книги из ГПНТБ / Гласкер, Дж. Анализ кристаллической структуры

Рис. 26. Метод тяжелого атома.

Одно из сечений трехмерной карты электронной плотности структуры, содержащей 73 атома (кроме атомов водорода) в асимметрической единице (витамин Biz), показано для трех стадий анализа кристаллической структуры. При построении пер­ вой карты для определения фаз использовали только атом Со. Для второй карты использовали 26 атомов (один атом Со и 25 атомов С и N), выявленных из пиков первой карты. Фазы третьей карты найдены по положениям всех 73 атомов. Основ­ ные черты карты, построенной для 73 атомов, выявляются грубо, фазы определены только по тяжелому атому, однако имеется большое число пиков, не имеющих ничего общего с реальными положениями атомов. Следует обратить внимание на существен­ ное уменьшение плотности фона по мере приближения к истин­ ным фазовым углам. Поскольку на рисунке приведены сечения трехмерной карты, некоторым атомам, лежащим близко к пло­ скости сечения, однако не точно в ней, соответствуют небольшие пики; если бы сечение проходило через центры этих атомов, то пики были бы значительно больше.

122 Часть II

После того как тяжелый атом локализован, пред­ полагают, что он доминирует в дифракционной кар­

приложение метода тяжелого атома к структуре с некоторой неизвестной молекулой, содержащей один атом кобальта, один атом хлора и около семидесяти атомов углерода, азота и кислорода. Фазы для пер­ вого приближения электронной плотности были най­ дены только по атому кобальта. Для вычисления фазовых углов второй приближенной карты электрон­ ной плотности использовали пики первой карты, ле­ жащие вблизи атома металла и не противоречащие принятой модели геометрии молекулы, а также сам атом металла. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока не была найдена вся структура. В настоящее время метод тяжелого атома является одним из наи­ более эффективных средств анализа структур сред­ ней сложности (молекул с 30—100 атомами).

Один из недостатков этого метода заключается в том, что если атомный номер тяжелого атома на­ столько велик, что этот атом доминирует в вектор­ ном распределении, то он непременно должен доми­ нировать и в рентгеновском рассеянии. Следователь­ но, более легкие атомы независимо от процедуры уточнения не могут быть локализованы с высокой точностью, ибо их вклады в наблюдаемые интенсив­ ности сравнительно малы. Если же структуру необ­ ходимо определить с большей точностью, то надеж­ нее всего использовать «прямые методы», предназна­ ченные для соединений, не содержащих тяжелого атома. Однако во многих случаях интерес представ­ ляет скорее вся молекулярная структура, чем от­ дельные ее детали, т. е. далеко не всегда требуется высокая точность в измерении межатомных расстоя­ ний, валентных углов и т. д. В таких случаях метод тяжелого атома дает, как правило, вполне достаточ­ ную точность.

Метод изоморфного замещения

Если можно получить два или серию изоморфных кристаллов, то метод изоморфного замещения яв­ ляется наилучшим методом прямого определения фа­ зовых углов. Особенно это справедливо для сложных систем, для которых аналитические методы (кратко описанные ниже) недостаточны. То обстоятельство, что изоморфное замещение позволяет определить приближенное значение фазовых углов, очень важно для структурного анализа сложных объектов. Струк­ туры всех белков, расшифрованные к настоящему времени, были решены на основе этого метода.

Изоморфными называют кристаллы с совершенно одинаковыми размерами ячейки и размещением ато­ мов внутри них и различающиеся всего лишь одним или в крайнем случае несколькими атомами. Широко известный ряд изоморфных кристаллов представляют собой квасцы. Калиевые квасцы KA1(S04)2- 12НгО рас­ тут в виде бесцветных октаэдров, тогда как хромовые квасцы KCr(S0 4)2- 12НгО образуют темно-лиловые кристаллы точно такой же формы и структуры. Из­ вестный опыт по изоморфизму заключается в выра­ щивании кристаллов из суспензии хромовых квасцов сначала на свободно висящей нити, а затем в рас­ творе калиевых квасцов. В результате образуется кристалл с темной сердцевиной. В этом кристалле атом Сг в хромовых квасцах занимает то же положе­ ние в элементарной ячейке, что и атом А1 з калие­ вых квасцах.

Однако пары изоморфных кристаллов, содержа­ щих небольшие элементарные ячейки, вообще говоря, найти довольно трудно, поскольку изменение в объе­ ме атома приводит к значительному изменению структуры после замещения. При нахождении изо­ морфной пары даже для соединения с большими элементарными ячейками необходимы терпение и изо­ бретательность. Перутц и Кендрю много лет потра­ тили на поиски изоморфных производных белков ге­ моглобина и миоглобина. Некоторые соли или другие соединения с тяжелыми атомами могут проникнуть в

товлении изоморфной пары, можно при помощи опи­ санных выше приемов локализовать из паттерсоновской карты. Это позволяет вычислить их вклады Ем и Fin'- Если Fm и Fм/ положительны (а они непре­ менно должны иметь одинаковый вклад, поскольку единственное различие между ними заключается в количестве излучения, рассеянного атомом или груп­ пой атомов), то значения F для всего кристалла (Ft ) должны отличаться так же, как отличаются друг от друга Fм и Fm'- Поскольку абсолютные величины из­ меренных значений F известны, а разность, связан­ ную с изменением М, можно вычислить, то можно определить знаки Ft и Ft Чтобы понять принцип этого метода, читателю следует разобрать числовой пример, приведенный в приложении 8. Поскольку при замещении одного иона или группы другими экспери­ ментальные погрешности несколько изменяются, ре­ шения уравнений получаются неточными; кроме того, меняется и остальная часть структуры R.

Для нецентросимметричных структур ситуация резко осложняется вследствие того, что фазовый угол может иметь любое значение от 0 до 360°. Как толь­ ко что было отмечено, даже при работе с центросим­ метричными кристаллами (для которых требуется определить лишь один знак каждого отражения) воз­ никают трудности, связанные с небольшими измене­ ниями в незамещенной части структуры. Белки вслед­ ствие их асимметричности кристаллизуются в нецен­ тросимметричных пространственных группах. При введении в белок тяжелого атома изоморфными можно считать незамещенный белок и производное с тяжелым атомом. В результате введения объеми­ стого тяжелого атома оставшаяся часть структуры может довольно сильно измениться, причем наиболь­ шее изменение придется на ту часть молекулы, кото­ рая находится близко к тяжелому атому. Это обстоя­ тельство является особенно большой помехой в тех случаях, когда тяжелый атом находится в какой-либо важной части белка, например в активной части фер­ ментов. Для определения фазового угла необходимы

(а) Первое производное с тяжелым атомом (Mt)

90°

cCj~257*

«4ъ340°

ctp—340°

Рис. 27. Изоморфное замещение для нецентросимметричной структуры.

кругов, поскольку фазовый угол для этого отражения неизвестен. Предположим, что положения тяжелых атомов Mi и Mi в эле­ ментарной ячейке известны. Тогда нетрудно вычислить вклады этих атомов в структурные факторы производных, справа на рисунке (а) и (б) показаны ам„ ^М, и ам„ Дм.. Далее необхо­ димо найти два концентрических круга на диаграммах, так чтобы радиусы их были | F |р и | F |м,р и | F |р, | F |м 2Р и чтобы соответ­ ствующий вектор Fм попал в нужное положение. Для каждого производного с тяжелым атомом таких положений только два и, следовательно, возможны лишь два фазовых угла. Однако если имеются два или более производных с тяжелым атомом, то, как это видно из рисунка, сравнение результатов для разных произ­ водных позволяет устранить указанную неоднозначность. С дан­ ным отражением для исходного белка согласуется только фазо­ вый угол ~340° (или —20°).

по крайней мере две пары изоморфных соединений (если не используют аномальную дисперсию; см. ни­ же), однако, поскольку в определении фазовых углов могут быть ошибки, значительно надежнее иссле­ довать несколько пар. Этот метод схематически показан на рис. 27. Если из паттерсоновской карты можно найти положение тяжелого атома, то Ем и фазовый угол ам можно вычислить для каждого ди­ фрагированного пучка каждого производного. Для графического определения фазового угла белка (Р) чертят две окружности радиусами |Е |Р и |Е |Мр для каждого производного. Затем определяют два поло­ жения, при которых вектор Ем будет находиться между двумя окружностями, как это показано на рис. 27. Для каждого производного белка с тяжелым атомом (MiP и М2Р) находят два возможных зна­ чения фазового угла; в примере на рис. 27 эти поло­ жения лежат около 343 и 202° (а) и около 340 и 257° (б). Следовательно, фазовый угол свободного белка для данного дифрагированного пучка должен находиться в пределах от —17 до —20° (от 343 до 340°). Процедуру оценки фазового угла необходимо провести для каждого дифрагированного пучка ди­ фракционной картины; обычно в дополнение к сво­ бодному белку исследуют более чем два производных с тяжелыми атомами, в результате чего появляет­ ся возможность сравнения различных пар произ­ водных.

Поскольку работа, необходимая для определения фаз многочисленных рефлексов белка, очень трудо­ емка, практически начинают только с небольшой ча­ сти дифракционной картины, наблюдаемой при малых углах рассеяния. При этих малых углах изоморфизм можно считать достаточно точным, поскольку разно­ сти в положениях, обязанные замещению, не так сильно влияют на малоугловые рефлексы, как на рефлексы при больших углах. Однако это значит, что разрешение на первом этапе очень низкое: на соот­ ветствующей карте электронной плотности невозмож­ но различить никакие детали структуры. Типичный пример появления изменений в данной структуре по

нять, рассматривая разрешение в обыкновенном мик­ роскопе. Если некое излучение рассеивается предме­ том, изучаемым под микроскопом, то оно не соби­ рается в изображение, а попросту исчезает (эта си­ туация показана на рис. 1, стр. 20), и получающееся изображение будет в какой-то степени несовершен­ ным представлением предмета, рассеивающего излу­ чение. В частности, некоторые детали предмета оста­ нутся неразрешенными. Подобно этому, если при ра­ боте с рентгеновскими лучами обычной длины волны дифракционная картина получается только для отно­ сительно малых углов рассеяния, то разрешение вос­ становленного по этой картине изображения будет довольно низким. Более того, даже если наблюдается полная дифракционная картина, то разрешение будет

Рис. 28. Различные стадии разрешения данной структуры. . На рисунке приведены карты электронной плотности, вычис­ ленные с исключением всех наблюдаемых | F |, соответствующих углам, большим некоторого заданного значения 20. Обычно по­ лученное «разрешение» выражается в терминах межплоскостных

трудоемкая. Наибольшую степень разрешения для структур белка удается получить между стадиями (2) и (3). Детали, приведен­ ные на диаграмме (4), появляются при определении структуры хороших кристаллов низкомолекулярных соединений с исполь­ зованием излучения, испускаемого рентгеновской трубкой с-мед­

ограничено выбранной длиной волны излучения. Как и в любом процессе воссоздания изображения путем рекомбинации рассеянного излучения, никакой прием не позволит различить детали, существенно меньшие длины волны использованного излучения. С другой стороны, положения хорошо разрешенных предметов

.известной формы можно измерить с высокой точно­ стью, а все межатомные расстояния хорошо разре­ шаются, если используют обычные рентгеновские лучи. Следовательно, положения разрешенных ато­ мов. и некоторые детали геометрии молекулы можно вычислить с большой точностью.

Выводы

Паттерсоновская карта. Карта, вычисленная с ис­ пользованием амплитуд |К |2 и без какой-либо фазо­ вой информации, дает векторное представление атом­ ного содержимого элементарной ячейки

P-(UVW) = y - SS2 | F \2cos2n(hU + kV + Ш).

по всем hkl

Пики на этой карте возникают в точках, расстояние которых от начала координат соответствует по вели­ чине и направлению расстояниям между атомами в кристалле. В идеале эту карту можно интерпретиро­ вать в терминах размещения атомов. Практически это возможно лишь в тех случаях, когда в структуре имеется сравнительно немного атомов или некоторые атомы имеют очень большие атомные номера.

Метод тяжелого атома. Если в структуре имеется один или несколько атомов с высоким атомным номе­ ром, то они будут доминировать в рассеянии. Эти атомы можно локализовать при помощи паттерсоновских карт, а затем можно вычислить приближенные фазы всей структуры. В получающейся при этом кар­ те электронной плотности обычно проявляется осталь­ ная часть структуры.

Метод изоморфного замещения. В настоящее вре­ мя этот метод является лучшим методом прямого оп­