Клиническая_лабораторная_диагностика_2019_А_А_Кишкун_2_е_изд_

Источник KingMed.info

Рис. 6.3. Третья фаза свертывания крови - фибринообразование (схема)

В процессе образования гемостатического тромба не происходит распространения тромбообразования от места повреждения стенки сосуда по сосудистому руслу, так как этому препятствуют быстро возрастающий вслед за свертыванием антикоагулянтный потенциал крови и активация фибринолитиче-ской системы.

Сохранение крови в жидком состоянии и регуляция скоростей взаимодействия факторов во все фазы коагуляции во многом определяют наличием в кровотоке естественных веществ, обладающих антикоагулянтной активностью. Жидкое состояние крови достигается равновесием между факторами, индуцирующими свертывание крови, и факторами, препятствующими его развитию, причем последние не выделяются в отдельную функциональную систему, так как реализация их эффектов чаще всего невозможна без участия про-коагуляционных факторов. Поэтому выделение антикоагулянтов, которые препятствуют активации факторов свертывания крови и нейтрализуют их активные формы, является чисто условным.

Вещества, обладающие антикоагулянтной активностью, постоянно синтезируются в организме и с определенной скоростью выделяются в кровоток. К ним относятся АТ III, гепарин, протеины С и S, недавно открытый ингибитор тканевого пути свертывания - TFPI (ингибитор комплекса тканевой фактор VIIа-Са2+), α-2-макроглобулин, антитрипсин и др. В процессе свертывания крови, фибринолиза из факторов свертывания и других белков также образуются вещества, обладающие антикоагулянтной активностью. Антикоагулянты оказывают выраженное действие на все фазы свертывания крови, поэтому исследование их активности при нарушениях свертывания крови очень важно.

461

Источник KingMed.info

После стабилизации фибрина, вместе с форменными элементами образующего первичный красный тромб, начинаются два основных процесса посткоа-гуляционной фазы - спонтанный фибринолиз и ретракция, приводящие в итоге к формированию гемостатически полноценного окончательного тромба. В норме эти два процесса идут параллельно. Физиологический спонтанный фибринолиз и ретракция способствуют уплотнению тромба и выполнению им гемостатических функций. В этом процессе активное участие принимают плаз-миновая (фибринолитическая) система и фибриназа (фактор XIIIа). Спонтанный (естественный) фибринолиз отражает сложную реакцию между компонентами плазминовой системы организма и фибрином. Плазминовая система состоит из четырех основных компонентов: плазминогена, плазмина (фибринолизин), активаторов проферментов фибринолиза и его ингибиторов (рис. 6.4). Нарушения соотношений компонентов плазминовой системы ведет к патологической активации фибринолиза.

В клинической практике исследование системы гемостаза преследует следующие цели:

-диагностику нарушений в системе гемостаза;

-выяснение допустимости оперативного вмешательства при выявленных нарушениях в системе гемостаза;

-проведение контроля за лечением антикоагулянтами прямого и непрямого действия, а также тромболитической терапией.

462

Источник KingMed.info

Рис. 6.4. Основные механизмы функционирования фибринолитической (плазминовой) системы (схема)

6.2. ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ СВЕРТЫВАЮЩЕЙ СИСТЕМЫ КРОВИ

Нарушения в системе гемостаза могут быть врожденными и приобретенными и проявляться кровотечениями или тромбозами. В основе заболеваний могут лежать нарушения механизмов регуляции системы гемостаза: аномалии стенки сосудов, клеток крови (чаще всего тромбоцитов) и факторов плазмы. Для оценки состояния каждого из перечисленных факторов используют различные клинические и лабораторные тесты.

6.2.1. Тесты, характеризующие сосудистый компонент гемостаза

Сосуды активно участвуют в остановке кровотечения. Во многом состояние их сосудистой стенки определяет риск развития кровотечения. Некоторые заболевания (аллергические, эндокринные), а также дефицит витаминов (например, витамина ) могут вызывать дистрофические изменения в сосудистой стенке, повышая риск возникновения кровотечений. Для оценки состояния сосудов могут быть использованы некоторые пробы, которые способна выполнить медицинская сестра.

463

Источник KingMed.info

Проба щипка. Медицинская сестра собирает под ключицей кожу в складку и делает щипок. У здоровых людей никаких изменений на коже не наступает ни сразу после щипка, ни спустя 24 ч. Но, если резистентность капилляров нарушена, на месте щипка появляются петехии или кровоподтек, особенно отчетливо видимые через 24 ч.

Проба жгута. Отступив на 1,5-2 см вниз от ямки локтевой вены, очерчивают круг приблизительно 2,5 см в диаметре. На плечо накладывают манжетку тонометра и создают давление 80 мм рт.ст. Давление поддерживают строго на одном уровне в течение 5 мин. В очерченном круге подсчитывают все появившиеся петехии.

Оценка результатов исследования. У здоровых лиц петехии не образуются или их не более 10 (отрицательная проба жгута). При нарушении резистентности стенки капилляров количество петехий после проведения пробы резко возрастает.

6.2.2. Тесты, характеризующие тромбоцитарный компонент гемостаза

Для оценки тромбоцитарного компонента гемостаза подсчитывают число тромбоцитов в крови прямым методом, о чем было сказано в главе 2. Напомним, что тромбоциты нужны для осуществления нормального гемостаза. Больные с тромбоцитопенией подвержены риску кровотечения. Спонтанные кровотечения возникают, если количество тромбоцитов становится ниже 50,0×109/л. Смертельное кровотечение почти неизбежно, если количество тромбоцитов снижается до 5,0×109/л. Тромбоцитопения имеет тяжелые клинические проявления, включая меноррагии, спонтанное образование гематом, кровоточивость десен, носовые кровотечения, петехиальные подкожные кровоизлияния в виде сыпи. Повышенное количество тромбоцитов в крови - тромбоцитоз, который несет с собой риск повышения свертываемости и проявляется тромбозами. В клинических ситуациях риск тромбоза становится реальным, если количество тромбоцитов достигает значений 1000,0× 109/л и выше.

Помимо подсчета тромбоцитов, в России широко используют тест по определению длительности (времени) кровотечения и очень редко исследуются агрегационные функции тромбоцитов.

Время кровотечения определяют в тесте при проколе кожи скарификатором или иглой, фиксируя время, в течение которого кровотечение прекратится (время кровотечения по Дуке). Длительность кровотечения зависит от эластичности кровеносных сосудов и их способности к сокращению при травме, количества тромбоцитов в крови и их функциональных свойств. У здорового человека длительность кровотечения по Дуке составляет 2-3 мин.

Длительность кровотечения - скрининговый тест, основное достоинство которого состоит в том, что он позволяет одновременно качественно оценить количество тромбоцитов в крови, их адгезивные и агрегационные функции, функциональные свойства стенки кровеносных сосудов, а также выраженный дефицит плазменных факторов свертывания крови (например, факторов VIII и IX, недостаток которых является причиной гемофилии А и В).

Практическое значение имеет удлинение времени кровотечения. Оно отражает нарушение гемостаза вследствие тромбоцитопений, тромбоцитопатий (нарушения функций тромбоцитов - адгезии и агрегации), нарушения сосудистой стенки или сочетания этих факторов. Удлинение времени кровотечения при нормальном количестве тромбоцитов в крови позволяет предположить нарушение их функций. В этом и состоит основная ценность теста, так как для оценки адгезивных и агрегационных свойств тромбоцитов в лабораторных условиях необходимо сложное и дорогое оборудование (агрегометр). Когда функции тромбоцитов не нарушены, время кровотечения остается в норме даже при снижении числа тромбоцитов до 100,0× 109/л.

464

Источник KingMed.info

При количестве тромбоцитов ниже этого уровня время кровотечения постепенно увеличивается в линейном соотношении с числом тромбоцитов, что отражено на рис. 6.5.

Длительность кровотечения увеличивается при следующих состояниях: - выраженных тромбоцитопениях (см. причины снижения количества тромбоцитов в главе 2); - нарушении функций тромбоцитов - тромбоцитопатиях, которые бывают врожденными (например, синдром Бернара-Сулье) и приобретенными (при пернициозной анемии, остром и хроническом лейкозе, миеломной болезни, длительном приеме аспирина); - выраженном снижении плазменных факторов свертывания крови (например, отсутствие VIII фактора - гемофилия А, недостаток фактора IХ - гемофилия В, выраженная гипофибриногенемия);

- при нарушении резистентности стенки капилляров (например, при недостатке аскорбиновой кислоты (Витамин С♠), дефектах сокращения прекапилляров - микроангиопатиях).

Рис. 6.5. Зависимость времени кровотечения от количества тромбоцитов

Укорочение времени кровотечения диагностического значения не имеет и чаще всего бывает следствием технической ошибки при проведении теста или свидетельствует о повышенной спастической способности капилляров. Оценить склонность к тромбообразованию по данным теста длительности кровотечения невозможно.

Исследование агрегационных функций тромбоцитов. Процессы агрегации изучают с помощью агрегометра, отражающего ход агрегации графически в виде кривой; в качестве стимулятора агрегации наиболее часто используют АДФ, адреналин и коллаген.

До добавления кювету анализатора проагреганта (АДФ или любого другого) бывают случайные осцилляции кривой оптической плотности. После добавления агреганта на кривой появляются осцилляции за счет изменения формы тромбоцитов. Осцилляции уменьшаются по амплитуде, и уменьшается оптическая плотность. Тромбоциты соединяются в агрегаты, и кривая идет вверх (первичная волна). Когда подъем переходит в «плато», то происходит «реакция высвобождения», и кривая еще больше поднимается вверх (вторичная волна).

Каждый из проагрегантов имеет свои закономерности изменения кривой оптической плотности. Например, при воздействии малых доз АДФ на агрегатограмме регистрируется двойная волна агрегации. Первая фаза (первичная волна) зависит от добавленного экзогенного АДФ, а вторая фаза (вторичная волна агрегации) - за счет реакции высвобождения собственных агонистов,

465

Источник KingMed.info

содержащихся в гранулах тромбоцитов. Вводимые извне большие дозы АДФ, обычно 1×10-5М (1мкМ - 1×10-6М), приводят к слиянию первой и второй волн агрегации. Для достижения двухволновой агрегации обычно используется АДФ в концентрации 1× 10-7М.

Для использования результатов исследования агрегационных функций тромбоцитов необходимо уметь анализировать полученные агрегатограммы. При анализе агрегатограмм обращают внимание на общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная; обратимая, необратимая), разницу между оптической плотностью плазмы до начала агрегации и после достижения максимальной агрегации (характеризует интенсивность агрегации), а также уменьшение оптической плотности плазмы за первую минуту агрегации или угол наклона кривой на этапе бурной агрегации (характеризует скорость агрегации). Важно отметить, что появление двухволновой агрегации при стимуляции АДФ и адреналином в концентрациях, вызывающих в норме обратимую агрегацию (обычно 1 мкМ-5 мкМ), указывает на повышение чувствительности тромбоцитов к этим индукторам, а развитие одноволновой неполной (а часто и обратимой) агрегации при стимуляции ими в концентрациях 10 мкМ и больше - на нарушение реакции высвобождения тромбоцитов. В клинических исследованиях общепринятым считается использование АДФ в концентрациях 1×10-5М (для достижения одноволновой агрегации) и 1×10- 7М (для достижения двухволновой агрегации). На рис. 6.6 представлены различные типы агрегации тромбоцитов - норма (а - наличие 2 волн), нарушение первой волны (б) и отсутствие первой и второй волны (в).

Результаты исследования агрегационной способности тромбоцитов могут выражаться в процентах (табл. 6.2).

Таблица 6.2. Агрегации по Вайсу для аденозиндифосфата

Определение агрегации тромбоцитов с различными индукторами агрегации играет важнейшую роль в дифференциальной диагностике тромбоцитопатий (табл. 6.3).

В зависимости от функционально-морфологических характеристик тромбоцитов тромбоцитопатии делятся на определенные группы.

• Наследственные дизагрегационные тромбоцитопатии без нарушения реакции высвобождения (вторичная волна). В эту группу входят:

-тромбастения Гланцмана, для которой характерно падение АДФ-за-висимой агрегации, при нормальной ристоцетинагрегации;

-эссенциальная атромбия - при воздействии малых количеств АДФ агрегация не индуцируется, а при удвоении количества АДФ приближается к нормальной;

-аномалия Мея-Хеглига - нарушается коллагензависимая агрегация, реакция освобождения при стимуляции АДФ и ристоцетином сохранена.

466

Источник KingMed.info

Рис. 6.6. Вид агрегационных кривых: а - норма, наличие 2 волн; б - нарушение первой волны; в - отсутствие первой и второй волны

Таблица 6.3. Нарушения агрегации тромбоцитов при различных заболеваниях

Примечание: (+,-) - диагностического значения не имеет.

467

Источник KingMed.info

•Парциальные дизагрегационные тромбоцитопатии. В эту группу входят заболевания с врожденным дефектом агрегации с тем или иным агреган-том или упадком реакции высвобождения.

•Нарушение реакции высвобождения. Для этой группы заболеваний характерно отсутствие второй волны агрегации при стимуляции малым количеством АДФ и адреналина. В тяжелых случаях отсутствует АДФ и адреналин-агрегация. Коллаген-агрегация не выявляется.

•Болезни и синдромы с недостаточным пулом накопления и хранения медиаторов агрегации. К этой группе относятся заболевания, характеризующиеся неспособностью тромбоцитов накапливать и выделять серотонин, адреналин, АДФ и другие факторы кровяных пластинок. На агрегатограм-мах для этой группы больных характерно снижение всех видов агрегации и отсутствие второй волны агрегации.

При приобретенных тромбоцитопатиях отмечают снижение агрегации в ответ на введение АДФ при пернициозной анемии, остром и хроническом лейкозе, миеломной болезни. У больных с уремией при стимуляции коллагеном, адреналином, АДФ агрегация снижена. Для гипотиреоза характерно снижение агрегации при стимуляции АДФ. Ацетилсалициловая кислота, пенициллин, индометацин, хлорохин (Делагил♠), диуретики (в частности, фуросемид при применении в высоких дозах) способствуют снижению агрегации тромбоцитов, что нужно учитывать при лечении этими препаратами.

При хирургических операциях, осложненных кровотечениями, нарушения в системе сосудистотромбоцитарного гемостаза в большинстве случаев обусловлены не нарушением агрегационных и других функциональных свойств тромбоцитов, а наличием тромбоцитопении той или иной степени.

6.2.3. Тесты, используемые для оценки коагуляционного гемостаза

Наиболее часто в клинической практике коагуляционный гемостаз оценивают по данным времени свертывания крови, ПВ, АЧТВ, ТВ и фибриногена. Эти тесты называют скрининговыми.

Время свертывания крови представляет собой скрининговый тест, позволяющий наблюдать за протеканием свертывания крови (коагуляционного каскада) в пробирке. Результат теста выражается в минутах и секундах.

ПВ, АЧТВ и ТВ дают возможность оценить способность крови образовывать фибрин в результате искусственного запуска в пробирке свертывающего каскада. Во всех этих анализах измеряют время, необходимое для формирования сгустка фибрина в плазме крови, взятой у больного, после добавления того или иного реактива, который запускает свертывающий каскад. Результаты выражаются в секундах. При определении ПВ в плазму добавляют тромбопластин (фактор III) и Са2+, которые запускают внешний путь свертывания крови. Определение ПВ - тест для проверки функционального состояния внешнего и общего пути. Дефицит фактора свертывания любого из этих двух путей (VII, X и V, протромбина и фибриногена) проявляется удлинением времени формирования сгустка выше нормы. Поэтому в результате анализа ПВ будет повышено.

Аналогичным образом, добавляя активатор внутреннего пути свертывания крови к плазме пациента (коалин или элаговую кислоту или микрочастицы окиси кремния), определяют АЧТВ. Тест позволяет оценить состояние внутреннего и общего путей свертывания крови. В этом случае удлинение АЧТВ указывает на дефицит одного или более факторов внутреннего или общего путей.

468

Источник KingMed.info

При выполнении теста по определению ТВ в плазму крови пациента добавляют тромбин. Этот тест позволяет оценить функциональное состояние конечной стадии общего пути - превращения фибриногена в фибрин. Удлинение ТВ указывает на дефицит фибриногена (фактор I). Если ПВ, АЧТВ и ТВ в норме, можно утверждать, что свертывающий каскад работает нормально. Вместо последнего показателя можно непосредственно определить в плазме концентрацию фибриногена количественно.

Для определения концентрации фибриногена в плазме крови используют несколько методов.

Метод Клауса основан на добавлении избытка тромбина к разбавленной плазме (обычно в разведении 1:10), при этом скорость образования сгустка пропорциональна концентрации фибриногена. Метод Клауса используют для определения фибриногена при скрининговых обследованиях и у больных, находящихся на стандартной гепаринотерапии, так как в реактив добавляют инактиватор Гепарина♠.

Методы на основе определения свертываемого белка основаны на том, что фибриноген в стандартном объеме плазмы свертывается под действием активатора (чаще всего тромбина), а количество свернувшегося белка определяют фотометрически (по биуретовой реакции) или взвешиванием сгутска после высушивания. Усовершенствованный вариант этого подхода - измерение оптической плотности или светорассеивания до и после свертывания плазмы. Разница в оптической плотности нарастает при увеличении концентрации фибриногена в плазме.

Внастоящее время для исследования ПВ, АЧТВ, ТВ и фибриногена в лаборатории используют коагулометры - приборы, предназначенные для автоматического определения времени, которое проходит от момента внесения в измерительную кювету с исследуемой плазмой стартового реактива до начала свертывания (образования первых нитей фибрина). Полимеризация фибрина сопровождается увеличением вязкости и светорассеивания (мутности) плазмы. В зависимости от того, по какому из этих параметров определяют время свертывания, коагулометры подразделяют на механические и оптические.

Взависимости от результатов скрининговых тестов или клинических показаний может возникнуть необходимость в исследовании отдельных факторов свертывающей системы крови. Для определения большинства факторов свертывающей системы крови используют дефицитную по исследуемому фактору плазму и методику выполнения двух обычных скрининговых тестов. АЧТВ применяют для определения факторов XII, XI, IX и VIII, а протромбиновый тест - для факторов VII, X и V.

Помимо методов оценки коагуляционного гемостаза, основанных на определении времени образования нитей фибрина, в настоящее время в лабораториях используют метод на основе хромогенных субстратов. Хромогенный субстрат представляет собой р-нитроанилиды, трипептидов. Протеазы, т.е. ферменты (большинство факторов свертывания крови в активированном состоянии являются ферментами), отщепляют от хромогенного субстрата р- нитроанилин, обладающий высокой поглотительной способностью при 405 нм, что позволяет прямым методом определять большинство протеаз системы гемостаза, их кофакторов и ингибиторов. На основе хромогенных субстратов разработаны методы определения большинства компонентов свертывающей системы крови. Однако наибольшие преимущества хромогенных субстратов выявляют при исследовании показателей антикоагулянтной (АТ III) и фибринолитической систем.

6.2.3.1. Время свертывания крови

469

Источник KingMed.info

Методика выполнения теста - время свертывания крови по Сухареву. Кровь берут из пальца в чистый и сухой капилляр Панченкова. Первую каплю крови удаляют тампоном, затем в капилляр набирают столбик крови высотой 25-30 мм и переводят ее в середину капиллярной трубки. Включают секундомер и через каждые 30 с наклоняют капилляр под углом 30-45°. Кровь свободно перемещается внутри капилляра. С началом свертывания ее движение замедляется. В момент полного свертывания кровь перестает двигаться. Начало свертывания крови у здорового человека от 30 с до 2 мин, конец - от 3 до 5 мин.

Время свертывания крови является ориентировочным показателем состояния многоступенчатого коагуляционного каскада, в результате которого растворимый фибриноген переходит в нерастворимый фибрин. Данный показатель характеризует процесс свертывания в целом (оценивает состояние внутреннего, внешнего и общего путей свертывания крови) и не дает возможности выявить механизмы, ведущие к его нарушению. Вместе с тем время свертывания крови может укорачиваться только в результате ускорения образования кровяной протромбиназы, вследствие попадания в кровь пациента тромбопла-стина (фактора III). Поэтому укорочение времени свертывания крови часто обусловлено появлением в кровеносном русле тканевого тромбопластина при механических повреждениях тканей, ожогах, обширных операциях, переливании несовместимой крови, сепсиса, васкулита и др. Укорочение времени свертывания крови свидетельствует о необходимости профилактики гиперкоагуляции, которая нередко угрожает тромбозом и тромбоэмболией.

Свертывание крови существенно увеличивается вследствие врожденного или приобретенного дефицита факторов протромбинообразования (прежде всего VIII, IX и XI), при повышении в крови концентрации антикоагулянтов, а также продуктов разрушения фибриногена и фибрина.

6.2.3.2. Протромбиновое время

Протромбиновое время (ПВ) характеризует состояния внешнего и общего путей коагуляционного каскада свертывания крови. Нормальные величины ПВ для взрослых составляют 11-15 с, для новорожденных - 13-18 с.

Увеличение ПВ говорит о наклонности к гипокоагуляции и может зависеть от различных причин:

-недостаточность одного или нескольких факторов протромбинового комплекса, которая наблюдается при таких редких наследственных коагулопатиях, как гипопроконвертинемия (дефицит фактора VII) и гипопротромбинемия (дефицит фактора II); - отмечаемое иногда при амилоидозе увеличение ПВ связано с дефицитом фактора Х, который поглощается амилоидом, а при нефротическом синдроме - с дефицитом факторов VII и V, которые выделяются с мочой;

-синтез факторов протромбинового комплекса происходит в клетках печени, при заболеваниях которой количество их снижается, и ПВ в определенной степени может служить показателем функционального состояния печени; увеличение ПВ отмечается при острых гепатитах, хронических гепатитах, циррозах печени, при подострой дистрофии печени и других поражениях паренхимы печени и выступает плохим прогностическим признаком (при этом причиной увеличения ПВ может явиться и развивающееся в результате уменьшения поступления желчи в кишечник нарушение всасывания витамина К, который необходим для синтеза факторов протромбинового комплекса; такова же причина увеличения ПВ и при механической желтухе);

-энтеропатия и кишечные дисбактериозы, ведущие к недостаточности витамина К, также могут сопровождаться увеличением ПВ;

-при лечении антагонистами витамина К (антикоагулянтами непрямого действия) нарушается конечный этап синтеза факторов протромбино-вого комплекса, и ПВ удлиняется;

470