2.3. Якісні реакції

Для встановлення якісного складу коренів ехінацеї використовували загальноприйняті методи досліджень – якісні реакції, ПХ, ТШХ [8, 12, 37, 42, 55, 71, 83, 89, 90, 91].

Для приготування водних витяжок 50,0 г подрібненої сировини, що проходила крізь сито з діаметром отворів 2-3 мм, заливали водою 1:5 і нагрівали зі зворотним холодильником на киплячій водяній бані протягом 1 год, періодично збовтуючи для змивання часток сировини зі стінок колби. Отриману гарячу витяжку фільтрували крізь складчастий фільтр. Екстракцію сировини повторювали ще двічі в описаних вище умовах новими порціями екстрагенту. Об’єднані витяги концентрували у вакуумі до 50 мл і використовували для визначення вуглеводів, амінокислот, дубильних речовин, гідроксикоричних кислот, органічних кислот [85].

Водно-спиртовий витяг отримували за методикою, описаною вище. Екстракцію 50,0 г сировини проводили 70% спиртом етиловим. Водно-спиртовий витяг використовували для визначення флавоноїдів та сапонінів [85].

Для проведення якісних реакцій на пектинові речовини 5,0 подрібненої сировини екстрагували 15 мл 2% розчину натрію карбонату з натрію гідроксидом. Суміш нагрівали на киплячій водяній бані протягом 20 хв, періодично збовтуючи для змивання часток сировини зі стінок колби. Витяжку переносили у центрифужну пробірку за допомогою 20 мл гарячої води, центрифугували 5 хв при 2000 оборотів за 1 хв. Надосадову рідину зливали у колбу ємністю 100 мл. Осад промивали двічі гарячою водою порціями по 20 мл, центрифугуючи в тих же умовах. Промивні води переносили в ту ж колбу ємністю 100 мл. Розчин охолоджували до кімнатної температури і перемішували, після чого проводили якісні реакції на пектинові речовини [28, 74].

2.3.1. Визначення вуглеводів

2.3.1.1. Визначення вільних та зв’язаних цукрів Дослідження вільних та зв’язаних цукрів проводили використовуючи наступні реакції.

З реактивом Фелінга. У дві мірні колби вміщували по 2 мл водної витяжки, в одну з них додавали 5 крапель кислоти хлоридної концентрованої, а в другу – аналогічну кількість води дистильованої. Нагрівали протягом 15 хв. Кисле середовище нейтралізували 10% розчином калію гідроксиду до рН=7 за універсальним індикатором, а об’єм другої пробірки доводили водою дистильованою до об’єму першої пробірки. Потім до водних розчинів обох пробірок додавали по 2 мл реактиву Фелінга, кип’ятили 1 хв і залишали у штативі на 10 хв [28]. Утворювався цегельно-червоний осад закису міді, який свідчив про наявність вільних цукрів в коренях ехінацеї пурпурної.

Реакція з -нафтолом. До 2 мл витяжки, що вивчали, додавали по 3 краплі 20% спиртового розчину -нафтолу і, обережно, по стінках пробірок по 2 мл кислоти сульфатної концентрованої [28]. На межі розподілу шарів з’являлося вишнево-червоне кільце, що свідчило про наявність речовин глікозидного характеру в коренях ехінацеї пурпурної.

2.3.1.2. Виявлення полісахаридів

При додаванні до 20 мл концентрованого водного витягу з коренів ехінацеї пурпурної чотирикратного об'єму 96% спирту етилового утворювався аморфний осад (наявність полісахаридів). Його відділяли, промивали, висушували і використовували для проведення хроматографічного аналізу [90].

Хроматографічне вивчення. Для вивчення якісного моносахаридного складу брали близько 0,2 г полісахариду, розчиняли його в мінімальному об'ємі води (3 мл) в колбі зі шліфом, додавали такий самий об'єм 20% кислоти сульфатної і гідролізували зі зворотним холодильником при нагріванні на водяній бані, контролюючи хід гідролізу методом ПХ. Повний гідроліз проходив за 4 год. Гідролізат нейтралізували барію карбонатом до нейтральної реакції за універсальним індикатором. Розчин фільтрували, фільтр і осад на фільтрі промивали водою. Фільтрат випарювали в вакуумі до сухого залишку, який розчиняли в 0,5 мл етанолу.

Отриманий розчин наносили на хроматографічний папір „Filtrak FN” №7 та хроматографували у системі розчинників ацетон-н-бутанол-вода (7:2:1) низхідним способом у присутності достовірних зразків моносахаридів. Для ідентифікації вільних цукрів паралельно досліджували фугат, отриманий у ході осадження полісахаридів.

Хроматограму висушували на повітрі, обробляли анілінфталатним реактивом (0,33 г аніліну та 1,66 г кислоти фталевої в 100 мл н-бутанолу, насиченого водою) і нагрівали в сушильній шафі протягом 10 хв при температурі 100-105 °С. При цьому альдогексози проявлялися у вигляді коричневих плям, альдопентози – у вигляді червоно-бурих плям [90].

В результаті дослідження у вільному стані в коренях ехінацеї пурпурової були виявлені D-глюкоза, D-фруктоза; в гідролізаті полісахаридного комплексу – D-глюкоза, D-фруктоза, D-галактоза, D-рамноза, D-ксилоза [38].