- •Передмова
- •Правила роботи в клініко-діагностичній лабораторії
- •Правила роботи в клініко-діагностичній лабораторії
- •Розділ 1 інструментальні методи аналізу в медицині
- •Розділ 2 правила роботи з приладами
- •2.1. Фотоелектроколориметри
- •2.1.2. Колориметр фотоелектричний концентраційний кфк-2мп
- •2.1.4. Фотометр аналітичний медичний мефан-8001
- •2.2. Правила проведення фотометрії та розрахунок результатів досліджень
- •2.3. Поляриметр
- •2.4. Рефрактометр ирф–22
- •2.5. Прилади для потенціометричного аналізу
- •2.5.2. Універсальний йономір эв–74
- •Контрольні питання до розділів 1 – 2
- •Розділ 3 методи вивчення білкового обміну
- •Визначення загального білка в сироватці крові й інших біологічних рідинах
- •Лабораторна робота № 1 Уніфікований метод визначення загального білка в сироватці крові. Біуретова реакція
- •Лабораторна робота № 2 Рефрактометричний метод визначення загального білка в сироватці крові
- •Лабораторна робота № 3 Визначення загального білка в сечі. Проба Гелера
- •Клініко-діагностичне значення визначення загального білка у біологічних рідинах
- •Лабораторна робота № 4 Проби колоїдостійкості білків сироватки крові. Тимолова проба
- •Приклад побудови калібрувального графіка для визначення тимолової проби
- •Клініко-діагностичне значення тимолової проби
- •Лабораторна робота № 5 Визначення білкового спектру сироватки крові методом електрофорезу на папері
- •Приклад розрахунку білкових фракцій у відносних одиницях
- •Приклад розрахунку білкових фракцій в абсолютних одиницях
- •Клініко-діагностичне значення дослідження електрофореграм
- •Приклад опрацювання електрофореграм за допомогою комп'ютера
- •Контрольні питання до розділу 3
- •Розділ 4. Небілкові нітрогенвмісні (Азотисті) сполуки
- •Методи дослідження вмісту сечовини, креатину, креатиніну та сечової кислоти в біологічних рідинах
- •Лабораторна робота № 6 Визначення сечовини в сироватці крові та сечі за кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом
- •Готування робочого реактиву
- •Клініко – діагностичне значення кількісного визначення сечовини у біологічних рідинах
- •Лабораторна робота № 7 Визначення креатиніну в біологічних рідинах за кольоровою реакцією Яффе
- •Б) Хід визначення вмісту креатиніну в добовій сечі
- •Клініко-діагностичне значення дослідження концентрації креатиніну у біоматеріалі
- •Лабораторна робота № 8 Визначення сечової кислоти в сироватці крові за реакцією з фосфорно-вольфрамовим реактивом
- •Лабораторна робота № 9 Кількісне визначення сечової кислоти в сечі
- •Клініко-діагностичне значення дослідження вмісту сечової кислоти у біологічних рідинах
- •Контрольні питання до розділу 4
- •Розділ 5. Ферменти
- •Визначення активності α-амілази в біоматеріалі
- •Лабораторна робота № 10 Визначення активності α–амілази зі стійким крохмальним субстратом. Метод Каравею
- •Лабораторна робота № 12 Визначення активності α-амілази в сироватці крові. Метод Кінга
- •Лабораторна робота № 13 Вплив рН середовища на активність ферментів
- •Лабораторна робота № 14 Вплив активаторів та інгібіторів на активність ферменту α-амілази
- •Лабораторна робота № 15 Вплив температури на активність
- •Готування розведеної слини
- •Клініко-діагностичне значення визначення активності α-амілази у біологічних рідинах
- •Визначення амінотрансфераз у сироватці крові
- •Лабораторна робота № 16 Колориметричний метод визначення активності аспартатамінотрансферази у сироватці крові (за Райтманом – Френкелем)
- •Клініко-діагностичне значення визначення активності амінотрансфераз у сироватці крові
- •Контрольні питання до розділу 5
- •Розділ 6. Методи вивчення вуглеводного обміну
- •Лабораторна робота № 17 Якісне визначення глюкози в біологічних рідинах. Реакція Тромера
- •Лабораторна робота № 18 Визначення глюкози в біологічних рідинах глюкозооксидазним (уніфікованим) методом
- •Лабораторна робота № 19 Кількісне визначення глюкози в сечі за кольоровою реакцією з о-толуїдиновим реактивом
- •Лабораторна робота № 20 Кількісне визначення глюкози в сечі поляриметричним методом
- •Клініко-діагностичне значення визначення глюкози в біологічних рідинах
- •Контрольні питання до розділу 6
- •Розділ 7. Обмін ліпідів
- •Біологічна роль ліпідів
- •Лабораторна робота №21 Якісна реакція на ацетон та ацетоацетатну кислоту
- •Лабораторна робота №22 Якісна реакція на ацетоацетатну кислоту. Реакція Герхарда
- •Лабораторна робота №23 Якісне виявлення ацетону у біологічних рідинах
- •Лабораторна робота №24 Якісна реакція на β-оксимасляну кислоту
- •Клініко-діагностичне значення визначення кетонових тіл у біологічних рідинах
- •Контрольні питання до розділу 7
- •Біохімічні показники для дорослих у нормі
- •Література
- •Безпальченко Віолета Михайлівна
- •Практикум Навчальний посібник для студентів вищих навчальних закладів
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
ХЕРСОНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
В.М. Безпальченко
КЛІНІЧНА БІОХІМІЯ
Практикум
Навчальний посібник для студентів
вищих навчальних закладів
Рекомендовано
Міністерством освіти і науки України
Херсон – 2003
ББК 53.4
Б-39
УДК 577.1: 616-073.524
В.М. Безпальченко.
Б-39 Клінічна біохімія. Практикум. Навчальний посібник для студентів вищих навчальних закладів/ В.М. Безпальченко. – Херсон: ХДТУ, 2003. – 124 с.; іл.11.
ISBN 7763-1140-3
Практикум є складовою частиною навчального комплексу з курсу "Клінічна біохімія". Перші два розділи присвячені теоретичним основам та апаратурному забезпеченню інструментальних методів аналізу в медицині. В наступних розділах з урахуванням досягнень сучасної біохімії викладено лабораторні методи якісного та кількісного дослідження білків, ферментів, нітрогенвмісних речовин, вуглеводів і ліпідів. Більшість методик уніфікована. Дається діагностична оцінка певних біохімічних компонентів у ряді патологічних станах.
Рекомендовано для студентів вищих навчальних закладів, які вивчають дисципліну "Клінічна біохімія".
Рецензенти:
Новіков О.О. – професор, доктор хімічних наук, проректор Херсонського державного технічного університету, завідувач кафедри біомедичної електроніки.
Яковлева С.Д. – кандидат медичних наук, завідувач кафедри дефектології Херсонського державного педагогічного університету.
Землянкін О.О. – кандидат медичних наук, завідувач хірургічним відділенням клінічної лікарні Суворовського району м. Херсона.
Шепель А.Ю. – кандидат хімічних наук, доцент кафедри хімії Херсонського державного педагогічного університету.
Затверджено та рекомендовано до друку на засіданні кафедри фізичної та неорганічної хімії Херсонського державного технічного університету (протокол № 3 від 10 жовтня 2002 р.)
Рекомендовано Міністерством освіти і науки України як навчальний посібник для студентів вищих навчальних закладів.
Лист № 14/18.2-2348 від 10.12.2002.
ISBN 7763-1140-3 ББК 53.4
Безпальченко В.М., 2003
© ХДТУ, 2003
Передмова
Практикум є складовою частиною навчального комплексу з курсу "Клінічна біохімія". Він містить методичні вказівки до проведення лабораторних занять студентами.
Основна мета цього практикуму – закріплення теоретичних знань шляхом формування практичних навичок у галузях динамічної та функціональної біохімії.
До практикуму ввійшли типові лабораторні роботи з наступних розділів біохімії: білки, ферменти, вуглеводи, ліпіди. Розкриваються загальні методи дослідження цих класів органічних речовин та їх метаболітів. Приведені якісні реакції та запропоновані методи кількісного інструментального аналізу, в основному уніфіковані. Зазначені правила роботи з апаратурою для фотометричного, поляриметричного, рефрактометричного, потенціометричного аналізу.
У лабораторних роботах викладено принципи методу, наведені структурні формули та реакції речовин, які взаємодіють, перелік основних матеріалів, реактивів і обладнання, докладний опис ходу роботи й очікуваних результатів. Така побудова дозволяє проводити визначення без додаткових вказівок, що має важливе значення для підготовки студентів до самостійного виконання наукових робіт.
Практикум містить матеріал про клінічну значимість досліджуваних компонентів у біологічних рідинах. Під час виконання запропонованих робіт студенти не тільки опановують сучасні методи експериментальних досліджень, але й набувають уміння аналізувати одержані результати шляхом постановки приблизного діагнозу.
Правила роботи в клініко-діагностичній лабораторії
До роботи в клініко-діагностичній лабораторії (КДЛ) допускаються особи, що володіють спеціальними знаннями та пройшли відповідний інструктаж з техніки безпеки.
Правила роботи в клініко-діагностичній лабораторії
-
Підготувати матеріали (хімічні та біологічні), інструмент, тару, прилади та ін.
-
Перед роботою в КДЛ вдягти засоби індивідуального захисту (халати, гумові рукавички, маски).
-
При відбиранні проб біологічних матеріалів обов'язково користуватися гумовою грушею або автоматичними піпетками з одноразовими наконечниками.
-
У випадку забруднення рук біологічними рідинами необхідно негайно промити їх теплою водою та обробити антисептиком (6 % розчином Гідроген пероксиду Н2О2).
-
Роботу з концентрованими кислотами та лугами проводити тільки у витяжній шафі. У випадку потрапляння концентрованих кислот або лугів на поверхню шкіри негайно промити уражене місце проточною водою і провести обробку речовинами, що знаходяться в аптечці (відповідно, слабким розчином соди або оцтової кислоти).
-
У КДЛ суворо забороняється приймати їжу та курити.
Розділ 1 інструментальні методи аналізу в медицині
Під інструментальними (фізико-хімічними) розуміють такі методи аналізу, що дозволяють вивчати хімічні, фізичні та фізико-хімічні властивості біологічного матеріалу. Під час роботи в КДЛ частіше використовують оптичні методи аналізу і значно рідше – електрохімічні, електрофоретичні, хроматографічні та кінетичні.
До оптичних методів аналізу відносять: фотометрію, рефрактометрію та поляриметрію.
Фотометрія. До фотометричних відносяться методи аналізу, які засновані на поглинанні або випромінюванні видимого світла розчинами або твердими прозорими тілами (рис. 1).
Рис. 1. Класифікація фотометричних методів аналізу
Абсорбційна фотометрія – метод аналізу, який заснований на вимірі ступеня послаблення монохроматичного світлового потоку внаслідок вибіркового поглинання світла розчиненою речовиною. Теоретичним обґрунтуванням фотометрії є закон Бугера-Ламберта-Бера:
,
де та – відповідно вхідний та вихідний світлові потоки, – коефіцієнт поглинання (залежить від природи речовини і температури), – товщина шару розчину, C – концентрація речовини.
– оптична густина розчину або екстинкція.
Залежність екстинкції від концентрації відповідно до закону лінійна і проходить через початок координат. Нахил прямої буде залежати від молярного коефіцієнту поглинання, де .
До методів абсорбційної фотометрії належать: спектрофотометрія та нефелометрія. При спектрофотометрії порівнюють інтенсивність забарвлення еталонного розчину та розчину, що аналізується. Виконують колориметрування за допомогою фотоелектроколориметрів (ФЕК) і спектрофотометрів. Нефелометрія – метод аналізу, який пов'язаний з оцінкою ступеня помутніння досліджуваного розчину. При власне нефелометрії джерело і приймач світла у фотометрі розташовані взаємно перпендикулярно. Таким чином, вимірюється розсіяне світло. При турбідиметрії джерело і приймач світла знаходяться на одній осі, тому вимірюється послаблення світлового потоку, що пройшов крізь мутний (колоїдний) розчин.
Емісійна фотометрія базується на вимірі енергії, що випромінюється речовиною внаслідок енергетично збудженого стану. До методів емісійної фотометрії відносять флюориметрію, яка заснована на ефекті енергетичного збудження молекул і атомів досліджуваної речовини, як наслідок впливу жорсткого ультрафіолетового випромінювання, і полум'яну фотометрію, яка заснована на ефекті енергетичного збудження полум'ям структурних складових досліджуваної речовини. Звичайно для флюорометричних вимірів застосовують концентрації речовин 10–4 – 10–6 г/мл (залежність інтенсивності від концентрації прямолінійна). Якщо в якості розчину порівняння застосовується стандартний розчин речовини (спосіб порівняння або калібрувального графіку), то концентрацію досліджуваного розчину (Сх) розраховують за формулою:
,
де – показання флуорометру для досліджуваного розчину; – показання флуорометру для стандартного розчину; – показання флуорометру для контрольного розчину; – концентрація стандартного розчину.
Рефрактометрія – метод визначення концентрації речовини шляхом виміру показника заломлення проміню світла, що проходить крізь розчин (). Величина показника залежить від природи речовини, її концентрації, довжини хвилі світла, що падає, температури та тиску. Звичайно виміри при визначенні концентрації речовини проводяться при 20 0С і тиску 760 мм рт. ст. за допомогою приладів – рефрактометрів. У клінічних лабораторіях частіше використовують рефрактометри типу УРЛ, РЛ–2, які розраховані на безпосереднє визначення сахарози чи білків у водних розчинах.
Поляриметрія – метод аналізу, заснований на вимірі кута обертання площини поляризації оптично-активними прозорими розчинами чи однорідними рідинами, який дозволяє кількісно визначати в біологічних рідинах вуглеводи.
Серед електрохімічних методів аналізу в КДЛ застосовують потенціометричний метод, а саме рН-метрію.
Потенциометричний метод заснований на залежності потенціалу електрода від концентрації, що визначається. Потенціал визначається за формулою:
= 0+ ,
де електродний потенціал в умовах досліду, В; 0стандартний електродний потенціал, В; Rуніверсальна газова стала, Дж/(моль∙К); Fстала Фарадея, Кл/моль; Табсолютна температура, К; zчисло електронів, що беруть участь у елементарному акті електрохімічної реакції;–активність (концентрація) визначаємої речовини чи йона.
При визначенні аніонів, катионів і активних нейтральних молекул використовують різноманітні типи електродів. Електрод, який чутливий до даного виду іонів, чи речовини називається індикаторним. Він завжди використовується в парі з електродом порівняння (каломельним або хлоридсрібним). Можливо безпосереднє визначення концентрації електрохімічно-активної речовини по електродному потенціалу. Для цього будують калібрувальний графік залежності від lgс, що частіше усього має лінійний характер. За допомогою графіка по визначеному значенню знаходять концентрацію невідомого розчину. рН-метрія – метод аналізу, який базується на залежності потенціалу індикаторного (скляного) електроду від концентрації йонів Гідрогену (Н+), що визначають у розчинах. рН – водневий показник, що застосовується для визначення реакції середовища (кислої, лужної або нейтральної). рН розраховується за формулою:
рН = –lg С (Н+), де С – концентрація йонів Гідрогену.
Визначення рН середовища має важливе практичне значення: 1) як один із показників гомеостазу – сталості внутрішнього середовища організму; 2) при виконанні біохімічного аналізу ряду компонентів живого організму, наприклад, ферментів, біологічна активність яких безпосередньо залежить від величини рН. Як прилади для потенціометричного аналізу застосовують рН-метри та йономіри.