14.3. Патогенные микобактерии

14.3.1. Микобактерии туберкулеза

Туберкулез известен с глубокой древности. Легочные формы туберкулеза описаны еще Гипократом, Галеном, Авиценной. В древнем Китае и Индии были отмечены классические симптомы заболевания легких у людей, которые страдали чахоткой.

Возбудитель заболевания открыт в 1882 г. Р. Кохом.

В 60-80 г.г. XX века были достигнуты значительные успехи в борьбе с туберкулезом. Этому способствовали регулярное обследование населения флюорографическим методом и методом туберкулинодиагностики, обязательная вакцинация БЦЖ новорожденных, назначение эффективных противотуберкулезных препаратов, проведение полных курсов лечения болезни с контролем излеченности, выполнение химиопрофилактики людям с повышенным риском заболевания.

С начала 90-х г.г. XX века эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в мире существенно ухудшилась. Отмечается повсеместный рост заболеваемости с появлением большого числа полирезистентных штаммов микобактерий. Отсюда туберкулез был отнесен к так называемым «возвращающимся инфекциям». Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет туберкулезную инфекцию как глобальную угрозу.

Кроме возбудителей туберкулеза, важную роль в патологии стали играть другие микобактерии. Они являются причиной тяжелых оппортунистических инфекций у лиц с иммунодефицитами, особенно у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Классификация

Микобактерии относятся к порядку Actinomycetales, cемейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterium. К настоящему времени среди них выделяют более 130 видов и подвидов.

По роли в патологии все представители рода микобактерий подразделяются на 4 группы:

I. Комплекс Mycobacterium tuberculosis включает возбудителей туберкулеза у человека и животных.

M. tuberculosis вызывает туберкулез у 85-90 % больных; M. bovis – у 10-15% больных.

M. africanum иногда выделяется у больных туберкулезом в Западной и Центральной Африке.

Остальные виды возбудителей, входящих в этот комплекс (M. canetti, M. caprae и некоторые другие) весьма редко вызывают заболевания у человека. К этой же группе относится вакцинный штамм M. bovis BCG.

II. Возбудители микобактериозов – более 60 видов, которые выделены из организма людей, теплокровных и холоднокровных животных. У человека вызывают оппортунистические инфекции. Наиболее часто встречающиеся возбудители микобактериозов –кислоустойчивые бактерии M. avium-intracellulare, M. kansasii M. ulcerans и др.

III. Возбудитель проказы – М. leprae.

IV. Кислотоустойчивые сапрофиты, типичным представителем которых является M. smegmatis.

Морфология

Выражен полиморфизм, встречаются палочковидные, ветвящиеся, нитевидные, фильтрующиеся L-формы. Спор, жгутиков, капсул не имеют, но есть оболочка, напоминающая микрокапсулу. Кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы, реже встречаются кислотоподатливые формы. Это связано с высоким содержанием липидов, фосфатидов и восков в клеточных стенках (до 60%), поэтому бактерии плохо воспринимают анилиновые красители и обычные способы окраски.

Относятся к грамположительным, хотя по Граму их обычно не окрашивают. Используют методику выявления кислотоустойчивых бактерий – окраску по Циль-Нильсену в красный цвет. Более чувствительным является метод люминисцентной микроскопии с окраской аурамином (яркий желтый цвет) или родамином.

Культуральные свойства

Требовательны к питательным средам и условиям культивирования. Строгие аэробы, растут медленно от 2 до 8 недель только при температуре 37⁰С. Лучшими средами являются яичные, например среда Левенштейна-Иенсена (в нее входят МПА, картофельный сок, яйца, молоко, глицерин, аспарагин, краситель малахитовый зеленый для угнетения роста посторонней микрофлоры); среда Финна (состав тот же, но вместо аспарагина – сложный солевой раствор). Для глубинного посева применяют цитратную кровь.

Вирулентны в R-форме. На жидких средах дают рост в виде морщинистой пленки. На плотных средах образуют сухие, кремовые, бородавчатые колонии. Характер роста связан с выраженной гидрофобностью за счет большого количества липидов в клеточной стенке.

Биохимические свойства

Микобактерии туберкулеза ферментируют многие углеводы и спирты, обладают протеолитической активностью. Имеют ряд ферментов: термолабильную каталазу-пероксидазу, супероксиддисмутазу, уреазу, фосфатазу, лецитиназу.

Антигенные свойства

Антигены микобактерий включают белковые, полисахаридные и липидные компоненты. Преобладающие липидные фракции обладают умеренной антигенностью, однако в комплексе с белками способны вызывать активный иммунный ответ. Ведущими в иммунитете к возбудителю являются клеточно-опосредованные реакции (ГЧЗТ).

В 1890 г. Р. Кох получил туберкулин – фильтрат культуры возбудителя, содержащий смесь его антигенов. В настоящее время туберкулин представляет собой препарат из высокоочищенных белковых фракций возбудителя, который используется для иммунодиагностики туберкулеза.

Резистентность

Микобактерии туберкулеза проявляют выраженную устойчивость в окружающей среде. В пыли и высушенной мокроте они сохраняются несколько месяцев, в воде – больше года, в почве – до 6 месяцев.

Возбудители туберкулеза погибают при температуре 100⁰С. Пастеризация инактивирует M. bovis в молочных продуктах. Микобактерии чувствительны к солнечному свету и УФ-облучению.

Вследствие высокой химической устойчивости дезинфицирующие растворы действуют на них медленно; обработка основными дезинфектантами требует более длительной экспозиции.

Микобактерии туберкулеза природно устойчивы к большинству антибиотиков.

Факторы вирулентности

Возбудитель не обладает классическими факторами вирулентности, такими как экзо- или эндотоксины.

Токсические компоненты микобактерий связаны с микробными клетками и обычно высвобождаются при их разрушении.

Микобактерии туберкулеза имеют корд-фактор –гликолипид, который является фактором адгезии, поражает митохондрии клеток, нарушает тканевое дыхание. При культивировании вызывает склеивание вирулентных особей в виде кос, тяжей.

Туберкулопротеины обладают аллергизирующим действием, вызывают развитие ГЧЗТ.

Гликолипиды наружного слоя клеточной стенки (микозиды) и маннозные рецепторы микобактерий способствуют адгезии бактерий и подавляют фагоцитоз.

Ферменты каталаза и супероксиддисмутаза препятствуют дыхательному взрыву в макрофагах.

Туберкулостеариновая, фтионовая, миколевая и другие жирные кислоты оказывают токсическое действие на ткани.

Белки-сидерофоры обеспечивают микобактерий ионами железа, что способствует их выживанию в макрофагах.

Мутации в генах, кодирующих ферменты каталазу и РНК-полимеразу, обеспечивают устойчивость микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам – изониазиду и рифампицину.

Патогенез и характеристика заболевания

Туберкулез (от латинского слова tuberculum – бугорок) – хроническое системное инфекционное заболевание, поражающее человека, животных, птиц.

В начале XXI века туберкулез вновь стал ведущей инфекционной патологией во всем мире. Ежегодно регистрируется более 9 млн новых случаев туберкулеза, а около 2 млн больных в год погибают от этого заболевания, что уступает лишь ВИЧ-инфекции.

В отсутствие лечения вероятность летального исхода от туберкулеза и его осложнений в течение жизни больного превышает 50%.

Распространенность инфекции гораздо выше. Считается, что около 2 млрд человек в мире инфицированы микобактериями туберкулеза. Тем не менее, для человека характерна высокая естественная резистентность к возбудителю. Лишь у 5-10% инфицированных появляются клинические признаки болезни.

Отсюда туберкулез во многом представляет собой социальное заболевание. Развитию болезни способствуют низкий уровень медико-санитарной помощи и санитарной культуры, недостаточный уровень питания, жилищных условий, скученность населения при совместном проживании, усиление миграции из эндемичных по туберкулезу регионов.

Резкое обострение ситуации также связано с продолжающейся пандемией ВИЧ-инфекции. Совместная инфекция ВИЧ и M. tuberculosis приводит к ускоренной гибели больных. Это происходит как из-за подавления реакций клеточного иммунитета с тяжелым течением туберкулеза, так и вследствие усиленной репликации ВИЧ.

Наконец, наибольшую угрозу представляет появление и неуклонное распространение штаммов возбудителей, устойчивых к основным противотуберкулезным средствам. Вероятность успешного лечения таких больных снижается.

Различают множественную (МЛУ) и широкую лекарственную устойчивость (ШЛУ) микобактерий к химиопрепаратам.

При МЛУ возбудитель устойчив к ведущим противотуберкулезным препаратам I ряда – изониазиду и рифампицину.

При ШЛУ возбудитель дополнительно устойчив к трем и более препаратам II ряда, включая фторхинолоны.

Скорость распространения устойчивых штаммов среди населения является более высокой. Ежегодно возникает до 500 тыс новых случаев МЛУ-туберкулеза. В определенных регионах (Южная Африка, отдельные провинции КНР, Индии и области Российской Федерации, страны Восточной Европы) частота МЛУ-туберкулеза превышает 10-20%.

В Республике Беларусь заболеваемость туберкулезом составляет около 44 случаев на 100 тыс населения, что ниже чем в Российской Федерации и Украине. Однако постепенно нарастает доля лиц с лекарственно устойчивым туберкулезом.

Источники инфекции при туберкулезе – больные люди и больные животные (крупный рогатый скот), выделяющие микобактерии.

Пути передачи – чаще воздушно-капельный, реже контактный и алиментарный (через молоко больных животных). Заражению способствует постоянный контакт, проживание с больным туберкулезом.

Наиболее часто встречается туберкулез легких (до 75% случаев), реже – внелегочный туберкулез (мочеполовой системы, костей, лимфоузлов, кишечника, туберкулезный менингит).

Ингалированные бактерии фагоцитируются альвеолярными макрофагами и дендритными клетками и транспортируются в регионарные лимфоузлы. Фагоцитоз носит незавершенный характер, так как микобактерии блокируют фаголизосомальное слияние. Кроме того, они могут вызывать апоптоз макрофагов.

Гликолипиды-микозиды усиливают токсическое действие корд-фактора, поражая мембраны митохондрий. Корд-фактор тормозит активность полиморфноядерных фагоцитов.

Иммунное воспаление является ведущим фактором в патогенезе туберкулезной инфекции.

У входных ворот легких в ацинусах развивается первичный аффект, идущие от него лимфатические сосуды и регионарные лимфоузлы воспаляются, формируется первичный туберкулезный комплекс. В ацинусе возникает гранулема в виде бугорка. Этому способствует накопление в очаге молочной кислоты, низкое значение рН, высокая концентрация углекислого газа. В гранулеме накапливается большое количество лимфоидных, плазматических клеток и фибробластов. В центре гранулемы возникают участки творожистого некроза из-за гибели клеток и действия тканевых протеаз. Здесь располагаются возбудители, вокруг них находятся эпителиоидные и гигантские клетки; развивается ГЧЗТ.

Высокая сенсибилизация организма приводит к токсико-аллергическим реакциям. Клинически этот период сопровождается кашлем, кровохарканьем, снижением массы тела, потливостью, субфебрилитетом или лихорадкой.

У лиц с иммунодефицитом наблюдаются тяжелые формы туберкулеза – казеозная пневмония с распадом легочной ткани и диссеминированный (милиарный) туберкулез – в органах и тканях развиваются множественные мелкие гранулемы. Данные формы характеризуются высокой летальностью.

Очаговый туберкулез поражает отдельные органы (чаще всего легкие); генерализованные формы инфекции (милиарный туберкулез, туберкулезный менингит, внелегочный туберкулез) протекают наиболее тяжело.

При благоприятном течении инфекции клеточные иммунные реакции останавливают размножение возбудителя. Очаг воспаления уменьшается, подвергается кальцификации и фиброзу, при этом формируются кальцинаты (очаги Гона). Клинические проявления болезни затихают.

Часть бактерий переходит в латентное состояние, и они долгое время персистируют внутриклеточно в макрофагах и клетках эпителия.

При ослабленном клеточном иммунитете создаются условиия для дальнейшего размножения микобактерий. Подавляется HLA-зависимое представление антигенов, тормозится пролиферация Т-лимфоцитов.

Реактивация возбудителей ведет к обострению инфекционного процесса. Возникает вторичный туберкулез. Для него характерно развитие хронического воспаления с чередованием очагов распада и фиброза. Без лечения заболевание неуклонно прогрессирует с развитием осложнений (легочного кровотечения, дыхательной недостаточности), что значительно ухудшает прогноз.

Иммунитет

При туберкулезе развивается нестерильный иммунитет, преимущественно клеточный. Основную роль играют макрофаги и дендритные клетки. Имеют значение Т-лимфоциты и их медиаторы, усиливающие фагоцитоз (в первую очередь – γ-интерферон). Антитела и другие компоненты гуморального иммунитета играют вспомогательную роль в элиминации возбудителя.

Лабораторная диагностика

Материалом для исследования служат мокрота, моча, ликвор, пунктат лимфоузла, биоптаты тканей.

Бактериоскопический метод. Окрашивают мазки по Циль-Нильсену, выявляют мелкие красные палочки. При окраске флюоресцентными красителями (аурамином, родамином) микобактерии дают желто-белое свечение в люминесцентном микроскопе.

При малом количестве возбудителя используют методы обогащения.

Гомогенизация – материал обрабатывают щелочью, фибрин при этом растворяется, а возбудитель высвобождается. Из осадка после центрифугирования готовят мазки.

Флотация – гомогенизированную мокроту обрабатывают ксилолом или бензолом и тщательно встряхивают. Возбудитель всплывает в силу гидрофобности вместе с пеной. Из нее готовят мазок и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Бактериологический метод. Материал обрабатывают серной кислотой и засевают на яичные среды.

Для идентификации M. tuberculosis определяют основные свойства возбудителя.

Оценивают характер роста – обнаруживают сухие, бородавчатые, кремовые колонии (R-форма); длительность роста составляет 20-60 дней. Для микобактерий туберкулеза характерен рост только при температуре 37-38⁰С; они не растут на простых средах и средах с салицилатами;

Выявляют наличие корд-фактора. Его определяют по методу Прайса – на стекло наносят исследуемый материал, обрабатывают серной кислотой для уничтожения кислоточувствительной флоры и погружают препараты в цитратную кровь. Через 3-4 дня препараты извлекают, окрашивают по Циль-Нильсену, при микроскопии видны «косы» палочек, при отсутствии корд-фактора возбудитель располагается аморфно.

У микобактерий туберкулеза наблюдается положительный ниациновый тест (среда с хлорамином В желтеет при накоплении никотиновой кислоты). Также они обладают термолабильной каталазой; восстанавливают нитраты в нитриты; выделяют уреазу; к микобактериям туберкулеза чувствительны морские свинки.

Для внутривидовой дифференциации используют фаготипирование штаммов микобактериофагами.

Mycobacterium bovis вирулентны в S-форме; колонии кремовые, гладкие; ниациновый тест отрицательный; рост до 40 дней; каталаза термолабильная; выделяют уреазу; не восстанавливают нитраты; рост только при температуре 37-40⁰С.

Mycobacterum africanum – рост 31-40 дней; ниациновый тест положительный; вирулентны в S-форме; каталаза термолабильна; не восстанавливают нитраты; выделяют уреазу. Остальные свойства как у M. tuberculosis.

Микобактерии туберкулеза необходимо дифференцировать от атипичных кислотоустойчивых бактерий, вызывающих микобактериозы.

Атипичные кислотоустойчивые бактерии имеют оранжевый пигмент, вирулентны в S-форме, растут на средах с салицилатами, имеют термостабильную каталазу, рост через 10-20 дней при температуре 22-45⁰С, нет корд-фактора.

Кислотоустойчивые сапрофиты (M. smegmatis и др.) в отличие от предыдущих возбудителей, растут на простых средах, длительность роста 3-4 дня, имеют S-форму, оранжевый пигмент, нет признаков болезнетворности, чувствительны к спирту.

Дифференциальные признаки микобактерий представлены в таблице.

Таблица

Дифференциация микобактерий

Свойства	M.tuberculosis	Атипичные микобактерии	Сапрофиты
Характеристика колоний	R-форма, сухие, морщинистые, бородавчатые, «цветная капуста»	S-, R-формы, гомогенные	S –форма, сочные
Пигментообразование	Цвета «слоновой кости»	Желтые, оранжевые	Беспигментные, желтые, оранжевые
Оптимальная температура роста	370С	20-420С	20-450С
Скорость роста на средах	Медленный (2-6 недель)	Медленный (3-4 недели)	Быстрый (2-3 дня)
Ниациновый тест	+	-	-
Каталазная активность: термостабильная каталаза; термолабильная каталаза	+ - +	+ + -	+ + -
Наличие корд-фактора	+	-	-

Для ускоренного культивирования микобактерий применяют автоматизированную систему BACTEC с радиометрическим определением роста возбудителей. Система включает жидкую питательную среду, содержащую меченую изотопом [¹⁴C] пальмитиновую кислоту. При своем размножении микобактерии утилизируют пальмитиновую кислоту с образованием радиоактивного СО₂. Его обнаружение указывает на присутствие возбудителей. Сроки детекции бактерий в этой системе составляют 7-8 дней.

Биопроба применяется при стертых формах. Морским свинкам внутрикожно втирают исследуемый материал. Через 10-14 дней появляется долго не заживающая язва, и реакция Манту у них становится положительной.

Для определения инфицирования, обострения заболевания или оценки специфического иммунитета применяют кожно-аллергическую пробу – реакцию Манту с туберкулином.

Внутрикожно во внутреннюю поверхность предплечья вводят 2 единицы туберкулина PPD (PPD – очищенный белковый дериват). Если организм инфицирован, то через 24-48-72 часа наблюдается инфильтрация и гиперемия, т.е. развивается ГЧЗТ. У больных туберкулезом диаметр инфильтрата на 6 мм и более превышает показатель вакцинированных лиц.

У больных ВИЧ-инфекцией с туберкулезом проба Манту может быть отрицательной.

В последнее время для оценки ГЧЗТ при туберкулезе начинают применяться иммунологические клеточные тесты, проводимые in vitro. В их основе лежит увеличение продукции Т-лимфоцитами больных γ-интерферона после взаимодействия иммунных клеток со специфическими АГ микобактерий.

Для эпидемиологической характеристики возбудителей и определения его антибиотикоустойчивости используют методы генодиагностики, включая различные варианты ПЦР.

Серологический метод носит вспомогательный характер; для выявления антител используют РПГА, ИФА.

Лечение

Возбудитель обладает чувствительностью лишь к ограниченному кругу химиотерапевтических средств.

Назначают препараты первого ряда – изониазид (тубазид), рифампицин, пиразинамид, стрептомицин, этамбутол. Альтернативные средства включают фторхинолоны, канамицин, пара-аминосалициловая кислота (ПАСК), этионамид, циклосерин, капреомицин.

С декабря 1996 г. в Республике Беларусь внедрена в практику международная методика химиотерапии больных туберкулезом в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Она получила название краткосрочной химиотерапии под непосредственным наблюдением (англ. аббревиатура DОТS).

Эта методика предполагает обязательное использование не менее 4 химиопрепаратов на начальном этапе лечения, а при множественной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза – до 5-6 препаратов. Используют основные противотуберкулезные средства – изониазид (тубазид), рифампицин, пиразинамид, стрептомицин или этамбутол. На втором этапе (до 2-6 месяцев) продолжают химиотерапию изониазидом и рифампицином в оптимальных дозах.

Проведение химиотерапии осуществляется с учетом чувствительности микобактерий туберкулеза к препаратам. При инфекции МЛУ-штаммами лечение продолжается до 1,5-2 лет.

Профилактика

Специфическая профилактика проводится живой аттенуированной вакциной БЦЖ на 3-5 день после рождения с последующей ревакцинацией при отрицательной реакции Манту. У детей вакцинация предупреждает более 80% случаев туберкулезного менингита. У взрослых эффективность вакцинации сильно варьирует в зависимости от формы туберкулеза и состояния органзима и в среднем составляет около 50%.

Вакцина БЦЖ получена А. Кальметтом и и Ш. Гереном из M. bovis путем многократных посевов на голодные картофельные среды с желчью, в результате был получен авирулентный штамм, сохранивший высокую иммуногенность.

Актуальной остается разработка новых вакцин. Некоторые из них на основе пептидных АГ микобактерий в настоящее время проходят клинические испытания.

Неспецифическая профилактика: проводится изоляция и лечение больных до полного прекращения выделения возбудителя. Дезинфекция в очаге 5% фенолом, хлорамином, хлорной известью.