Раздел II. Частная микробиология a. Частная бактериология

IX. Грамположительные кокки

9.1 Семейство Staphylococcaceae

Впервые стафилококки обнаружены Р. Кохом в 1878 г., выделены Л. Пастером из гноя в 1880 г. и изучены Ф. Розенбахом в 1884 г.

Среди грамположительных кокков имеется два семейства, включающие представителей, патогенных для человека: Staphylococcaceae, Streptococcaceae.

В эти семейства входят патогенные, условно-патогенные и сапрофитические кокки, объединенные общими морфологическими, генетическими и биологическими свойствами. Кроме того, их объединяет способность вызывать гнойно-воспалительные процессы.

Классификация

Семейство Staphylococcaceae включает роды Staphylococcus, Gemella.

Основными признаками дифференцировки их представителей является наличие или отсутствие цитохромов и каталазная активность.

Общие свойства этого семейства: по морфологии представляют собой кокки, делящиеся, имеют положительный каталазный тест.

Род Staphylococcus включает более 40 видов, из них 3 основных – S. aureus, S. еpidermidis, S. saprophyticus – наиболее часто обнаруживаются у человека.

S. aureus (золотистый стафилококк) является ведущим патогенным микроорганизмом, вызывая гнойно-воспалительные процессы в различных органах и тканях. S. еpidermidis, а также S. hominis и S. haemolyticus вызывают инфекции, ассоциированные с катетерами, шунтами, протезами, преимущественно у лиц со сниженным иммунитетом. S. saprophyticus может быть причиной инфекций мочевыводящих путей, чаще всего возникающих у женщин молодого возраста.

Остальные виды стафилококков (S. schleifeiri, S.  warneri, S. lugdunensis, S. capitis и мн. др.) не играют существенной роли в патологии человека.

9.1.1. Род Staphylococcus

Морфология

Стафилококки имеют шаровидную форму, располагаются в виде гроздей винограда. Грамположительны.

В мазке из патологического материала они находятся на разных стадиях деления: одиночные, парные, цепочки, но чаще в виде гроздей; неподвижны, спор не образуют. Некоторые имеют капсулу, изменяются под действием антибиотиков и превращаются из типичных S-форм в L-формы, G-формы – карликовые, в фильтрующиеся формы.

Культуральные свойства

Температурный диапазон роста от 4°С до 43°С, pH 7,2-7,4; Г+Ц – 30-39 моль%. Неприхотливы к питательным средам. Колонии S.aureus круглые, гладкие, имеют пигмент золотистого цвета; S. epidermidis образует более мелкие белые колонии; S. saprophyticus – крупные, эмалевые, белого, реже лимонно-желтого цвета. Признак пигментообразования лучше проявляется на МЖСА (молочно-желточно-солевом агаре) или ЖСА – элективных и дифференциально-диагностических средах. Повышенная концентрация NaCl подавляет рост других микробов; в среде с яичным желтком выявляется фермент лецитиназа – вокруг колоний появляются радужные венчики помутнения. Добавление молока стимулирует образование пигмента. На кровяном агаре выявляют гемолитическую активность, характерную для золотистого стафилококка.

Стафилококки хорошо растут на средах с добавлением 40% желчи. В МПБ дают диффузное помутнение всей питательной среды.

Биохимические свойства

Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы с окислительным и бродильным типом метаболизма, каталазоположительны, содержат цитохромы.

При посеве в столбик желатина разжижают его в виде воронки, свертывают молоко, белок расщепляют до H₂S, восстанавливают нитраты в нитриты, индола не образуют. Биохимически активны, расщепляют многие углеводы до кислоты. Стафилококки способны сбраживать глюкозу в анаэробных условиях, что отличает их от микрококков. Продукция фермента плазмокоагулазы и термостабильной ДНКазы характерна только для вида S. aureus. Отсюда другие виды стафилококков часто обозначаются как «коагулазоотрицательные стафилококки (КОС)».

Многие стафилококки синтезируют бактериоцины.

Антигенная структура

Антигенными свойствами обладают вещества клеточной стенки: пептидогликан, тейхоевые кислоты, белок А, типоспецифические агглютиногены, капсула.

Пептидогликан имеет часть общих антигенов с пептидогликанами стрептококков. Видоспецифическими антигенами являются тейхоевые кислоты: для S. aureus – рибитолтейхоевые, для S. epidermidis – глицеринтейхоевые, S. saprophyticus имеет оба типа кислот.

Факторы патогенности

Факторами патогенности стафилококка служат токсины, микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты агрессии.

Золотистый стафилококк способен продуцировать не менее 4 типов гемолизинов, обладающих различным механизмом действия.

Альфа-токсин (a-гемолизин) является одним из основных токсинов S. aureus. Он относится к порообразующим токсинам и проявляет цитолитические свойства в отношении различных типов клеток (эритроцитов, моноцитов, лимфоцитов, тромбоцитов и эндотелиоцитов). Протомеры токсина связываются с цитоплазматической мембраной, где взаимодействуют с фосфатидилхолином или холестерином. Далее они олигомеризуются с образованием трансмембранного канала (поры). При этом происходит вход ионов натрия и кальция в клетку наряду с быстрым выходом из нее ионов калия. Это приводит к набуханию и гибели клеток, имеющих ядро, а также к осмотическому лизису эритроцитов. Кроме того, повышение внутриклеточного кальция стимулирует процессы апоптоза пораженных клеток.

Бета-гемолизин представляет собой фермент сфингомиелиназу. Он разрушает эритроциты человека, проявляет свойства холодовых гемолизинов (активен при низких температурах).

Гамма-лизин проявляет умеренную цитотоксическую активность в отношении эритроцитов человека, а также нейтрофилов и макрофагов. Механизм его действия до конца не выяснен.

Дельта-гемолизин проявляет детергентные свойства, разрушая различные типы клеток.

Лейкоцидин схож по механизму действия с гемолизинами; оказывает цитотоксическое действие на полиморфноядерные нейтрофилы, ингибирует всасывание воды и активирует образование цАМФ, что приводит к стафилококковым диареям.

Большая группа токсинов золотистого стафилококка относится к суперантигенам.

Среди них важную роль играют эксфолиатины А и В. Они вызывают синдром «ошпаренной кожи»: образуются большие очаги эритемы на коже и пузыри. Эксфолиатины проявляют протеолитическую активность, разрушая межклеточные контакты (десмосомы). Эти токсины различаются по антигенным свойствам и отношению к температуре: А – термостабилен, контролируется хромосомным геном, В – термолабилен, зависит от плазмидного гена.

Токсин синдрома токсического шока (TSST) вызывает синдром токсического шока за счет резкой стимуляции выделения провоспалительных цитокинов, включая ФНО-a, ИЛ 1, ИЛ 12 и др. Синдром встречается у женщин, использующих сорбирующие тампоны в период менструации, в которых могут размножаться стафилококки. Клинически проявляется температурой тела выше 38,8^оС, рвотой, диареей, скарлатиноподобной сыпью, снижением артериального давления.

S. aureus продуцирует не менее 8 термостабильных энтеротоксинов (A-I), которые также являются суперантигенами. Они ответственны за развитие пищевых интоксикаций. Тип А обладает рвотным действием, тип В – повреждает слизистую желудочно-кишечного тракта. Типы В и С могут приводить к развитию синдрома токсического шока.

Компоненты клеточной стенки также стимулируют развитие воспалительных реакций, усиливают синтез интерлейкина I макрофагами, активируют систему комплемента и являются мощными хемоаттрактантами для нейтрофилов.

Капсула защищает бактерии от комплемент-зависимого поглощения полиморфноядерными фагоцитами, способствует адгезии микроорганизмов и их распространению в тканях.

Белок А золотистого стафилококка связывается с Fc-фрагментом IgG и блокирует его.

Тейхоевые кислоты активируют систему комплемента по альтернативному пути, а также свертывающую и калликреин-кининовую системы, облегчают адгезию к эпителиальным клеткам, связывают фибронектин.

Золотистый стафилококк продуцирует большое количество ферментов агрессии.

Каталаза защищает кокки от действия О₂-зависимых микробицидных механизмов фагоцитов.

Лецитиназа (лецитовителлаза) разрушает лецитин, входящий в состав клеточных мембран, вызывает лейкопению.

Плазмокоагулаза активирует протромбин в органах и тканях, что приводит к образованию фибрина и гиперкоагуляции; препятствует фагоцитозу.

С другой стороны, фермент стафилокиназа (или фибринолизин), растворяя молекулы фибрина, способствует генерализации патологического процесса.

Гиалуронидаза стимулирует инвазию стафилококков, разрушая гиалуроновую кислоту соединительной ткани.

Аналогичным образом фермент ДНКаза гидролизует высокополимерную ДНК погибших лейкоцитов в гное, что уменьшает вязкость тканевого содержимого и способствует распространению инфекции.

Значительное количество стафилококков проявляют выраженную антибиотикорезистентность.

Многочисленные b-лактамазы разрушают молекулы пенициллинов, цефалоспоринов. У стафилококков они обычно кодируются плазмидами и транспозонами.

Однако наибольшую угрозу для здравоохранения в настоящее время представляют метициллин-резистентные Staphylococcus aureus (англ. аббревиатура MRSA), штаммы которых отличаются устойчивостью ко всем b-лактамным антибиотикам. Распространенность MRSA среди госпитальных штаммов данных бактерий составляет 30% и более. Подобными свойствами могут обладать и коагулазоотрицательные стафилококки.

Такие возбудители имеют особый пенициллин-связывающий белок ПСБ2а, отличающийся низкой аффинностью к b-лактамным антибиотикам. Этот белок кодируется дополнительным хромосомным геном mecA.

Резистентность

Стафилококки хорошо переносят высушивание, пигмент хорошо защищает их от солнечных лучей. При комнатной температуре они остаются жизнеспособными на предметах ухода за больными в течение 50 дней, при температуре 70-80° погибают через 20-30 минут. 1% раствор хлорамина убивает их через 2-5 минут, дезинфицирующие средства – за 15 минут (3% раствор фенола). Высокая чувствительность к бриллиантовой зелени, нитрофуранам позволяет широко применять эти препараты для лечения поверхностных гнойно-воспалительных заболеваний.

Общая характеристика заболеваний

Стафилококки колонизируют слизистые оболочки ротовой полости, носа, кишечника и кожу сразу после рождения. Они являются представителями нормальной микрофлоры тела человека.

Стафилококки присутствуют в окружающей среде повсеместно. Этому способствует длительность их выживания на различных предметах. В связи с широким распространением данных бактерий необходимо дифференцировать их виды, так как степень болезнетворной активности их различна.

S. aureus вызывает (рис. 14):

1. Местные гнойно-воспалительные процессы: эксфолиативный дерматит новорожденных (синдром «ошпаренной кожи», пузырчатка), пиодермии, фурункулы, карбункулы, гидрадениты, абсцессы, флегмоны, маститы, остеомиелиты, периоститы, травматические и послеоперационные нагноения ран.

2. Заболевания внутренних органов: бронхиты, пневмонии, ангины, фарингиты, отиты, менингиты, синуситы, циститы, пиелонефриты, холециститы, эндометриты.

3. Пищевые токсикоинфекции.

4. Септические процессы (септицемию и септикопиемию, синдром токсического шока).

При этом S. aureus принимает активное участие в смешанных инфекциях.

S.epidermidis и другие КОС менее активны в патологии. Как уже упоминалось, S. еpidermidis может приводить к инфекциям у лиц с установленными катетерами и шунтами, имплантированными клапанами и протезами. Кроме того, он может быть причиной гнойно-воспалительных процессов у лиц пожилого возраста, конъюнктивитов новорожденных, послеоперационных эндокардитов.

S.saprophyticus при ослаблении иммунитета может вызывать воспалительные процессы, послеоперационные нагноения ран. Также он является возбудителем инфекций мочевыводящих путей у женщин молодого возраста.

У этого вида стафилококка есть олигосахаридные рецепторы, способствующие прикреплению его к эпителию мочевыводящих путей.

В развитии стафилококковой инфекции большую роль играют инвазионные и токсигенные свойства микроорганизмов, состояние иммунной системы макроорганизма (иммунодефициты). Возбудитель проникает через поврежденную кожу и слизистые оболочки. В стационаре этому способствуют различные оперативные вмешательства, катеризация кровеносных сосудов, использование протезов сосудов, использование искусственных клапанов, использование различной диагностической аппаратуры.

Предрасполагающими факторами для развития эндогенной стафилококковой инфекции являются болезни, угнетающие иммунитет, диабет, почечная и печеночная недостаточность, прием иммунодепрессантов, цитостатических препаратов.

Иммунитет

Иммунитет зависит от уровня антитоксических и антимикробных антител. Новорожденные защищены материнскими IgG-антителами, полученными через плаценту.

Здоровые взрослые люди устойчивы к стафилококкам, что объясняется защитными механизмами и наличием специфических АТ. В иммунитете имеют значение все виды антител: антимикробные, антитоксические, антиферментные, степень их защиты определяется и титром АТ, и местом их действия. Антимикробные АТ на пептидогликан, протеин А способствуют фагоцитозу, препятствуют связыванию опсонинов, антитоксины нейтрализуют a-токсин, антиферментные АТ – соответствующие ферменты; большую роль играют секреторные IgА, обеспечивающие местный иммунитет слизистых оболочек; АТ к тейхоевым кислотам определяются при остеомиелитах, сепсисе, эндокардитах.

Лабораторная диагностика

Материал для исследования – гной, кровь, мокрота, моча.

Бактериоскопический метод имеет ориентировочное значение. Выявляют грамположительные кокки, расположенные в виде гроздей, что позволяет выбрать необходимые питательные среды.

Бактериологический метод – выделение чистой культуры и ее идентификация. Материал засевают на МЖСА или ЖСА и кровяной агар. Проводят учет лецитиназы, пигмента, гемолиза.

C колониями бактерий, выросших на МЖСА, проводят каталазный тест. Это позволяет отдифференцировать семейство Staphylococcaceae от семейства Streptococcaeae; так у стафилококков каталаза имеется, а у стрептококков отсутствует.

Устанавливают принадлежность бактерий к роду Staphylococcus. Стафилококки образуют пигмент, являются факультативными анаэробами, а микрококки – облигатные аэробы. Поэтому стафилококки способны расти и ферментировать глюкозу в анаэробных условиях (отмечается изменение цвета в столбике среды под слоем вазелинового масла). Также стафилококки способны окислять глицерин.

Установив принадлежность к роду Staphyloccocus, проводят видовую идентификацию стафилококков. Ведущий тест S.aureus – продукция плазмокоагулазы. Проводят посев культуры в цитратную плазму крови кролика. Отмечается коагуляция плазмы через 2-18 часов. При положительной реакции плазмокоагуляции, лецитиназной, гемолитической активности, золотистого пигмента штамм может быть отнесен к виду S.aureus.

При отрицательной реакции плазмокоагуляции ставят дополнительные тесты на наличие ДНКазы, ферментацию манита в анаэробных условиях, чувствительность к новобиоцину, определяют фосфатазу.

Для S. epidermidis характерны следующие тесты: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, отсутствие окисления маннита; для S. saprophyticus – противоположные свойства.

Данные биохимической дифференциации стафилококков приведены в таблицах.

Таблица

Биохимическая идентификация рода Staphyloccocus

Микроорганизм	Плазмо-коагулаза	Ферментация маннита		Гемолиз	Летитиназа	Лмзоцимная активность	Определение ДНКазы
		аэробно	анаэробно
S. aureus	+	+	+	+	+	+	+
S.epidermidis	-	+/-	-	+/-	-	-	-
S.saprophyticus	-	+/-	-	-	-	-	-

Таблица

Дифференциация стафилококков и микрококков

Свойства	Стафилококки	Микрококки
Размеры клеток	До 1 мкм	0,5-2 мкм
Окраска колоний	От золотистого до белого	От белого до розово-красного, оранжевого
Ферментация глюкозы в анаэробных условиях	+	+
Гемолиз	+	-
Окисление глицерина	+	-

Таблица

Дифференциальные признаки S.epidermidis и S.saprophyticus

Группа	Устойчивость к новобицину	Фосфатаза	Окисление маннита
S.epidermidis	-	+	-
S.saprophyticus	+	-	+

Далее проводят определение чувствительности к антибиотикам. Для выявления метициллин-резистентных стафилококков выполняют диско-диффузионный метод с антибиотиками оксациллином или цефокситином.

Более предпочтительным способом является идентификация MRSA методом ПЦР с определением гена mec2a

С целью эпидемиологического типирования изучают плазмидный профиль S.aureus: большие 2•10⁷ Да плазмиды кодируют образование бета-лактамаз и резистентность к эритромицину. Мелкие (3•10⁶ Да) плазмиды кодируют резистентность к тетрациклинам и хлорамфениколу.

При необходимости по эпидпоказаниям осуществляют фаготипирование.

Заключение об этиологической роли стафилококков делают на основании многократного обильного выделения однотипных по свойствам и фаготипу стафилококков.

Выделенная культура считается возбудителем инфекционного процесса при наличии следующих критериев: если из закрытых очагов, выделен один вид микроорганизма в количестве 10³ и более; при открытых процессах этиологически значимыми считают культуры, численность которых более 10⁵. Лабораторный анализ непременно включает определение чувствительности выделенных бактерий к антибиотикам.

Серологическая диагностика стафилококковой инфекции в настоящее время не практически используется. Для оценки состояния антитоксического иммунитета у больных определяют уровень антитоксических антител по лизису эритроцитов крови альфа-токсином. Ранее методом ИФА определялись антитела к тейхоевым кислотам различных видов стафилококков.

Лечение

Для лечения острых стафилококковых заболеваний назначают антибиотики под контролем антибиотикограммы.

В большинстве случаев используют b-лактамные аетибиотики, устойчивые к действию b-лактамаз – оксациллин, карбенициллин, цефалоспорины. Можно использовать комбинированные препараты, содержащие ингибиторы b-лактамаз, например ампициллин в сочетании с клавулановой кислотой.

При септических процессах используют карбапенемы. Иногда вводят донорский противостафилококковый иммуноглобулин или антистафилококковую плазму.

Серьезную проблему представляет лечение стафилококковых инфекций, вызванных метициллин-резистентными штаммами S. aureus. Назначение b-лактамных антибиотиков из любых групп здесь противопоказано. Для терапии внебольничных штаммов MRSA можно использовать аминогликозиды и фторхинолоны. Для лечения госпитальных штаммов следует назначать ванкомицин или линезолид, также возможно применять комбинированный сульфаниламид триметоприм/сульфометоксазол.

Сложности для лечения представляют катетер-ассоциированные инфекции, вызванные S. epidermidis. Данный возбудитель более чем в 75% случаев образует b-лактамазы. Кроме того, он всегда создает биопленку на поверхности катетеров и имплантатов, что резко снижает проникновение антибиотиков к микробным клеткам. Это требует увеличения дозы для назначаемых антимикробных средств.

Для лечения хронических стафилококковых инфекций применяют стафилококковый анатоксин, а также аутовакцину, которые стимулируют синтез антитоксических и антимикробных антител.

В травматологии и дерматологии используют стафилопротеин – это комплексный препарат, включающий очищенный анатоксин и цитоплазменный антиген стафилококка.

Профилактика

Профилактика стафилококковых инфекций направлена на выявление носителей золотистых стафилококков, главным образом, среди персонала больниц и родовспомогательных учреждений с целью их санации. Иногда для профилактики стафилококковой инфекции вакцинируют беременных в конце беременности очищенным стафилококковым анатоксином (повышается уровень IgG-антител у новорожденных).