- •Передмова
- •Правила роботи в клініко-діагностичній лабораторії
- •Правила роботи в клініко-діагностичній лабораторії
- •Розділ 1 інструментальні методи аналізу в медицині
- •Розділ 2 правила роботи з приладами
- •2.1. Фотоелектроколориметри
- •2.1.2. Колориметр фотоелектричний концентраційний кфк-2мп
- •2.1.4. Фотометр аналітичний медичний мефан-8001
- •2.2. Правила проведення фотометрії та розрахунок результатів досліджень
- •2.3. Поляриметр
- •2.4. Рефрактометр ирф–22
- •2.5. Прилади для потенціометричного аналізу
- •2.5.2. Універсальний йономір эв–74
- •Контрольні питання до розділів 1 – 2
- •Розділ 3 методи вивчення білкового обміну
- •Визначення загального білка в сироватці крові й інших біологічних рідинах
- •Лабораторна робота № 1 Уніфікований метод визначення загального білка в сироватці крові. Біуретова реакція
- •Лабораторна робота № 2 Рефрактометричний метод визначення загального білка в сироватці крові
- •Лабораторна робота № 3 Визначення загального білка в сечі. Проба Гелера
- •Клініко-діагностичне значення визначення загального білка у біологічних рідинах
- •Лабораторна робота № 4 Проби колоїдостійкості білків сироватки крові. Тимолова проба
- •Приклад побудови калібрувального графіка для визначення тимолової проби
- •Клініко-діагностичне значення тимолової проби
- •Лабораторна робота № 5 Визначення білкового спектру сироватки крові методом електрофорезу на папері
- •Приклад розрахунку білкових фракцій у відносних одиницях
- •Приклад розрахунку білкових фракцій в абсолютних одиницях
- •Клініко-діагностичне значення дослідження електрофореграм
- •Приклад опрацювання електрофореграм за допомогою комп'ютера
- •Контрольні питання до розділу 3
- •Розділ 4. Небілкові нітрогенвмісні (Азотисті) сполуки
- •Методи дослідження вмісту сечовини, креатину, креатиніну та сечової кислоти в біологічних рідинах
- •Лабораторна робота № 6 Визначення сечовини в сироватці крові та сечі за кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом
- •Готування робочого реактиву
- •Клініко – діагностичне значення кількісного визначення сечовини у біологічних рідинах
- •Лабораторна робота № 7 Визначення креатиніну в біологічних рідинах за кольоровою реакцією Яффе
- •Б) Хід визначення вмісту креатиніну в добовій сечі
- •Клініко-діагностичне значення дослідження концентрації креатиніну у біоматеріалі
- •Лабораторна робота № 8 Визначення сечової кислоти в сироватці крові за реакцією з фосфорно-вольфрамовим реактивом
- •Лабораторна робота № 9 Кількісне визначення сечової кислоти в сечі
- •Клініко-діагностичне значення дослідження вмісту сечової кислоти у біологічних рідинах
- •Контрольні питання до розділу 4
- •Розділ 5. Ферменти
- •Визначення активності α-амілази в біоматеріалі
- •Лабораторна робота № 10 Визначення активності α–амілази зі стійким крохмальним субстратом. Метод Каравею
- •Лабораторна робота № 12 Визначення активності α-амілази в сироватці крові. Метод Кінга
- •Лабораторна робота № 13 Вплив рН середовища на активність ферментів
- •Лабораторна робота № 14 Вплив активаторів та інгібіторів на активність ферменту α-амілази
- •Лабораторна робота № 15 Вплив температури на активність
- •Готування розведеної слини
- •Клініко-діагностичне значення визначення активності α-амілази у біологічних рідинах
- •Визначення амінотрансфераз у сироватці крові
- •Лабораторна робота № 16 Колориметричний метод визначення активності аспартатамінотрансферази у сироватці крові (за Райтманом – Френкелем)
- •Клініко-діагностичне значення визначення активності амінотрансфераз у сироватці крові
- •Контрольні питання до розділу 5
- •Розділ 6. Методи вивчення вуглеводного обміну
- •Лабораторна робота № 17 Якісне визначення глюкози в біологічних рідинах. Реакція Тромера
- •Лабораторна робота № 18 Визначення глюкози в біологічних рідинах глюкозооксидазним (уніфікованим) методом
- •Лабораторна робота № 19 Кількісне визначення глюкози в сечі за кольоровою реакцією з о-толуїдиновим реактивом
- •Лабораторна робота № 20 Кількісне визначення глюкози в сечі поляриметричним методом
- •Клініко-діагностичне значення визначення глюкози в біологічних рідинах
- •Контрольні питання до розділу 6
- •Розділ 7. Обмін ліпідів
- •Біологічна роль ліпідів
- •Лабораторна робота №21 Якісна реакція на ацетон та ацетоацетатну кислоту
- •Лабораторна робота №22 Якісна реакція на ацетоацетатну кислоту. Реакція Герхарда
- •Лабораторна робота №23 Якісне виявлення ацетону у біологічних рідинах
- •Лабораторна робота №24 Якісна реакція на β-оксимасляну кислоту
- •Клініко-діагностичне значення визначення кетонових тіл у біологічних рідинах
- •Контрольні питання до розділу 7
- •Біохімічні показники для дорослих у нормі
- •Література
- •Безпальченко Віолета Михайлівна
- •Практикум Навчальний посібник для студентів вищих навчальних закладів
Визначення загального білка в сироватці крові й інших біологічних рідинах
Всі відомі засоби визначення концентрації загального білка в сироватці крові та сечі поділяють на такі основні групи.
1. При використанні азотометричних методів виходять із того, що білки містять у середньому 16 % Нітрогену. Отримана при визначенні вмісту білкового Нітрогену величина помножується на коефіцієнт перерахунку.
2. Методи, що базуються на визначенні густини сироватки крові або плазми (метод падаючої краплі) неточні, тому що густина залежить не тільки від вмісту білків, але й інших речовин.
3. При гравіметричному (ваговому) методі білки сироватки крові осаджують, висушують до сталої ваги та зважують. Ці методи трудоємкі і потребують великої кількості сироватки.
4. Рефрактометричний метод визначення концентрації загального білка, який характеризується властивістю середовищ по-різному заломлювати промені світла, також не сучасний, тому що навіть у нормі частина рефракції обумовлюється іншими компонентами сироватки (наприклад, мінеральними речовинами, вуглеводами).
5. З колориметричних методів, які засновані на кольорових реакціях білків з певними реактивами найчастіше застосовується біуретовий метод, який вважається найбільш точним, специфічним і доступним. На біуретову реакцію не впливає присутність у крові ароматичних амінокислот (тирозину, триптофану), фенолів, сечової кислоти. Більш чутливий метод Лоурі має істотні недоліки, які обумовлені малою специфічністю та складністю у приготуванні основних робочих розчинів.
Інші колориметричні, нефелометричні, спектрометричні, поляриметричні методи поки не одержали широкого поширення у клінічній лабораторній практиці.
Лабораторна робота № 1 Уніфікований метод визначення загального білка в сироватці крові. Біуретова реакція
Мета: Дослідити взаємодію білка з лужним розчином купрум (II) сульфату, розрахувати вміст загального білка в досліджуваній сироватці крові.
Теоретична частина
Присутність білка в сироватці крові можна виявити за допомогою ряду кольорових реакцій. Ці реакції властиві складовим частинам білка – амінокислотам або утвореним ними угрупованням. Поліпептиди та білки дають біуретову реакцію, характерну для наявності пептидних зв'язків. Реакція чутлива до температури. Підвищення температури збільшує швидкість розвитку забарвлення, тому аналіз необхідно проводити при сталій температурі (звичайно 17 – 20 0С).
Російський вчений Данилевський О.Я., досліджуючи білки та продукти їх гідролізу (1888 р.), помітив, що вони забарвлюються в синьо-фіолетовий колір при додаванні лужного розчину купрум (ІІ) сульфату. Таке саме забарвлення виникало і при додаванні цього розчину до біурету – сполуки, що утворюється при нагріванні сечовини внаслідок відщеплення амоніаку:
2H2N–CO–NH2 → NH3 + NH2–CO–NH–CO–NH2
сечовина амоніак біурет
Данилевський О.Я. вперше висловив припущення, що зв'язок –NH–CO– є з'єднання амінокислот у білковій молекулі. Німецький вчений Фішер Е. у 1902 р. висунув поліпептидну теорію будови білків, у якій довів наявність зв'язку –NH–CO– між амінокислотами, і назвав цей зв'язок пептидним.
Принцип методу: Білки реагують у лужному середовищі з купрум (II) сульфатом і утворюють сполуки, які забарвлені у фіолетовий колір. Інтенсивність забарвлення пропорційна вмісту білків у досліджуваному матеріалі.
Прилади та матеріали: колориметр фотоелектричний концентраційний КФК-2МП, біуретовий реактив; стандартний розчин альбуміну (із людської або бичачої сироватки), досліджувана сироватка крові.
Готування розчинів
1. Розчин з масовою часткою калій йодиду 0,5 % у розчині з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л: до 400 мл розчину з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л додають 2 г кристалічного калій йодиду.
2. Біуретовий реактив. 4,5 г сегнетової солі (калій-натрій виннокислий 4-водний) розчиняють у 40 мл розчину з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л. Потім додають 1,5 г купрум (ІІ) сульфату 5-водного (CuSO4·5H2O) і 0,5 г калій йодиду. Об'єм доводять до 100 мл розчином з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л. Зберігають у судині з темного скла. Реактив стійкий.
3. Робочий розчин біуретового реактиву. 20 мл біуретового реактиву змішують із 80 мл розчину з масовою часткою калій йодиду 0,5 % у розчині з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л (відношення 1:4). Розчин стійкий.
4. Стандартний розчин білка – розчин альбуміну (60 г/л).
5. Розчин з масовою часткою натрій хлориду 0,9 % (NaCl): зважують 0,90 г NaCl (х.ч.) і кількісно переносять у мірну колбу на 100 мл, об'єм доводять дистильованою водою до мітки.
а) Хід визначення за стандартним розчином
Готують досліджувані, контрольний та стандартний розчини відповідно таблиці 1.
Таблиця 1
Склад робочих розчинів
Реагенти, мл |
Проба 1 |
Проба 2 |
Контроль |
Стандарт |
Робочий розчин біуретового реактиву |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
Сироватка крові |
0,1 |
0,1 |
– |
– |
0,9 % розчин NaCl |
– |
– |
0,1 |
– |
Стандартний розчин альбуміну |
– |
– |
– |
0,1 |
Обережно перемішують, уникаючи появи піни. Витримують 30 хвилин (але не більше 1 години) при кімнатній температурі, потім фотометрують стандартний та досліджувані розчини у кюветі з товщиною шару 10 мм за довжини хвилі 540–560 нм (зелений світлофільтр) проти контрольного розчину (розд. 2.1.2, 2.2).
Розрахунок загальної кількості білка в сироватці крові виконують за формулою:
,
де: Едосл. – екстинкція досліджуваної проби; Ест. – екстинкція стандартного розчину; Сст. – концентрація білка в стандартному розчині (60 г/л).
Порівнюючи отримані дані з нормою, роблять клініко- діагностичний висновок (стор. 43).
б) Хід визначення за калібрувальним графіком
1. Готують контрольний та досліджувані розчини, користуючись таблицею 1. Обережно перемішують, уникаючи появи піни. Витримують 30 хвилин (але не більше 1 години) при кімнатній температурі, потім фотометрують досліджувані розчини у кюветі з товщиною шару 10 мм за довжини хвилі 540–560 нм (зелений світлофільтр) проти контрольного розчину (розд. 2.1.2, 2.2).
2. Будують калібрувальний графік.
Із стандартного розчину білка і робочого розчину біуретового реактиву готують калібрувальні розчини, як вказано у таблиці 2.
Таблиця 2
Склад робочих калібрувальних розчинів
№ з/п |
Стандартний розчин білка, мл |
Робочий розчин біуретового реактиву, мл |
Концентрація білка, г/л |
1 |
0,20 |
4,90 |
120 |
2 |
0,15 |
4,95 |
90 |
3 |
0,10 |
5,00 |
60 |
4 |
0,05 |
5,05 |
30 |
Через 30 – 60 хвилин фотометрують калібрувальні розчини проти контрольного розчину аналогічно досліджуваним. За отриманими даними будують калібрувальний графік залежності екстинкції від концентрації білка.
3. Розрахунки.
За калібрувальним графіком, використовуючи значення екстинкції досліджуваних розчинів, знаходять відповідне їм значення концентрації білка.
Порівнюючи отримані дані з нормою, роблять клініко- діагностичний висновок (стор. 43).
Норма вмісту загального білка в сироватці крові здорової людини коливається в межах: 65 – 85 г/л.