейтралізацію, діаліз або тер­ мообробку. Для підтвердження, того що обрана мето­ дика пробопідготовки ефективно усуває заважаючі фактори без втрати ендотоксинів, повторюють випро­ бування на наявність заважаючих факторів, викорис­ товуючи випробовуваний зразок, що піддавали об­ робці обраним методом після додавання до нього стандартного препарату ендотоксину.

2. ГРАНИЧНЕ ВИПРОБУВАННЯ (МЕТОД А)

(і) Методика

Розчини А, В , С і О готують, як зазначено в Табл. 2.6. 14.-2, і проводять випробування для цих роз-

чинів за методикою, зазначеною в розділі 1 . Попередні випробування, (і) Підтвердження чутливості лізату, зазначеної на етикетці.

Готують розчин А і розчин В (позитивний контроль препарату), використовуючи розведення, що не пере­ вищує значення МДР, та проводять випробування за методикою, зазначеною в розділі І. Попередні випро­ бування, (іі) Випробування на наявність заважаючих факторів. Розчини В і С (позитивні контролі) містять стандартний препарат ендотоксину в концентрації, у два рази перевищуючої чутливістьлізату, зазначену на етикетці. Розчин D (негативний контроль) містить воду БЕт.

(іі) Інтерпретація результатів

Випробування вважається не дійсне, якщо обидві па­ ралельні проби двох позитивних контрольнихрозчинів В і С недають позитивного результатутадві паралельні проби негативного контрольного розчину D не дають негативного результату.

Випробовуваний зразок відповідає вимогам випробу­ вання, якщо негативний результат виявленийдля обох паралельних проб розчину А.

Якщо для обох паралельних проб розчину А одержа­ ний позитивний результат:

-та якщо випробовуваний зразок розведений до зна­ чення МДР, він не витримує випробування;

-та якщо випробовуваний зразок розведений до роз­ ведення, меншого за значення МДР, випробування повторюють при розведенні, що не перевищує зна­ чення МДР.

Якщо для однієї з паралельних проб розчину А одер­ жаний позитивний результат, адля іншої паралельної проби - негативний результат, випробування повто­ рюють. Випробовуваний зразок відповідає вимогам випробування, якщо при проведенні повторного вип­ робування для обох паралельних проб розчинуА одер­ жаний негативний результат.

3. НАП ІВКІЛЬКІСНЕ ВИПРОБУВАН НЯ (М ЕТОД В)

(і) Методика

Дана методика дозволяє визначити вміст бактеріаль­ них ендотоксинів у випробовуваному розчині за до-

помогою титруваннядо кінцевоїточки. Розчини А, В, С і D готують, як зазначено в Табл. 2.6. 14.-3, та прово­ дять випробування цих розчинів відповідно до мето­ дики, описаної у розділі 1 . Попередні випробування, (і) Підтвердження чутливостілізату, зазначеної наети­ кетці.

(іі) Розрахунок і інтерпретація результатів

Випробуваннядійсне, якшо виконуютьсятакітри умо­ ви:

(а) обидві паралельні проби розчину О (негативний контроЛl ) дають негативний результат,

(Ь) обидві паралельні проби розчину В (позитивний контроль препарату) дають позитивний результат,

(с) середнє геометричне значень концентрацій, одер­ жане для розчину С в кінцевій точці, знаходиться в межах від дО 2Л.

Для визначення концентрації ендотоксинів у розчині А, обчислюють концентраціїдля кожного ряду розве­ день у кінцевій точці, множачи коефіцієнт розведен­ ня кожної кінцевої точки на л.

Концентрація ендотоксинів у випробовуваному роз­ чині дорівнює середньому геометричному значенню концентрацій у кінцевій точці у використовуваних рядах розведень (див. формулу, зазначену у розділі І . Попередні випробування, (і) Підтвердження чутли­ вості лізату, зазначеної на етикетці. Якщо випробу­ вання проводиться для розведеного випробовуваного розчину, обчислюють концентрацію ендотоксинів у вихідному розчині, множачи результат на коефіцієнт розведення.

Якщо жодне з розведень випробовуваного розчину не дає позитивного результату при проведенні випробу­ вання, дійсністьякого підтверджена, реєструють кон­ центрацію ендотоксинів як меншу за л (або, якщо вип­ робування проводилось для розведеного зразка, як меншу за значення Л, помножене на найнижчий кое­ фіцієнт розведення зразка). Якщо всі розведення да­ ють позитивний результат, реєструють концентрацію ендотоксинів яктаку, щодорівнює або перевищує най­ більший коефіцієнт розведення, помножений на І (на­ приклад, у Табл. 2.6. 14.-3, вихідний коефіцієнт розве­ дення х 8 х л).

Зразок відповідає вимогам випробування, якщо кон­ центрація ендотоксинів менша за зазначену у відповідній окремій статті.

ФОТОМЕТРИЧНІ М ЕТОДИ(С, О, Е і F)

І. ТУРБІДИМЕТРИЧНІ МЕТОДИ (С і F)

Дані методи належать до фотометричних методів ви­ міру збільшення ступеня каламутності. У залежності від принципу, покладеного в основу проведення вип­ робування, зазначений метод класифікують як турбі-

Одержана Кількість концентрація паралельних проб

диметричний метод кінцевоїточки аботурбідиметрич­ ний кінетичний метод.

Турбідиметричний метод кінцевоїточки (Метод F) зас­ нований на кількісній залежності концентрації ендо­ токсинів від ступеня каламутності (поглинання або пропускання) реакційної суміші наприкінці інкуба­ ційного періоду.

Турбідиметричний кінетичний метод ( Метод С) зас­ нований на вимірі часу (порогового часу), необхідно­ го для досягнення попередньо визначеної величини поглинання, або ступеня каламутності реакційної суміші.

Випробування проводять при температурі інкубації, рекомендованої виробником лізату (звичайно

(37 ± І) еС).

2. ХРОМОГЕННІ МЕТОДИ (D і Е)

Дані методи використовуютьдля вимірукількості хро­ мофору, що вивільнився з відповідного хромогенного пептиду в результаті реакції ендотоксинів з лізатом. У

залежності від принципу, покладеного в основу вип­ робування, цей метод класифікують як хромогенний метод кінцевої точки або хромогенний кінетичний метод .

Хромогенний кінетичний метод (Метод Е) заснований на кількісній залежності концентраціїендотоксинів від кількості хромофору, що вивільнився до кінця інкуба­ ційного періоду.

У процесі випробування хромогенного кінетичного методу (метод О) вимірюють час (час початку), необ­ хідний для досягнення попередньо визначеної вели­ чини оптичної густини реакційної суміші або інтен­ сивності забарвлення реакційної суміши.

Випробування проводять при температурі інкубації,

рекомендованої виробником лізату (звичайно

(37 ± І) ес).

3. ПОПЕРЕДНІ ВИПРОБУВАННЯ

Для перевірки точності або валідацїі випробування турбідиметричним методом абохромогенним методом проводять попередні випробування, що дозволяють переконатися в надійності критеріїв для стандартної кривоїта в тому, що випробовуваний розчин не є фак­ тором, заважаючим проведенню випробування.

Валідація методики випробування необхідна, якщо в умови експерименту внесені будь-які зміни, що мо­ жуть вплинути не результати випробування.

(і) Перевірка надійності критеріїв ДЛЯстандартної

кривої

Готують не менше як три розведення розчину стандарт­ ного препарату ендотоксину для побудови стандарт­ ної кривої. Використовуючи не менше як три пара­ лельні ряди кожного розведення розчинустандартного препарату ендотоксину; проводять випробування відповіднодо рекомендацій виробникалізату (об'ємні співвідношення, час інкубації, температура, рНта ін.).

Якщо при проведенні випробування кінетичним ме­ тодом необхідний інтервал перевищує 2 логарифми, включаютьдодаткові розведення стандартного препа­ рату ендотоксину для того, щоб розмежувати кожне підвищення логарифма на одиницю в інтервалі зна­ чень стандартної кривої.

Абсолютна величина коефіцієнта кореляції, І r І, маєдо­ рівнювати або бути вищою за 0.980 для інтервалу кон­ центрацій ендотоксинів, зазначених виробником ліза­ ту.

4. ВИПРОБУВАННЯ

(і) Методика

Проводять випробування відповіднодо методики, заз­ наченоїу розділі 3. Попередні випробування, (іі) Вип­ робування на наявність заважаючих факторів.

(іі) Розрахунок

Концентрацію ендотоксинів у кожному з паралельних розчинів А розраховують, використовуючи стандарт­ ну криву, одержану для рядів позитивних контролів (розчин С).

Випробування вважаєтьсядійсним, якщо виконують­ ся такі три умови:

(а) результат, одержаний для розчину D (негативний контроль), не перевищує граничного контрольного значення, зазначеного в інструкціїдо використовува­ ного лізату;

(Ь) результати, одержані для паралельних рядів пози­ тивних контролів (розчин С), відповідають вимогам, зазначеним для валідаційних випробувань, як зазна­ чено у розділі 3. Попередні випробування, (і) Пере­ вірка надійності критеріїв для стандартної кривої;

(с) величина вмісту ендотоксинів, одержана після ви­ рахування з концентрації ендотоксинів, виявлених у розчині В, після віднімання концентрації ендоток­ синів, виявлених у розчині А, знаходиться в інтервалі від 50 % до 200 %.

(іії) Інтерпретація результатів

Випробовуваний зразок відповідає вимогам випробу­ вання, якщо середне значення вмісту ендотоксинів у паралельних пробах розчину А з урахуванням розве­ дення і концентрації випробовуваного розчину мен­ ше за межу вмісту ендотоксинів для препарату.

5. РЕАКТИВИ

(ї) Розчин лізату

Лізат амебоцитів розчиняють при легкому перемішу­ ванні у воді для БЕТ або буферному розчині відповід­ но до рекомендацій виробника лізату. Розчин лізату зберігають охолодженим або замороженим відповід­ но до зазначень виробника лізату.

(ЇЇ) Лізат амебоцитів

Лізат амебоцитів являє собоюліофілізований продукт, одержаний з лізату амебоцитів мечохвоста (Limulus

po/yphemus або Tachyp/eus tridentatus). Цей реактив має

бути вироблений відповідно до вимог уповноважено­ го органу.

Лізатамебоцитів реагує не тільки з ендотоксинами, але і f3-глюканами. Можливе використання реактивівліза-

ту амебоцитів, що не реагують із глюканами. Їх готу­ ють, видаляючи злізату амебоцитів фактор G, щО реа­ гує з глюканами, або інгибуючи реакційну систему фактора G у лізаті амебоцитів. ці реактиви можуть бути використані для випробування на наявність ен­ дотоксинів у присутності глюканів.

(ііі) Вода дЛЯ БЕТ (вода для випробування на

бактеріальні ендотоксини)

Вода для БЕТ являє собою воду для ін єкцій Р або одер­ жану іншими способами воду, для якої показана відсутність реакції з використовуваним лізатом у виз­ начуваній ним межі.

Наступний розділ наведений для інформації.

Випробування на бактеріальні ендотоксини. Рекомендації

1 . ВСТУП

Ендотоксини, джерелом яких є грамнегативні мікро­ організми, є найбільш розповсюдженою причиною токсичних реакцій, виникаючих при забрудненні лікарських засобів пірогенами; їхня пірогенна ак­ тивність набагато вища, ніж активність більшості інших пірогенних речовин. ці ендотоксини є ліпопо­ лісахаридами. Незважаючи на те, що є незначна кількість пірогенів іншої хімічної природи, які мають різну структуру, звичайно саме відсутність бактеріаль­ них ендотоксинів у лікарському засобі має на увазі відсутність пірогенних компонентів, за умови, що на­ явність пірогенних речовин, які не є ендотоксинами, можна виключити.

Наявність ендотоксинів у лікарському засобі може маскуватися факторами, що заважають реакції між ендотоксинами та лізатом амебоцитів. Отже, при ба­ жанні замінити передбачене окремою статтею випро­ бування на пирогени на кроликах випробуванням на бактеріальні ендотоксини необхідно довести, що це випробування може бути здійсненедля даноголікарсь­ кого засобу; для цього може знадобитись розробка процедури усунення заважаючихфакторів.

Перш ніж розглядати можливість використання вип­ робування на бактеріальні ендотоксини стосовно кон­ кретного лікарського засобу, необхідно одержати таку інформацію.

1 . 1 . Установити придатність матеріалів, використову­ ванихдля проведення випробування. Має бути гаран­ тована відсутність ендотоксинів у "'воді дЛЯ БЕТ й інших реактивах; необхідно перевірити заявлену ви­ робником чутливість лізату амебоцитів.

1 .2. Оскільки випробовуваний лікарський засіб може служити перешкодою для результатів випробування, чутливість лізату визначають у присутності та відсут­ ності цього лікарського засобу. Між двома значення­ ми чутливості не має бути істотного розходження.

У методиці випробування на бактеріальні ендотокси­ ни "'(2.6.14) мають зазначати методи усунення зава­ жаючих факторів; • при наявності заважаючих фак­ торів потрібно усунути заважаючи фактори підхожим методом, провести перевірку усунення заважаючих факторів та провести інше випробування.

Даний розділ пояснює причини вимог випробування на бактеріальні ендотоксини і крім того надає інфор­ мацію щодо обліку й інтерпретації результатів.

Заміна випробування на пірогени на кроликах . "'випробуванням з використанням лізату амебоцитів фактично означає використання альтернативного ме­ тоду аналізу і, отже, має потребу у валідації; у. розділі ,..1 1 наведені деякі вказівки про те, як треба чинити.

У окремій статті налікарський засіб зазначають основ­ ний метод проведення випробування на бактеріальні ендотоксини. Якщо метод не зазначений, метод А ви­ користовують як основний метод. Якщо передбачаєть­ ся використовувати метод, відмінний від основного, необхіднодовести, що цей метод є придатним для да­ ного лікарського засобу і дає результати, шо узгоджу­ ються з одержаними за основним методом (див. також

"'розділ 13 .).

•

2. М ЕТОД

Додавання ендотоксинів до лізату амебоцитів може призвести до появи каламутності, утвореннюосадуабо гелю "'(метод гелеутворення). При проведенні випро­ бувань на бактеріальні ендотоксини для першої групи методів як критерій оцінки в Фармакопеї ВИКОРІІСТО­ вувався тільки гель-тромб MeTOД Перевагою цього методу є простота вирішення про те, чи витримав зра­ зок лікарського засобу випробування на основі Н<НІВ­ ності або відсутності гелеутворсння, видимого неозб­ роєним оком. Кількісні мстоди, описані як методи С, О, Е,..Fі , були розроблені пізнішс; для Їх виконання необхідна більша кількість обладнання, але Їх легше автоматизувати для цілеіі рсгулярних випробувань ве­ ликих кількост6і зразків одного ітого самоголікарсь­ кого засобу.

Ендотоксини можуть адсорбуватися на поверхні про­ бірок і піпеток, виготовлсних здеяких видів пластика або типів скла. Можуть ВІІІІІІКНУПІ перешкоди, зумов­ лені вивільненням реЧОВІІІІ із IІJlастикових матеріалів. Отже, використовувані матеріали треба перевіряти; наступні партії пробірок або піпсток можуть незнач­ но відрізнятися за складом, і, тому, рекомендується повторювати такі випробування, починаючи працю­ вати з новими партіями матеріалів.

•

Рішення використовувати випробування на бактері­ альні ендотоксини як граничного випробування має на увазі, по-перше, що для лікарських засобів, які підлягають випробуванню, треба визначити межу вмісту ендотоксинів і, по-друге, необхідно знати, чи

перевищує вміст ендотоксинів у випробовуваному зразку цю граничну межу, чи й значення нижче цієї величини. Кількісні методи С, О, Е і F роблять мож­ ливим визначення вмісту ендотоксинів у випробову­ ваномузразку, але при встановленні відповідності зраз­ ка вимогам Фармакопеїта проведенні контролю якості за рутинною методикою заключне питання полягає в тому, чи перевищує цей вміст певну межу.

При встановленні межі вмісту ендотоксину для вип­

робовуваного зразка треба приділити належну увагу

дозі випробовуваноголікарського засобу длялюдини. Мета цього полягає в тому, щоб гарантувати, щодоти, поки вміст ендотоксинів у зразку залишається ниж­ чим за межу, навіть максимальна доза лікарського за­ собу, введена зазначеним шляхом за годину, не буде містити такої кількості ендотоксинів, що викликає токсичну реакцію.

Якщо вмістендотоксинів у зразкуточнодорівнює гра­ ничній величині, як і в тому випадку, коли вміст ендо­ токсинів значно вищой за цю величину, відбувається гелеутворення, і зразок не проходить випробування, оскільки характер випробування «усе або нічого» ро­ бить неможливим розмежування вмісту, що точно до­ рівнює граничній концентрації, і вмісту, що переви­ щує граничну концентрацію. Тільки в тому разі, коли' гелеутворення не спостерігається, можна зробити вис­ новок, що концентрація ендотоксинів нижча за межу вмісту .

Для лікарських засобів ІІ"'д ля парентерального засто­ сування... увигляді порошків цей гран.ичниЙ вміст ен­ дотоксину на одиницю маси або на Міжнародну Оди­ ницю (МО) лікарського засобутреба перевести в вміст ендотоксинів на мілілітр розчину, який підлягає вип­ робуванню, оскільки випробування може бути прове­ дене лише для розчину. Випадок, коли лікарські засо­ би вже перебувають в рідкому стані (наприклад, інфузійні розчини), обговорюється нижче.

11'"Граничний вміст ендотоксинів для лікарськихзасобів,

що вводяться парентерально, розраховують за форму­ лою:

к

м'

де:

К- максимальна пірогенна доза ендотоксину на кілограм маси тіла за годину,

М- максимальна рекомендованадозалікарського за­ собу на кілограм маси тіла за годину.

Граничний вміст ендотоксинів залежить від лікарсько­

го засобу і шляху його введення і зазначається в окре­ мих статтях. Значения Кзазначені в Табл. 2.6. 1 4.-5.

Для інших шляхів уведення лікарського засобу кри­ терій прийнятності для нормування бактеріальних ендотоксинів визначають на основі результатів, одер­ жаних при розробці даного лікарського засобу....