книги / Нанотехнология

привлечения особого рода внутримолекулярных движений на наноскопическом уровне, связанном с движением фрагментов вторичной, третичной и четвертичной структур. Такого рода движения могут быть рассмотрены в рамках моделей ограниченной диффузии в очень вязкой среде или бро­ уновского осциллятора с сильным затуханием. Эта модель предсказывает не только уменьшение / в и рост (ж2), но и уширение линии спектра МС, а также появление упоминаемых в п. 14.1 узкой и широкой компонент спектра. Этот эффект показан на рис. 14.21 для MetMb и Mb, так что для температур ниже или вблизи 200 К получены только узкие линии и выше 200 К наблюдаются узкая и широкая компоненты спектра. Обра­ ботка данных f a позволяет выделить три вклада (ж2)ре для атома железа

вгеме: (ж2)ре = {x2)v + (ж2)С| + (ж2)С2, где (x2)v связан с обычными твер­ дотельными колебаниями атомов, (ж2)С| с конформационными быстрыми движениями, а (ж2)С — с конформационными медленными движениями.

Необходимо отметить, что резкое возрастание величины (ж2)ре мо­ жет быть связано с движением глобулы миоглобина как целого, например за счет либрационных движений, однако движение таких больших мак­ ромолекул, как глобула белка, происходит с низкими частотами и если частота этих движений менее 107 с” 1, то они не оказывают влияния на (ж2)ре. Кроме того, как будет показано далее, подобное поведение (ж2)ре с изменением температуры наблюдается и для больших полимеров —- ДНК с молекулярным весом 106.

Интересно отметить влияние лигандов на движение атома железа

вмиоглобине. Так, на рис. 14.20 заметно возрастание (ж2)ре для MetMb

по сравнению с дезокси-Mb, начиная с области 200 К, что связано с влиянием подвижности молекулы воды в качестве шестого лиганда.

Усредненная динамика глобулы миоглобина, исследованная с по­ мощью РРМИ [22], позволяет для углов рассеяния менее 10° изучать широкомасштабные движения, на несколько порядков больше, чем для МС. Исследовалась динамика миоглобина в различных состояниях: кри­ сталлическом (содержание воды 60 %), лиофилизованном (содержание воды несколько процёнтов и 40 %) и в растворе (при концентрации белка около 70 %). На рис. 14.22 приведена температурная зависимость величины fR для разных состояний миоглобина.

Отчетливо заметно различие температурных зависимостей величины /я для лиофилизованного (сухого) и увлажненных образцов миоглоби­ на. Если сухой белок характеризуется обычной для твердых тел отно­ сительно слабой температурной зависимостью, то остальные —* резким спадом /я в области 220 4- 300 К. Это резкое уменьшение упругой доли РРМИ связано с возрастанием роли внутриглобулярной подвижности. Эта подвижность может быть понята, как и в случае движения ато­ ма железа, на основе возникновения конформационных подсостояний, которые присущи биополимерам, обладающим вторичной и третичной структурой и образованным слабыми водородными и ваццерваальсовыми связями. Внутренняя усредненная динамика молекулы миоглобина

Рис. 14.22. Температурная зависимость / л для разных образцов миоглобина: 1 — лиофилизованный Mb, P /P s = 0,37; 2 — кристаллический MetMb; 3 — лиофилизованный Mb, P /P s = 0,94; 4 — 26,6-процентный раствор Mb. Сплошные и пунктирные линии — результаты расчета

может характеризоваться как движением отдельных групп атомов бо­ ковой последовательности аминокислот, образующих вторичную струк­ туру, так и движением отдельных фрагментов, включающих а-спи- раль и образующих третичную структуру. Здесь, как и в случае движения атома железа, непри­ менимы обычные для физики твердого тела модели движения (кроме лиофилизованного мио­ глобина). Применение моделей движения фрагмента в квази­ жидкости с большой вязкостью или броуновского осциллятора с сильным затуханием позволя­ ет вычислить величины /д в хо­ рошем согласии с эксперимен­

имеют различный характер температурной зависимости и отличаются по абсолютной величине как при 90 К, так и при 300 К. Ниже 220 К ди­ намика миоглобина характеризуется обычными твердотельными колеба­ ниями с частотами 1012 Ч- 1013 с-1 и при 90 К величина (s2)R = 0,01 А2 относительно невелика, (ж 2) Рд А = 0,038 А2.

Вто же время при комнатной температуре (x2)R = 0,22 А2, а (ж 2) Рд \ = 0,15 А2.

Различия в (ж2) в области высоких температур (300 К) связаны с невозможностью для РДА дать точные значения (ж2) , характеризующие упруго рассеянное гамма-излучение, так как РДА из-за низкого энергети­ ческого разрешения дает данные, неотделимые от теплового диффузного рассеяния. При наличии большого числа брэгговских максимумов в бел­ ках (их разделение составляет около 30 минут) и больших межплоскостных расстояний все рефлексы смещены в область малых углов и практически неотделимы от диффузного фона, связанного с неупругими процессами, в частности, с однофононными процессами. В этой связи интенсив­

эффективно заниженной и становится меньше (x2)R.

Происхождение отличий (ж2)РДА и (x2)R при 90 К и их температур­ ных зависимостей связано с влиянием конформационных подсостояний. По данным МС и РРМИ конформационные движения возникают при температурах выше 220 К, т. е. имеет место что-то вроде фазового пере­ хода, однако они могут существовать и при более низких температурах. Это доказывает тот факт, что (ж2)РДА > (ж2)л при температурах ниже 200 К. Однако конформационные движения фрагментов белка, лежащие в низкочастотной области, при понижении температуры, естественно, за­ медляются, и их частоты движения могут стать меньше 107 с” 1. Поскольку МС и РРМИ чувствительны к частотам выше 107 с " 1, температурные за­ висимости (ж2)Ре и (X2)R ниже излома соответствуют обычным атомным колебаниям. В опытах по динамическому рассеянию рентгеновских лучей с характеристическим временем 10“ 15 с регистрируются и усредняются с равным весом все перемещения, происходящие за время экспозиции 104 т 105 с с любыми частотами, в частности меньшими, чем 107 с” 1. Таким образом, (ж2)РДА становится больше (ж2)л, несмотря на тепловое диффузное рассеяние, вклад которого убывает с понижением температуры.

Сравнивая (x2)R и (ж2)Ре необходимо отметить, что (ж2)Ре значитель­ но меньше средней величины (x2)R по всей глобуле, что соответствует ограниченной подвижности атома Fe в этом районе по данным РДА. Однако характер температурных зависимостей этих величин подобен, что свидетельствует о влиянии конформационной подвижности белка на дви­ жение атома железа в геме и гема как целого. На рис. 14.24 представлена карта динамичеких областей миоглобина, полученная с помощью трех перечисленных методов, в которой твердотельная область миоглобина

Динамика белка связана с его функциональными свойствами. Как уже отмечалось, Mb и НЬ способны обратимо связывать кислород, присоеди­

а-спирали, фрагментов глобулы, что и обеспечивает в конечном итоге благоприятные условия для проникновения лиганда из субстрата (клетки) внутрь глобулы и обратно. Такая конформационная подвижность наблю­ далась с помощью кинетических опытов [23] присоединения молекул О2 и СО к атому железа в геме после их удаления с помощью флеш-фотолиза. Была определена энергия активации проникновения этих молекул через канал миоглобина в область гемового кармана и обнаружен диффузион­ ный характер такого проникновения. Величина энергии активации такой диффузии составила Е а = 6 ккал/моль, что согласуется с данными РРМИ. Кроме того, наблюдалось сильное влияние вязкости окружающей глобулу среды на скорость проникновения лиганда и тем самым на динамику глобулы. Вязкость среды и состояние белка также влияют на внутриглобулярную подвижность, по данным МС и РРМИ. Таким образом, путем изменения динамики белка можно воздействовать на функциональную активность белка.

Следующий пример исследования молекулярной активности целе­ сообразно привести для наиболее крупного биополимера ДНК. Как уже отмечалось, ДНК представляет собой биополимер с очень большой моле­ кулярной массой ( 106 -г 107), имеющий структурную организацию в виде двойной спирали, отдельные части которой соединены азотистыми осно­ ваниями. Внутримолекулярная подвижность ДНК наряду с динамикой белков представляет собой один из важнейших факторов, обеспечиваю­ щих ее функциональную активность. Ниже приводятся данные РРМИ по исследованию ДНК из селезенки крупного рогатого скота при различ­ ных значения степени гидратации и температуры.

На рис. 14.25 представлены температурные зависимости Д для трех значений степени гидратации: h = 0,05; 0,61; 1,2 г Н20 /г ДНК.

Рис. 14.25. Температурные зависимости Д для ДНК при различных степенях гидра­ тации: Л = 0,05 (1); 0,61 (2); 1,2 (3). Сплошные и пунктирные линии — результаты модельных расчетов

Температурная зависимость Д для сухого образца ДНК линейна, что характерно для твердого тела выше температуры Дебая. Для увлажненных образцов ДНК наблюдается аналогичное белкам уменьшение Д выше 220 К.

Как и для белков, резкое падение Д выше 220 К и отсутствие заметного уширения узкой компоненты спектра РРМИ при этих темпера­ турах не может быть объяснено в рамках обычных твердотельных моделей и связывается с внутримолекулярной подвижностью, обусловленной воз­ буждением конформационных подсостояний ДНК. Как и для белков, внутримолекулярное движение может быть смоделировано в рамках мо­ дели броуновского осциллятора с сильным затуханием или ограниченной диффузии. В качестве фрагмента двойной спирали ДНК, участвующего в диффузионном движении, можно рассмотреть, например, один или не­ сколько нуклеотидов, азотистые основания, остатки сахаров. На рис. 14.25

движения); Q = 4Trsin0/A, 20 — угол рассеяния, А — длина волны излучения, Еа = 6,2 ккал/моль (энергия активации); при ft = 1,2 а2 = 2, Еа = 8,75 ккал/моль, характерное время корреляций движения, получен­ ное из уширения линии АГ ~ a2h/rc ~ 10-7 с.

Для ДНК была проведена также серия опытов по влиянию гидратации на динамику ДНК. На рис. 14.26 приведены экспериментальные данные

Д= /(ft) при комнатной температуре. Увеличение гидратации приводит

куменьшению Д и растормаживанию внутримолекулярной подвижности ДНК. Здесь, так же как и для белков, необходим учет влияния воды или другого растворителя на долю упругого РРМИ в ДНК (Днк)*

Рис. 14.26. Гидратационная зависимость Д для ДНК при комнатной температуре: 1 — расчетные данные; 2 — экспериментальные данные

Представляет интерес проверка аддитивности / ДНк и / в (воды) для получения суммарной зависимости Д . Отклонение от аддитивности сви­ детельствует о взаимодействии ДНК с водой, что меняет динамические свойства как самой ДНК, так и воды. На рис. 14.26 приведены также расчетные данные (1) согласно выражению [22]

при / в = 0 и /днк = 0,88. Значительное расхождение расчетных и экс­ периментальных данных Д свидетельствует о том, что гидратация уве­ личивает подвижность атомов ДНК. Расчеты в предположении Д Ф 0 только увеличивают расхождение с экспериментом. Возникает вопрос, до какой степени гидратации вода изменяет динамику ДНК. Как это следует из рис. 14.26, при ft > 0,9 величина (ж2) (Д ) начинает слабо зависеть от степени гидратации. Таким образом, дальнейшее увеличение содержания воды свыше 20 молекул на нуклеотид лишь незначительно меняет подвижность ДНК. Представляет интерес сравнение изменения подвижности ДНК при ее гидратации с данными белков. На рис. 14.27 сравниваются гидратационные зависимости для ДНК и сывороточного альбумина человека (САЧ).

За исключением первоначального участка при ft < 0,1, который может быть связан с размытием в положениях дифракционных максиму­ мов, эти кривые демонстрируют гораздо большую внутримолекулярную подвижность ДНК по сравнению с САЧ. Конформационный анализ жест­ кости а-спирали белка и двойной спирали ДНК свидетельствует об их одинаковой жесткости на кручение и изгиб, но приводит к большей жесткости а-спирали на растяжение из-за сильного влияния водород­ ных связей в направлении а-спирали. Эта дополнительная подвижность

атомов и фрагментов ДНК вдоль оси двойной спирали является причиной возникновения очень больших ( ® 2 ) R = 1,2А2 при Л= 1,2. Возрастание (X 2) R д л я ДНК может характеризовать сильную анизо­ тропию движения вдоль оси двой­ ной спирали и перпендикуляр­ ной ей. Этот факт должен при­ водить к суммарному увеличению (X 2) R для некогерентного варианта PPMИ. В случае же когерентно­ го варианта подобная анизотропия была найдена для другого биопо­ лимера — полисахарида, который также обладает двойной спиралью.

Далее стоит несколько более подробно остановиться на моделях

конформационного движения в биополимерах, которые могут контроли­ роваться интенсивностью и формой спектров МС и РРМИ:

В отличие от твердого тела или лиофилизованного, сухого состо­ яния, где величины (ж2) не превышают несколько сотых долей А2, гидратированные биополимеры обладают гораздо большими значениями ( # 2) R « lA 2. Смещения на такие расстояния должны происходить та­ ким же образом, как и в других конденсированных фазах (жидкости, твердом теле), — за счет флуктуационного образования полостей, куда за­ тем проникает диффундирующая атомная группа, или за счет прыжковой или непрерывной диффузии [24].

Поскольку в случае неограниченной диффузии быстрое исчезнове­ ние интенсивности спектральной линии должно было бы обусловливать ее резкое уширением, чего не наблюдается в МС и РРМИ спектрах, то такие смещения должны происходить путем ограниченной диффузии в профиле некоторого конформационного потенциала, огибающая которого задает границы диффузии. При этом на величины (ж2) оказывают влияние пере­ ходы между вырожденными и квазивырожденными уровнями энергии — локальными минимумами.

Эти минимумы энергии были обнаружены с помощью изучения кинетики связывания СО и С 0 2 [21,25].

Таким образом, в конформационном потенциале, в профиле кото­ рого происходит диффузия некой группы атомов биополимера, имеются или образуются локальные минимумы, которые можно назвать конформационными подсостояниями. В случае непрерывной диффузии эти ми­ нимумы являются дышащими, т. е. не имеют фиксированных положений

фрагментом. Эти твердотельные ограничения соответствуют крупномас­ штабной (на расстояниях, превышающих 1 А) упорядоченности (кристаллоподобности) биополимера и сохраняют нативную структуру биополи­ мера. МС спектр поглощения в этом случае имеет вид

белка трансферрина, который включает ионы трехвалентного железа

вактивные центры с очень медленной спин-решеточной релаксацией так, что возможно наблюдение магнитной СТС вплоть до комнатной температуры [26].

Трансферрин представляет собой глобулярный белок с молекулярной массой 8 • 104, который выделен из плазмы позвоночных. Трансферрин переносит атомы железа из органов его накопления, например печени,

вкоторой существует накопительный белок ферритин, в органы синтеза железосодержащих белков (миоглобин, гемоглобин, цитохромы). Струк­ тура трансферрина показана на рис. 14.29.

Глобула трансферрина состоит из двух половин: N и С, которые раз­ личаются наличием концевого атома азота или углерода полипептидной цепи. В свою очередь N- и С-половины разделены на два домена щелью,

вкоторой находится атом железа в состоянии Fe3+. Лигандное окружение Fe3+ (pnc. 14.29 б) одинаково для N- и С-половин глобулы трансферрина. Кроме обозначенных лигандов — аминокислот, — в число лигандов вхо­

дит С03 (Со2-) или Н20 (ОН)- . Карбоксианион связывает Fe3+ с белком и препятствует освобождению из щели в процессе переноса атомов железа в организме. Восстановление железа до Fe2+, которое происходит в клет­ ках, ведущих синтез железосодержащих белков, приводит к его освобожде­ нию из трансферрина. Считается, что электронная структура Fe3+ втрансферрине одинакова для N- и С-половин, однако динамическое поведение может отличаться, поскольку N-половина легче связывает и освобождает атом железа и термодинамически менее стабильна, чем С-половина. Это свойство связано, вероятно, с тем, что С-половина обладает дополни­ тельными связями в районе щели, например дисульфидным мостиком. Поэтому следует ожидать более прочной связи Fe3+ с белком (решеткой твердого тела) в С-половине и, как следствие, более быстрой релаксации.

На рис. 14.30,14.31 приведены мессбауэровские спектры, получен­ ные при разных температурах и наложении внешнего магнитного поля Яех = 0,06 Тл и спектры частот релаксации восстановленных из мессбауэровских спектров.

Парамагнитная СТС при низких температура менее 50 К была рас­ считана в приближении спинового гамильтониана для почти точного значения ромбической симметрии кристаллического поля для расщеп­ ления электронных уровней спина Fe3+ D = 0,153 см-1 и отклонения от кубической симметрии А = E /D = 1 / 3 . При таких параметрах элек­ тронные состояния смешиваются с ядерными, однако наложение слабого магнитного поля Я ех = 0,06 Тл, меньшего, чем кристаллическое, но боль­ шего, чем электронно-ядерное взаимодействие, приводит к симметри­ зации СТС и упрощению расчета. Выше температур 50 К включается спин-решеточная релаксация. Расчет мессбауэровских спектров ведется с помощью релаксационного супероператора, определяющего динамику объединенной электронно-ядерной системы, характеризуемой матрицей плотности [26]. В случае, если мессбауэровские спектры формируют­ ся в результате ядерных переходов в пределах отдельных электронных